基于猴痘病毒A27L蛋白的間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立

朱俊達(dá)，王 爽，任書凝，張子卉，李雅睿，劉國瑞，吳文學(xué)，王永強(qiáng)，彭 辰

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀，100193)

猴痘(Monkeypox)是由屬于痘病毒科(Poxviridae)正痘病毒屬的猴痘病毒(Monkeypox virus,MPXV)引起的人獸共患傳染病[1]。1958年，MPXV在丹麥哥本哈根的實(shí)驗(yàn)用恒河猴中首次發(fā)現(xiàn)[2]，因此被命名為猴痘病毒。然而，MPXV的自然宿主不明，推測(cè)可能是野生嚙齒類動(dòng)物和其他小型哺乳動(dòng)物[3]。正痘病毒屬病毒還包括天花病毒(Variola virus，VARV)、痘苗病毒(Vaccinia virus,VACV)等，人感染猴痘的癥狀與天花極為相似，但病死率較低[1，4]。20世紀(jì)70年代，人群中散發(fā)性MPXV病例在幾個(gè)非洲國家首次發(fā)現(xiàn)[5-6]，在過去20年間該病毒在非洲大陸逐漸流行，猴痘感染人的病例頻繁報(bào)道[7-8]，2003 年在非洲以外的國家美國首次發(fā)現(xiàn)猴痘病例[9]。自2022年5月以來，全球MPXV病例突然呈現(xiàn)急劇增加的趨勢(shì)，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)因此宣布猴痘暴發(fā)為全球衛(wèi)生緊急事件，并將猴痘的全球公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估為“中度風(fēng)險(xiǎn)”[10]。因天花疫苗可對(duì)猴痘病毒產(chǎn)生交叉免疫力，此次猴痘疫情暴發(fā)的主要原因可能是停止接種天花疫苗導(dǎo)致人群免疫力下降[11]。截止目前，本輪猴痘疫情導(dǎo)致的全球感染人數(shù)已經(jīng)超過6萬人，并導(dǎo)致數(shù)十人死亡，感染人數(shù)仍在不斷增加。2022年9月，中國大陸首次報(bào)告人感染猴痘輸入病例，猴痘疫情對(duì)人類公共衛(wèi)生安全已經(jīng)造成嚴(yán)重威脅，因此，對(duì)人群和不同動(dòng)物中MPXV的檢測(cè)和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)刻不容緩。

對(duì)MPXV感染病例的診斷是疫情防控過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需要快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)作為支持。目前，針對(duì)MPXV的檢測(cè)方法大多操作復(fù)雜，成本較高，且往往只針對(duì)一種動(dòng)物，無法滿足MPXV臨床診斷的需要。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、針對(duì)多種不同動(dòng)物體內(nèi)MPXV血清抗體的間接ELISA抗體檢測(cè)方法，對(duì)人群和不同動(dòng)物中MPXV的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查至關(guān)重要。由于MPXV 的分離培養(yǎng)需要生物安全I(xiàn)II級(jí)實(shí)驗(yàn)室，很難直接獲取猴痘感染動(dòng)物血清，通常來說MPXV的血清抗體檢測(cè)方法難以建立并進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究選擇與VACV-WR148蛋白氨基酸序列相似度很高的MPXV-A27L蛋白作為包被抗原，使用VACV陽性血清成功構(gòu)建了MPXV的間接ELISA抗體檢測(cè)方法，并選用可以結(jié)合大多數(shù)哺乳動(dòng)物血清抗體的HRP標(biāo)記Protein A/G作為酶標(biāo)二抗，建立的MPXV間接ELISA檢測(cè)方法具有良好的適應(yīng)性，為MPXV的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了材料和技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 主要材料 pET-32a表達(dá)載體和DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；T4 DNA連接酶、內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ，均購自NEB；Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；鎳瓊脂糖填料，購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；HRP標(biāo)記Protein A/G，購自賽默飛世爾科技公司；VACV、山羊痘病毒(Goatpox virus,GTPV)、綿羊痘病毒(Sheeppox virus,SPPV)和牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)陽性血清，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 MPXV-A27L的原核表達(dá)與純化

