艾葉及其腺毛顯微鑒定研究

劉孟奇，回成程，陳隨清，郭 濤, 2*，王海波，辛海量

艾葉及其腺毛顯微鑒定研究

劉孟奇1，回成程1，陳隨清1，郭 濤1, 2*，王海波3，辛海量2, 4*

1. 河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450046 2. 仲景中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)研究院，河南 南陽 473001 3. 河南省食品藥品檢驗所國家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質量控制重點實驗室，河南 鄭州 450018 4. 海軍軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433

為艾葉及腺毛的顯微鑒定和品質評價提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。利用熒光顯微鏡和掃描電子顯微鏡對艾葉進行顯微和組織化學研究。艾葉上、下表面均分布有腺毛和非腺毛。腺毛由2列細胞構成，其頭部由4或6個細胞對疊而成，柄部和基部各由2個細胞構成；非腺毛均為T形，柄由2～5個細胞構成，按照頂細胞特點將T形非腺毛分為2種：一種頂細胞呈長梭形而彎曲（I型）；另一種頂細胞呈細絲狀，極長、扁平且扭曲（II型）。草酸鈣簇晶直徑3～40 μm，多存在于葉肉細胞中；上表面氣孔稀少，下表面氣孔多，氣孔為不定式；上、下表皮細胞的垂周壁均為波狀彎曲。常見螺紋導管，偶見環(huán)紋、梯紋、網(wǎng)紋和孔紋導管。組織化學研究顯示，腺毛有揮發(fā)油、萜類、黃酮類等成分。為下一版《中國藥典》艾葉顯微鑒定相關內(nèi)容的修訂和完善提供了重要參考依據(jù)。

艾；顯微鑒定；腺毛；非腺毛；組織化學

艾Lévi. et Vant.為菊科蒿屬植物，中藥艾葉為其干燥葉，具溫經(jīng)止血、散寒止痛、祛濕止癢之功效[1]。我國大部分地區(qū)都有分布，多地有栽培，資源豐富。艾葉具有特殊氣味，上表面有稀疏柔毛和腺點，下表面密被灰白色蛛絲狀絨毛。艾葉在我國民間有悠久的使用歷史，其大多經(jīng)曬干搗碎得“艾絨”，制成艾條供灸用。我國歷代本草記載的艾葉原植物包括艾的野生種及同屬多種近緣種[2]，同屬多種植物（代用品或易混品）在不同地區(qū)被用作艾葉或混于艾葉中。由于艾及同屬多種植物葉形變化都非常大，僅從性狀方面鑒定艾葉仍然存在一定困難。

艾葉含有揮發(fā)油、黃酮類、萜類和多糖等成分[3]。揮發(fā)油含量的高低被認為可反映艾葉品質的優(yōu)劣[4-6]，而腺毛是揮發(fā)油合成和貯存的場所[7-8]，因此，揮發(fā)油的含量可能與腺毛密切相關。研究者對艾、臭蒿Ostenf. et Pauls.和黃花蒿L. 3種蒿屬植物進行了研究，結果表明揮發(fā)油含量與其葉表面腺毛密度正相關[9]。楊珂等[10]報道艾葉表面腺毛大小、飽滿程度等形態(tài)特點也與揮發(fā)油含量正相關；另外，也有文獻報道非腺毛為高純度艾絨的主要成分[11]?？梢?，對艾葉腺毛和非腺毛的顯微特征進行深入研究，對于艾葉及艾絨的質量評價都有重要價值。

