碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥性及毒力特征的分子生物學(xué)研究

師志云， 馬 苗， 尹曉麗， 王良方， 侯曉慧， 張玉英， 李 剛， 王 文， 陶 佳，李莎莎， 賈 偉

肺炎克雷伯菌是一種重要的革蘭陰性機(jī)會(huì)致病菌，可引起多種感染性疾病，包括尿路感染、菌血癥、肺炎和肝膿腫等[1-2]。隨著耐多藥（MDR）和高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）菌株的出現(xiàn)，這些臨床菌株在地理上的快速傳播令人擔(dān)憂，對(duì)公眾健康構(gòu)成了緊急威脅[3-5]。最近，碳青霉烯類耐藥高毒力肺炎克雷伯菌（CR-hvKP）感染的報(bào)道越來(lái)越多，在臨床環(huán)境中很容易傳播，導(dǎo)致致命的暴發(fā)，抑或成為一種新的“超級(jí)細(xì)菌”[6-7]。本研究收集臨床分離的CRKP菌株并從中篩選hvKP菌株，應(yīng)用PCR等分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)導(dǎo)致CRKP的耐藥基因及菌株的莢膜血清型、毒力基因，采用多位點(diǎn)序列分型（MLST）和脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）等技術(shù)分析其分子流行病學(xué)特點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2015年1月—2019年12月分離鑒定的臨床標(biāo)本CRKP菌株103株（剔除同一患者同一部位的重復(fù)菌株）。根據(jù)CRE判定標(biāo)準(zhǔn)[8]確定CRKP，即亞胺培南或美羅培南最低抑菌濃度（MIC）≥4 mg/L和/或厄他培南MIC≥2 mg/L或產(chǎn)碳青霉烯酶。本研究質(zhì)控菌株有大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和1706，均購(gòu)自上海漢尼生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與試劑

VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司，藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；Xba I限制性內(nèi)切酶、Premix Taq購(gòu)自日本TaKaRa公司，PFGE DNA Marker由寧夏疾病與預(yù)防控制中心提供；Mycycler PCR儀、CHEF-DR Ⅲ 型脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng)、核酸電泳儀、紫外凝膠成像及分析系統(tǒng)儀均為美國(guó)Bio-Rad公司；所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.3 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)

利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）進(jìn)行菌種鑒定，VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定儀及配套藥敏卡（AST-GN09）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果嚴(yán)格參照2018年版美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[9]判讀?？咕幬颩IC值采用微量肉湯稀釋法復(fù)核。WHONET 5.6軟件統(tǒng)計(jì)分析耐藥率。

1.4 碳青霉烯酶表型檢測(cè)

根據(jù)CLSI M100-S28推薦方法[9]，改良碳青酶烯酶滅活試驗(yàn)（mCIM）聯(lián)合EDTA-改良碳青酶烯酶滅活試驗(yàn)（eCIM）檢測(cè)CRKP菌株產(chǎn)碳青霉烯酶表型。

1.5 毒力表型檢測(cè)

拉絲試驗(yàn)：待測(cè)菌株接種于血瓊脂平板，35℃培養(yǎng)過(guò)夜，用接種環(huán)輕輕挑起單個(gè)菌落，重復(fù)3次拉絲長(zhǎng)度均≥5 mm，則為結(jié)果陽(yáng)性，判斷菌株為高黏性菌株[10]，即為CR-hvKP菌株[11]。

1.6 耐藥基因、莢膜血清型、毒力基因檢測(cè)

PCR技術(shù)檢測(cè)103株CRKP菌株耐藥基因β內(nèi)酰胺酶基因（blaSHV、blaTEM）、碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48）；6種常見(jiàn)的莢膜血清型（K1、K2、K5、K20、K54、K57），10種毒力基因（rmpA、Kfu、Aerobactin、

mrkD、iroN、fim-H、ent-B、alls、magA、ybtS）。引物序列、擴(kuò)增條件及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1[12-16]。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)。