1.3.1 MPXVA27L基因合成與陽性克隆質(zhì)粒構(gòu)建 由于目前人群和動(dòng)物群中流行的MPXV為西非分支，因此從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找并下載MPXV西非分支的代表性毒株MPXV-SIE(GenBank登錄號(hào)：AY741551)的序列，選擇MPXVA27L基因序列并交付生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化和基因合成。使用酶切連接的方法將合成的A27L基因序列連接到pET-32a載體上，構(gòu)建pET-32a-A27L表達(dá)載體。將pET-32a-A27L表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆并測(cè)序，提取測(cè)序正確的陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中。

1.3.2 pET-32a-A27L蛋白小試誘導(dǎo)表達(dá) 取50 μL 菌種原液加入到5 mL含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min 培養(yǎng)8～12 h。將500 μL菌液加入到含5 mL LB培養(yǎng)基的15 mL 離心管中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)0.6。取200 μL菌液作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組，剩余菌液加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度1 mmol/L作為試驗(yàn)組，2個(gè)組繼續(xù)于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h。分別取200 μL誘導(dǎo)或未誘導(dǎo)菌液，12 000 r/min離心1 min收獲沉淀，用50 μL 1× Loading重懸，混勻，100 ℃ 5 min。12 000 r/min離心1 min，取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.3.3 pET-32a-A27L擴(kuò)大培養(yǎng)及蛋白純化 將活化后的甘油菌按1∶100接種于500 mL含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)0.6。加入500 μL IPTG，37 ℃、220 r/min誘導(dǎo)4 h后，收集菌體。加入25 mL PBS重懸菌體并超聲波裂解6 min，裂解時(shí)置于冰上，功率為200～300 W，工作3 s，間隔6 s。10 000 r/min離心10 min，去上清，加入25 mL Washing buffer重懸沉淀并超聲波裂解3 min。重復(fù)上述步驟1次。10 000 r/min離心10 min，加入25 mL Resuspension buffer重懸沉淀并超聲波裂解3 min。10 000 r/min離心10 min，加入20 mL 8 mol/L尿素重懸沉淀，并超聲波裂解1.5 min。10 000 r/min離心10 min，取上清過鎳層析填料，4 ℃搖床50 r/min，11～12 h。分別加入20 mL的20、50 mmol/L和300 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白，透析并復(fù)性目的蛋白，SDS-PAGE電泳分析蛋白的純度和濃度。

1.4 間接ELISA檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化

1.4.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的優(yōu)化 采用方陣滴定法，分別使用免疫/未免疫VACV的兔血清作為陽性/陰性血清，以重組蛋白MPXV-A27L作為包被抗原，將MPXV-A27L用包被緩沖液稀釋，先將抗原稀釋至1.0 μg/mL，再2倍倍比稀釋至0.125 μg/mL，試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)稀釋度，各個(gè)稀釋度分別包被同一個(gè)豎行，每孔100 μL。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，一抗為不同稀釋度的血清，血清稀釋度分別為1∶100、1∶200、1∶400，測(cè)定每個(gè)條件下陰陽性對(duì)照血清的OD450值，HRP標(biāo)記的Protein A/G為二抗，TMB為顯色液，2 mol/L H2SO4溶液為終止液，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定OD450值并比較各組P/N值，確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.4.2 最佳封閉條件的優(yōu)化 采用方陣滴定法，以0.25 μg/mL的MPXV-A27L重組蛋白為包被抗原；以5%脫脂乳、1% BSA或2% BSA為封閉液分別孵育60 min和120 min，VACV陽性血清為一抗，其他反應(yīng)條件同1.4.1，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定OD450值并比較各組P/N值，確定最佳封閉液及封閉時(shí)間。

這種基于經(jīng)驗(yàn)決策路徑下的偵查決策，雖然不能涵蓋偵查決策的全部，卻是偵查決策的大部分路徑，這種經(jīng)驗(yàn)決策路徑?jīng)Q定了偵查決策不可能完全是在絕對(duì)理性的基礎(chǔ)上做出，即偵查決策路徑是有限理性的。