《中國藥典》1977～2020年版中艾葉顯微鑒定項內(nèi)容未發(fā)生任何改變，其所載艾葉顯微特征都包括腺毛、非腺毛和草酸鈣簇晶3項，并指出非腺毛有2種：一種為T形毛，另一種為單列性非腺毛，由3～5細胞構成，頂端細胞特長而扭曲，常斷落[12-19, 1]。盡管之前不乏有艾葉相關的顯微研究[20-29]；然而，由于艾葉下表面密被灰白色蛛絲狀絨毛，給其顯微觀察帶來了巨大挑戰(zhàn)；同時，由于過去很長一段時間顯微制片技術和觀察手段不夠全面，一定程度上也影響了艾葉顯微研究的進展。值得指出的是，對于艾葉非腺毛研究，在大多文獻報道中并未提及單列性非腺毛[25, 27-32]，或雖提及單列性非腺毛而無可信的圖片[26, 33]。此外，當前對于艾葉草酸鈣晶體類型、導管類型、葉表皮細胞特點、氣孔類型及其分布特點等顯微特征仍缺少較為全面的研究。

進入21世紀以來，顯微儀器和制片技術的不斷進步，給中草藥深入的顯微鑒定創(chuàng)造了新的條件。本研究以艾葉為研究材料，在采用多種制片技術的基礎上，結合光學顯微和掃描電子顯微技術對艾葉進行顯微及組織化學研究，旨在為艾葉和艾絨的顯微鑒定和質量評價提供可靠的參考資料。

1 儀器和材料

1.1 材料

2021年5月，分別于湖北蘄春縣、河南南陽、河南湯陰縣、浙江寧波和河南中醫(yī)藥大學中藥植物園等地采集新鮮艾葉，共計100多個批次，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學藥學院蘇秀紅教授鑒定均為蒿屬植物艾Lévi. et Vant.的葉，其中來源于河南中醫(yī)藥大學中藥植物園艾的原植物及不同發(fā)育時期的葉如圖1所示。

1.2 儀器與試劑

Canon EOS R6xin型數(shù)碼相機（日本佳能株式會社）；Leica RM 2016型石蠟切片機（德國徠卡公司），Leica CM1860型冰凍切片機（德國徠卡公司），Olympus SZX16型熒光體視顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Olympus BX53型正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Quorum K850型二氧化碳臨界點干燥儀（英國Quorum公司）；Quorum SC7620型離子濺射鍍膜儀（英國Quorum公司）；Zeiss EVO10鎢燈絲掃描電子顯微鏡（德國蔡司公司）。

A-原植物 B-不同發(fā)育時期葉的上、下表面

鹽酸、酒精、二甲苯、甲苯胺藍O、水合氯醛、氫氧化鈉、次氯酸鈉、稀甘油、FAA（70%酒精∶冰乙酸∶甲醛＝90∶5∶5）、石蠟、4-對亞硝基苯酚、濃硫酸、NADI（1%二甲基對苯二胺磷酸鹽緩沖劑溶液＋1%的α-萘酚酒精溶液1∶1等量混合），蘇丹III、蘇丹IV、二苯基硼酸-2-氨基乙酯（DPBA）購自美國Sigma公司。

2 方法

2.1 艾葉外觀性狀及顯微觀察

2.1.1 數(shù)碼相機拍照 使用數(shù)碼相機對艾原植物拍照，取發(fā)育程度不同的艾葉，對其上、下表面分別拍照。

2.1.2 體式顯微鏡觀察 取新鮮艾葉，用刀片將其切成8～10 mm小塊，制成水封片后，用熒光體視顯微鏡對上、下表面分別觀察并拍照。

2.1.3 熒光顯微鏡觀察 取新鮮艾葉，用清水漂洗后，切成8～10 mm小塊，制成水封片后，用熒光顯微鏡對上、下表面分別觀察并拍照。另取新鮮艾葉，用刀片輕刮下表面以除去非腺毛，然后用刀片將葉片切成8～10 mm小塊，一部分材料制成水封片后，直接用熒光顯微鏡觀察并拍照，一部分材料先用濃鹽酸浸泡5～15 min，再制成水封片后，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.1.4 透明葉制片觀察 取新鮮艾葉在95%酒精中浸泡過夜以除去葉綠素，再轉入10%的氫氧化鈉中，浸泡至其變褐色后，轉入20%的次氯酸鈉中漂白至無色，然后用水合氯醛溶液透明，用稀甘油封片后，再用熒光顯微鏡在明視野下對上、下表面分別觀察并拍照。