表1 主要引物序列Table 1 Primers used in this study for amplifying relevant genes

1.7 CRKP的MLST分析

對(duì)103株CRKP菌株進(jìn)行MLST，肺炎克雷伯菌的7個(gè)管家基因（rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB）引物序列 參 照MLST數(shù)據(jù)庫(kù)（https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.

html）合成，退火溫度設(shè)置為50℃。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登錄MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線比對(duì)，將比對(duì)的等位基因編碼組合與數(shù)據(jù)庫(kù)已提交的肺炎克雷伯菌等位基因編碼組合進(jìn)行對(duì)比，確定其序列型（ST）。

1.8 CRKP的同源性（PFGE）分析

對(duì)拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性的菌株（CR-hvKP）進(jìn)行PFGE圖譜分析同源性[17]，采用Bionumerics 7.6軟件對(duì)PFGE條帶進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 CRKP菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥性

103株CRKP菌株對(duì)臨床常見(jiàn)抗菌藥物表現(xiàn)為不同程度的耐藥，對(duì)亞胺培南、美羅培南等耐藥率為100%，對(duì)環(huán)丙沙星等耐藥率為50.5%～87.4%，對(duì)多黏菌素B耐藥率為1.0%，敏感性最好，見(jiàn)表2。

表2 103株CRKP菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥率Table 2 Susceptibility of 103 strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae to antimicrobial agents

2.2 碳青霉烯酶的表型及耐藥基因的分子生物學(xué)檢測(cè)

2.2.1mCIM試 驗(yàn) 聯(lián) 合eCIM試 驗(yàn) 檢 測(cè) 103株CRKP菌株中，94株CRKP菌株產(chǎn)碳青霉烯酶，其中63株（67.0%，63/94）產(chǎn)金屬酶，31株（33.0%，31/94）產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶。

2.2.2PCR分子生物學(xué)檢測(cè) 103株CRKP菌株中β內(nèi)酰胺酶基因以blaTEM檢出率最高，為82株（79.6%），blaSHV基因62株（60.2%）；87株碳青霉烯酶基因陽(yáng)性，其中NDM、KPC、OXA-48、IMP檢 出 率 分 別 為50.5%（52/103）、33.0%（34/103）、22.3%（23/103）及10.7%（11/103）。未檢出VIM基因。測(cè)序結(jié)果顯示，82株TEM基因陽(yáng)性菌株全部為T(mén)EM-1型，62株SHV基因陽(yáng)性為SHV-1（45.2%，28/62）、SHV-12型（33.9%，21/62）和SHV-11型（21.0%，13/62），52株NDM基因存在NDM-5亞型（80.8%，42/52）和NDM-1亞型（19.2%，10/52），42株KPC基因均為KPC-2型。103株CRKP菌株中，以NDM+TEM+SHV陽(yáng)性株數(shù)最多為18.4%（19/103），攜帶KPC+TEM基因、KPC+SHV+TEM的菌株數(shù)量分別為13.6%（14/103）、12.6%（13/103）。

2.3 CRKP的MLST分析結(jié)果

103株CRKP菌 株 中 有18個(gè)ST型 別，1株因未得到完整的等位基因編號(hào)而無(wú)ST型別。ST分 型 中ST11型36株（35.3%），其 中30株 攜帶KPC-2基因，集中出現(xiàn)在神經(jīng)外科（22.2%，8/36）、PICU（19.4%，7/36）、急 診 科（19.4%，7/36）、肝 膽 外 科（11.1%，4/36）等；ST76型23株（22.5%），有21株攜帶NDM基因（20株NDM-5，1株NDM-1），主要分布在NICU（78.3%，18/23）。