1.4.3 最佳一抗孵育時(shí)間和二抗稀釋度的優(yōu)化 以1.4.1和1.4.2優(yōu)化獲得的最佳條件包被抗原并進(jìn)行封閉。分為3個(gè)組，加入一抗后分別孵育30、45 min和 60 min。以HRP-Protein A/G抗體作為二抗，先用抗體稀釋液將二抗稀釋成1∶5 000，再倍比稀釋至1∶20 000，共設(shè)3個(gè)稀釋度，各稀釋度取100 μL加入酶標(biāo)板中，每個(gè)稀釋度二抗設(shè)3個(gè)重復(fù)，其他反應(yīng)條件同1.4.1。反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定OD450值并比較各組P/N值，確定最佳一抗孵育時(shí)間和二抗稀釋度。

1.4.4 最佳二抗孵育時(shí)間的優(yōu)化 以1.4.1、1.4.2和1.4.3中優(yōu)化獲得的最佳條件進(jìn)行抗原包被、封閉、血清孵育，按照優(yōu)化后的濃度加入二抗后再分成3個(gè)組，分別于37 ℃孵育30、45 min和60 min，每組3個(gè)重復(fù)，其他反應(yīng)條件同1.4.1。反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定OD450值并比較各組P/N值，確定最佳二抗孵育時(shí)間。

1.6 特異性試驗(yàn) 利用本研究建立的間接ELISA方法檢測(cè)GTPV、SPPV和LSDV陽性血清，同時(shí)設(shè)VACV陰性和陽性血清作為對(duì)照，以評(píng)估本研究建立的間接ELISA方法的特異性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別包被3個(gè)批次的MPXV-A27L蛋白，每個(gè)批次內(nèi)設(shè)4個(gè)重復(fù)，隨機(jī)對(duì)6份兔血清進(jìn)行檢測(cè)，分析各批次內(nèi)以及每個(gè)批次間的變異系數(shù)，評(píng)估本方法的重復(fù)性。

1.8 敏感性試驗(yàn) 隨機(jī)選取3份VACV陽性血清，并進(jìn)行1∶102～1∶106的稀釋，其余條件按1.4中確定的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)，分別進(jìn)行ELISA檢測(cè)，分析各稀釋度的OD450值評(píng)估本方法的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 MPXV-A27L與VACV-WR148蛋白相似度比較 對(duì)MPXV-A27L與VACV-WR148蛋白的氨基酸序列相似度進(jìn)行比較，兩者的氨基酸序列相似度達(dá)96.7%(圖1)，考慮到直接獲取猴痘感染動(dòng)物血清的困難性，在使用MPXV-A27L蛋白作為包被抗原時(shí)，可以使用VACV陽性血清建立間接ELISA抗體檢測(cè)方法。

圖1 MPXV-A27L與VACV-WR148氨基酸序列相似度比較

2.2 MPXV-A27L的原核表達(dá)與純化 取菌種原液進(jìn)行鑒定，在誘導(dǎo)后包涵體表達(dá)了分子量大小為110 kDa的蛋白，與預(yù)期結(jié)果基本一致，表明pET-32a-A27L原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功。擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行蛋白純化，8 mol/L尿素溶解沉淀離心取上清為最終收集液，純化后的蛋白條帶與預(yù)期大小一致，表明pET-32a-A27L純化完成(圖2)。

圖2 MPXV-A27L蛋白的SDS-PAGE分析

2.3 間接ELISA檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化

2.3.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的優(yōu)化 MPXV-A27L最佳抗原包被濃度為0.25 μg/mL，最佳血清稀釋度為1∶200，在此條件下P/N值最大，為18.116(表1)。

表1 最佳包被抗原濃度與血清稀釋度的優(yōu)化

2.3.2 最佳封閉條件的優(yōu)化 在3種封閉液以及2個(gè)封閉時(shí)間中，1% BSA為封閉液、封閉1 h效果最佳，此時(shí)P/N值為13.139(表2)。