2.1.5 石蠟切片觀察 取新鮮艾葉，在中脈中段切取8～10 mm小塊，用FAA固定24 h，采用梯度酒精（70%、80%、90%、100%）脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，石蠟切片機切片，切片厚度10～15 μm，經(jīng)0.5%的甲苯胺藍O染色，用中性樹膠封片后，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.1.6 冰凍切片觀察 取新鮮艾葉，在葉柄端部取一段材料，然后在葉片中脈中段處切取8～10 mm小塊，分別用冰凍切片機切片，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.1.7 掃描電子顯微鏡觀察 選取不同發(fā)育時期的艾葉，切成小塊，用FAA固定，采用梯度酒精（70%、85%、95%、100%）脫水，轉入乙酸異戊酯，使用二氧化碳臨界點干燥儀干燥后，用導電膠帶將材料粘貼于樣品臺上，用離子濺射鍍膜儀鍍金后，用掃描電子顯微鏡觀察葉表面特征并拍照。

計算腺毛的長度和寬度、非腺毛密度和氣孔密度等數(shù)值，隨機測20個數(shù)值，取其平均值。

2.2 組織化學分析

取新鮮艾葉，一部分材料用刀片切成8～10 mm小塊，一部分材料用冰凍切片機切片，切片厚度30～50 μm；用不同的化學試劑染色：（1）檢測單萜用4-對亞硝基苯酚[34]；（2）檢測倍半萜用濃硫酸[35-36]；（3）檢測萜類（揮發(fā)油）用NADI[37]；（4）檢測脂類用蘇丹III[38]、蘇丹IV[39]；（5）檢測黃酮類用香草醛-濃鹽酸[40]、二苯基硼酸-2-氨基乙酯（DPBA）[41]；染色后分別用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.3 粉末顯微觀察

艾葉制成粉末，取少量艾葉粉末，經(jīng)水合氯醛透化后，稀甘油封片，用熒光顯微鏡觀察并采用藍色或綠色濾光片以獲取清晰圖像并拍照，觀察草酸鈣晶體時在明視野或偏振光下觀察拍照。

3 結果與分析

3.1 艾葉的外觀性狀及顯微觀察

艾為多年生草本或略成半灌木狀（圖1-A），幼嫩期艾葉上表面為黃綠色（圖1-B，1的上表面），被白色絨毛，隨著葉的發(fā)育，上表面顏色逐漸變深，成熟期為深綠色（圖1-B，2-4的上表面）；從幼嫩期到成熟期，艾葉下表面始終覆蓋灰白色蛛絲狀絨毛（圖1-B，1-4的下表面）。

使用熒光體視顯微鏡觀察成熟艾葉，在藍光激發(fā)下可見上表面分布有黃色的腺點（即腺毛）和非腺毛（圖2-A）；在明視野下可見下表面密被灰白色蛛絲狀絨毛（圖2-B）。用熒光顯微鏡觀察成熟艾葉，在藍光激發(fā)下可見上表面有許多腺毛發(fā)出明亮的黃色或白色光；腺毛頂面觀呈橢圓形，腺毛的密度約（40±5）個/mm2；同時可觀察到上表面有許多 T形非腺毛發(fā)出黃綠色光，其柄較短，頂細胞長梭形而彎曲，兩臂不等長，臂長多在300～500 μm（圖2-C）。在藍光激發(fā)下，下表面的腺毛和非腺毛也分別發(fā)出明亮的黃色（或白色）和黃綠色光，其中在葉脈處的T形非腺毛最為清晰，其柄較短，而頂細胞比上表面的長，臂長多在500～800 μm，這種頂細胞較長的T形非腺毛在葉脈間也有稀疏分布（圖2-D）。上述上、下表面的這種T形非腺毛，其頂細胞都為長梭形彎曲，兩臂不等長，本文將其稱為I型T形非腺毛。