2.4 毒力表型、莢膜血清型及毒力基因檢測(cè)結(jié)果

103株CRKP菌株中有10株（9.7%，10/103）拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性，為高黏液表型，即CR-hvKP菌株。莢膜血清型分型結(jié)果顯示，10株CR-hvKP菌株中，K1血清型4株（40.0%，4/10），未檢出K2、K5、K20、K54、K57血清型；有4株菌攜帶全部10種毒力基因，fim-H和entB基因陽(yáng)性10株（100%），ybts基因陽(yáng)性8株（80.0%）；5株NDM-5基因陽(yáng)性，2株KPC-2基因，8株SHV基因，6株TEM基因，見(jiàn)表3。

表3 10株拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性的CR-hvKP菌株P(guān)FGE、MLST莢膜血清型、碳青霉烯類耐藥基因及毒力基因等檢測(cè)結(jié)果Table 3 Prevalence of PFGE types, MLST types, K1 capsular serotype, carbapenem resistance genes, and virulence genes in 10 strains of carbapenem-resistant hypervirulent K. pneumoniae which were positive in string test

2.5 CR-hvKP的PFGE分析結(jié)果

10株CR-hvKP分為A～F 6種不同的克隆型，其中D型的3株（菌株編號(hào)2、3、8號(hào)）具有相似的圖譜，親緣性較高，該3株菌在檢出科室、檢出時(shí)間、標(biāo)本類型方面均較為分散，未發(fā)現(xiàn)其暴發(fā)流行。其余7株分別為5種不同的克隆型（A、B、C、E、F型），見(jiàn)表3。

3 討論

產(chǎn)碳青霉烯酶是CRKP菌株對(duì)β內(nèi)酰胺類包括碳青霉烯類藥物耐藥的主要原因[18]，這是對(duì)抗感染治療的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。目前，臨床上檢測(cè)CRE耐藥機(jī)制的常用方法是CLSI于2017年和2018年相繼推出的mCIM和eCIM聯(lián)合試驗(yàn)作為檢測(cè)腸桿菌目細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的確證試驗(yàn)[9]。本組資料顯示，mCIM和eCIM聯(lián)合對(duì)103株CRKP菌株的碳青霉烯酶檢出率為91.3%（94/103），其中67.0%（63/94）產(chǎn)金屬酶，33.0%（31/94）產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶，提示我院的CRKP菌株大多產(chǎn)碳青霉烯酶，以金屬酶為主；與同時(shí)進(jìn)行的PCR檢測(cè)法結(jié)果顯示金屬酶blaNDM碳青霉烯酶基因中檢出率50.5%（52/103）為最高一致；blaKPC次之（33.0%，34/103）。測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，我院NDM基因存在兩個(gè)亞型，NDM-5亞型為主（80.8%），NDM-1亞型次之（19.2%）；KPC基因均為KPC-2型。即我院主要的碳青霉烯酶基因?yàn)镹DM-5型，這與國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)報(bào)道的CRKP菌株中主要以產(chǎn)碳青霉烯酶基因型為KPC-2型不同[19-20]，但與徐旋等[21]報(bào)道的銀川地區(qū)碳青霉烯酶耐藥基因以NDM為主相符。另有研究報(bào)道稱，NDM-1型在印度[22]、新加坡[23]等國(guó)家是主要的碳青霉烯酶流行型，提示碳青霉烯酶基因具有明顯的地區(qū)差異性。本研究中KPC基因的檢出率僅次于NDM基因，表明KPC型酶也已經(jīng)在我院流行傳播。

本研究對(duì)103株CRKP菌株進(jìn)行了MLST，共檢出18種ST型別。結(jié)果顯示我院優(yōu)勢(shì)型別為ST11型，主要以產(chǎn)KPC酶為主，這與我國(guó)產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌主要流行型為ST11型相符[24]。結(jié)合病歷資料發(fā)現(xiàn)，ST11型在神經(jīng)外科、PICU、急診科檢出較多，但總體呈分散流行，ST76型主要檢出時(shí)間集中于2019年4月至9月，主要集中于NICU，期間可能發(fā)生過(guò)一次暴發(fā)流行，醫(yī)院可能采用了相關(guān)防治措施，9月之后未再有菌株暴發(fā)流行。這提示我們應(yīng)當(dāng)及時(shí)建立一種醫(yī)院感染暴發(fā)預(yù)警系統(tǒng)，并有嚴(yán)格的手衛(wèi)生和感染隔離措施，有研究表明通過(guò)嚴(yán)格的感染控制措施和醫(yī)護(hù)人員教育能夠成功控制菌株暴發(fā)感染[25]。