表2 最佳封閉液及封閉時(shí)間的優(yōu)化

2.3.3 最佳一抗孵育時(shí)間和二抗稀釋度的優(yōu)化 一抗孵育30 min，二抗1∶20 000稀釋時(shí)最佳，此時(shí)P/N值為7.158(表3)。

表3 最佳一抗孵育時(shí)間及二抗稀釋度的優(yōu)化

2.3.4 最佳二抗孵育時(shí)間的優(yōu)化 二抗孵育30 min為最佳，此時(shí)P/N值為6.817(圖3)。

圖3 最佳二抗孵育時(shí)間的優(yōu)化

2.5 特異性試驗(yàn) VACV陽性對(duì)照血清的OD450值的平均值1.284>0.316，VACV陰性對(duì)照血清的OD450值的平均值0.161<0.262；此時(shí)GTPV陽性血清、SPPV陽性血清和LSDV陽性血清的OD450值均<0.262(圖4)。

圖4 間接ELISA檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批次包被的孔板的4次檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)為2.75%～7.45%，3個(gè)批次間的變異系數(shù)為6.55%～9.59%(表4)。說明本ELISA抗體檢測(cè)方法具有良好的批內(nèi)及批間重復(fù)性。

表4 間接ELISA檢測(cè)方法的重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 敏感性試驗(yàn) 3份陽性血清均在1∶105稀釋度時(shí)檢測(cè)結(jié)果為陰性，該方法可檢測(cè)到血清最大稀釋倍數(shù)為1∶104(圖5)，說明本方法具有較好的敏感性。

圖5 間接ELISA檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)

3 討論

猴痘是由MPXV引起的一種人獸共患病，推測(cè)其自然宿主可能是嚙齒動(dòng)物和其他小型哺乳動(dòng)物，可在人群間傳播，2022年以前，猴痘作為一種地方性流行病主要流行于非洲中、西部地區(qū)[3]。2022年5月起，猴痘疫情在全球多個(gè)非猴痘疫情流行地區(qū)暴發(fā)[12]，病例數(shù)迅速增長(zhǎng)，引起全球高度關(guān)注。本次猴痘疫情牽涉國家之廣，病例之多，增長(zhǎng)之快，從未有之。MPXV正以遠(yuǎn)超預(yù)估的速度進(jìn)化[13]，由于人獸共患病病原體在人類中傾向于向更具傳染性的方向進(jìn)化，MPXV基因組與天花病毒又高度相似，研究人員擔(dān)心MPXV基因突變后可對(duì)全球構(gòu)成類似天花一樣的威脅。猴痘疫情對(duì)人類公共衛(wèi)生安全已經(jīng)造成嚴(yán)重威脅，因此，對(duì)人群和動(dòng)物中MPXV的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查刻不容緩。

猴痘主要流行于動(dòng)物中，有至少5種猴類以及其他靈長(zhǎng)類和嚙齒類動(dòng)物可以感染猴痘，其中松鼠是人類MPXV的重要宿主和傳染源之一[14]?；贛PXV感染的臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特征，將其分為剛果盆地分支和西非分支2種不同的病毒分支。目前人群和動(dòng)物群中流行的MPXV為西非分支，代表性毒株為Sierra Leone株(MPXV-SIE)。由于MPXV引起的臨床癥狀與其他痘病毒難以鑒別，根據(jù)臨床表現(xiàn)確診猴痘非常困難，因此作為疫情防控過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)MPXV進(jìn)行診斷需要快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)作為支持，為MPXV的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查等工作提供幫助。