艾葉下表面葉脈間密集分布有蛛絲狀的非腺毛，下表面的腺毛通常為其覆蓋，因此用體視顯微鏡在明視野下觀察難以被發(fā)現(xiàn)（圖2-B），而在熒光顯微鏡藍光激發(fā)下由于這些腺毛能發(fā)出明亮的黃色或白色光，因而可清晰觀察到（圖2-D），下表面的腺毛密度顯著低于上表面（圖2-C）。用熒光顯微鏡在紫外光激發(fā)下，可觀察到上表面的T形非腺毛（I型）柄由2～5個細胞構成，柄或柄脫落后留下的脫落痕都均可發(fā)出明亮的藍色光（圖2-E）。上、下表面腺毛大小并無明顯區(qū)別，長度都約為（56±4）μm，寬度約（45±3）μm，頂面觀都呈橢圓形（圖2-F）。

A, B-熒光體視顯微鏡下葉表面觀察：A為上表面（藍光激發(fā)），B為下表面（明視野） C, D-熒光顯微鏡下葉表面觀察（藍光激發(fā)）：C為上表面 D為下表面（白箭頭示I型T形非腺毛） E-上表面（白箭頭示I型T形非腺毛的柄，紅箭頭示其柄脫落留下的脫落痕，橢圓形藍斑為腺毛） F-腺毛（藍光激發(fā)）

用熒光顯微鏡在20倍物鏡下，用藍光激發(fā)，可觀察到艾葉下表面葉脈間的T形非腺毛發(fā)出黃色光，柄尤為顯著，其頂細胞由此向兩側逐漸變細（圖3-A）；而在紫外光激發(fā)下，T形非腺毛發(fā)出藍色光，柄最為顯著，其頂細胞極為細長、扁平而扭曲，細胞壁薄，為另一種T形非腺毛（圖3-B），本研究稱其為II型T形非腺毛。用刀片刮去艾葉下表面的非腺毛，紫外光激發(fā)并在10倍物鏡下觀察，下表面的I型和II型T形非腺毛柄的脫落痕或殘余柄都呈現(xiàn)為藍色“斑點”，而腺毛呈現(xiàn)為橢圓形“黑斑”，因此可以清晰觀察到腺毛和非腺毛的分布并方便計數(shù)，成熟艾葉下表面腺毛的密度約（21±3）個/mm2，T形非腺毛（含I型和II型）密度達到（146±10）個/mm2（圖3-C），透明葉制片在紫外光激發(fā)下觀察，發(fā)現(xiàn)柄一般由2～5個細胞構成（圖3-D）。

A-藍光激發(fā)下觀察到的II型T形非腺毛（白箭頭示柄）和腺毛（紅箭頭） B-紫外光激發(fā)下觀察到的II型T形非腺毛（白箭頭示柄） C-下表面去除T形非腺毛后紫外光激發(fā)觀察（白箭頭示T形非腺毛柄的脫落痕或殘余柄，黑斑處為腺毛） D-下表面紫外光激發(fā)下觀察（紅箭頭示T形非腺毛的柄，白箭頭示腺毛）

觀察成熟艾葉橫切面，可見上表面T形非腺毛（I型）柄由2～5個細胞構成，頂細胞長梭形而彎曲，兩臂不等長；下表面 T形非腺毛（II型）頂細胞極為細長而扭曲，在橫切制片中易被切斷，因而難以觀察到完整的頂細胞，其柄也多由2～5個細胞構成（圖4-A）。艾葉上、表皮都由單層細胞構成，上表皮細胞明顯比下表皮細胞厚，腺毛位于上、下表面的凹陷處；艾葉為異面葉，柵欄組織由一層細胞構成，海綿組織細胞排列疏松（圖4-B），其中分布有大小不等的草酸鈣簇晶（圖4-C）。