從103株CRKP菌株中篩選出10株高黏液表型菌株，檢出率為9.7%，與俞鳳[16]研究結(jié)果一致，但相較我國(guó)學(xué)者Guo等[26]報(bào)道肺炎克雷伯菌導(dǎo)致的侵襲性感染中有22.8%的hvKP以及韓國(guó)學(xué)者Jung等[27]報(bào)道的從菌血癥患者中分離出的肺炎克雷伯菌有42.2%為hvKP來(lái)說(shuō)明顯較低，有待后續(xù)加大樣本量進(jìn)一步研究。

本研究顯示103株CRKP中僅10株細(xì)菌為CR-hvKP菌株，具有拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性；碳青霉烯類耐藥基因的攜帶以NDM-5為主，產(chǎn)NDM-5型酶；此結(jié)果與康海全[14]的研究結(jié)果，即CR-hvKP菌株的耐碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制是產(chǎn)KPC-2型酶不同。目前莢膜血清型已報(bào)道了80多種的分型[28]，常見(jiàn)的有K1、K2、K5、K20、K54和K57等，其中最常引起KLA的是K1和K2型。本研究結(jié)果顯示，K1血清型檢出4株，檢出率為40.0%（4/10），與國(guó)內(nèi)報(bào)道的23.8%的K1型和42.9%的K2型有所不同[26]，需繼續(xù)監(jiān)測(cè)更多的樣本來(lái)明確莢膜血清分型。

本研究顯示10株CR-hvKP中分別被檢出100%和60%的 菌 株 含fim-H基 因 和Kfu基 因，50%菌株還含有mrkD的基因。文獻(xiàn)報(bào)道上述基因均與肺炎克雷伯菌入侵機(jī)體后細(xì)菌黏附機(jī)體的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛有關(guān)，此被認(rèn)為是細(xì)菌主要的黏附結(jié)構(gòu)，如Ⅰ型菌毛（fim-H和Kfu基因）與泌尿道感染密切相關(guān)，Ⅲ型菌毛（mrkD）與細(xì)菌生物膜親和性最好[29]。本研究中，fim-H基因和Kfu基因檢出率較高，能夠與機(jī)體內(nèi)的含甘露糖的蛋白相結(jié)合，有助于在泌尿道形成生物膜并定植[15]，這與Ⅰ型菌毛在肺炎克雷伯菌中普遍存在相一致。同時(shí)檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌在宿主體內(nèi)獲取鐵的方式即通過(guò)細(xì)菌自身的鐵載體分泌相關(guān)基因ent-B和ybtS基因等有關(guān)；對(duì)10株CR-hvKP中ent-B和ybtS基因的檢測(cè)，分別達(dá)100%和80%，如此高的檢出率，與其他文獻(xiàn)報(bào)道亦較一致[30]。

綜上所述，本院臨床分離的CRKP菌株對(duì)常見(jiàn)抗生素的耐藥率均較高且多為MDR菌，其對(duì)碳青霉烯類的主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)NDM-5型金屬酶，ST11型肺炎克雷伯菌為我院主要的流行克隆。9.7%的CR-hvKP菌株的檢出率，提示我院已出現(xiàn)高毒力的碳青霉烯類耐藥流行菌株，當(dāng)引起臨床和院感相關(guān)部門(mén)的重視，后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大樣本進(jìn)一步探查傳播來(lái)源及途徑，防止暴發(fā)流行。