目前，針對(duì)MPXV的檢測(cè)方法主要包括電子顯微鏡檢測(cè)MPXV[15]、MPXV實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)[16-19]、MPXV高通量測(cè)序技術(shù)[20]、MPXV環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[21-22]、MPXV分離培養(yǎng)、MPXV血清抗體檢測(cè)[23]等，但目前的檢測(cè)方法各有其不足之處，無法滿足MPXV臨床診斷的需要。其中電子顯微鏡檢測(cè)MPXV周期較長(zhǎng)且操作復(fù)雜，設(shè)備昂貴；MPXV實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)只能針對(duì)病毒感染過程中的病原核酸進(jìn)行檢測(cè)，無法滿足大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查的需要；MPXV高通量測(cè)序技術(shù)成本較高，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的處理能力要求較高，不適合大規(guī)模檢測(cè)；MPXV環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中易形成氣溶膠，往往導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)；MPXV分離培養(yǎng)需要生物安全I(xiàn)II級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，且對(duì)操作人員要求很高；由于很難直接獲取猴痘感染動(dòng)物血清，MPXV血清抗體檢測(cè)方法難以建立并進(jìn)行評(píng)價(jià)，更無法對(duì)多種不同動(dòng)物體內(nèi)的血清抗體進(jìn)行檢測(cè)。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、針對(duì)多種不同動(dòng)物體內(nèi)MPXV血清抗體的間接ELISA抗體檢測(cè)方法，對(duì)人群和動(dòng)物中MPXV的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查至關(guān)重要。

MPXV病毒顆粒較大，直徑為230～300 nm，呈磚狀或菠蘿果狀。MPXV-A27L蛋白是MPXV的一種重要結(jié)構(gòu)蛋白，也是中和抗體的主要靶點(diǎn)之一，在VACV中存在MPXV-A27L的同源蛋白VACV-WR148。本研究通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MPXV-A27L蛋白與VACV-WR148蛋白的氨基酸序列相似度非常高。由于MPXV相關(guān)研究需要在生物安全I(xiàn)II級(jí)實(shí)驗(yàn)室中開展，ELISA試劑盒的研發(fā)、批量生產(chǎn)和應(yīng)用所需的病原及感染動(dòng)物血清很難獲得，因此本研究創(chuàng)新性地以MPXV-A27L蛋白作為包被抗原，使用VACV陽性血清建立MPXV的間接ELISA抗體檢測(cè)方法。由于MPXV可以感染多種靈長(zhǎng)類和嚙齒類哺乳動(dòng)物[24]，現(xiàn)有的MPXV抗體檢測(cè)試劑盒往往只能針對(duì)一種動(dòng)物的血清開展檢測(cè)，因此為了對(duì)不同動(dòng)物群中MPXV感染情況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，本研究參考正痘病毒屬病毒通用ELISA抗體檢測(cè)方法[25-26]，選用HRP標(biāo)記的Protein A/G作為酶標(biāo)二抗。Protein A/G分別來源于金黃色葡萄球菌和鏈球菌，其可以結(jié)合大多數(shù)哺乳動(dòng)物血清抗體，從而適用于多種哺乳動(dòng)物的血清抗體檢測(cè)，滿足了臨床中對(duì)不同動(dòng)物群中MPXV的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查的要求。

基于以上背景，本研究首先構(gòu)建了MPXV-A27L蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，并以此作為包被抗原，建立了MPXV間接ELISA抗體檢測(cè)方法，并確定了ELISA最佳反應(yīng)條件：抗原包被濃度為0.25 μg/mL；1% BSA封閉1 h；待檢血清1∶200稀釋，37 ℃孵育30 min；酶標(biāo)二抗1∶20 000稀釋，孵育30 min；底物顯色10 min。待檢血清樣品OD450值 > 0.316時(shí)判定為陽性，OD450值<0.262時(shí)判定為陰性，OD450值介于0.262～0.316時(shí)則判定為可疑。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該檢測(cè)方法不與山羊痘病毒屬GTPV、SPPV和LSDV的陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法批內(nèi)變異系數(shù)為2.75%～7.45%，批間變異系數(shù)為6.55%～9.59%，表明本方法重復(fù)性良好；敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法可檢測(cè)到血清最大稀釋度為1∶104。本研究建立的MPXV間接 ELISA 抗體檢測(cè)方法具有良好的特異性、重復(fù)性和敏感性，為MPXV的臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了材料和技術(shù)儲(chǔ)備，對(duì)于猴痘疫情的防控具有重要作用。