艾葉在幼嫩期（圖1-B的1），即可觀察到其腺毛已由2列細胞構成，其中腺毛基部由2個較小的細胞構成，柄部（由2細胞構成）和頭部（3層6細胞或2層4細胞構成）細胞的細胞質濃，染色重，此時腺毛體積較小，尚未產(chǎn)生分泌物（圖4-D）。腺毛發(fā)育成熟時，頭部的細胞（4或6個）被共同的角質層包圍，分泌物儲存在角質層和細胞壁之間的間隙（即角質層下間隙）中，成熟腺毛柄部較短，由兩個較小細胞構成，基部由兩個更小的細胞構成（圖4-E）。艾葉上表面氣孔稀少，分布不均勻，下表面氣孔較多，氣孔密度高達（300±25）個/mm2，氣孔都呈橢圓形，為不定式，氣孔周圍有3～5個副衛(wèi)細胞，氣孔長軸長（26±4）μm，短軸長（20±2）μm，成熟艾葉上、下表面的表皮細胞形狀均為無規(guī)則形，垂周壁式樣均為波狀彎曲（圖4-F，G）。上、下表面T形非腺毛（含I型和II型）自柄完全脫落后均留下圓形的脫落痕，脫落痕一般位于表皮細胞的近中央位置，也有少數(shù)位于兩個表皮細胞的交界處，脫落痕直徑（10±1）μm（圖4-H）。腺毛的頂面觀呈橢圓形（圖4-G），其基部呈近圓形，直徑（15±2）μm，由2個細胞構成（圖4-H、I）。

掃描電鏡觀察到艾葉在幼嫩期（圖1-B的1）上表面密被I型T形非腺毛（圖5-A），下表面葉脈密集，葉脈上密被I型T形非腺毛，葉脈間I型T形非腺毛也較多，覆蓋其下方未發(fā)育成熟的II型T形非腺毛（圖5-B）。葉片成熟時，上表面的I型T非腺毛隨著葉片發(fā)育成熟而變得稀疏，腺毛頂面觀為橢圓形（圖5-C）。成熟艾葉下表面的葉脈間密被II型T形非腺毛，I型T形非腺毛則變得稀疏，但是仍位于II型T形非腺毛上方，由于II型T形非腺毛非常密集，頂細胞極長又相互交錯盤結，覆蓋了絕大多數(shù)腺毛，只在少數(shù)地方可以觀察到露出的腺毛（圖5-D）。

在艾葉的幼嫩期（圖1-B的1），可以觀察到腺毛已形成頭部的各層細胞（圖6-A）。隨著葉的生長，腺毛體積有所增大，最頂端兩細胞界限明顯，中間有明顯縊縮（圖6-B），后來腺毛明顯膨大，開始具分泌作用，分泌物貯存在角質層下間隙中，位于頂部兩細胞界限處角質層上有時可見小裂孔，但未見分泌物溢出（圖6-C），當腺毛完全發(fā)育成熟時，在角質層下間隙中充滿分泌物，腺毛體積達到最大，頂面觀呈現(xiàn)橢圓形（圖6-D），角質層破裂后可以看到腺毛最頂端的兩個細胞（圖6-E）。

A-橫切觀察（黑箭頭和紅箭頭分別示I型和II型T形非腺毛） B-橫切制片高倍物鏡下觀察 C-橫切制片觀察到葉肉細胞中的草酸鈣簇晶（白箭頭） D-未具分泌功能的腺毛（白箭頭示基部） E-成熟具分泌功能的腺毛（白箭頭和紅箭頭分別示基部和柄部） F-上表面的氣孔和表皮細胞（白箭頭示I型T形非腺毛的柄） G-下表面的氣孔（白箭頭和紅箭頭分別示腺毛和T形非腺毛的脫落痕） H-上表面（白箭頭和紅箭頭分別示腺毛的基部和T形非腺毛的脫落痕） I-上表面腺毛的基部放大觀察（白箭頭）

A-幼嫩葉上表面（白箭示頭腺毛，紅箭頭示I型T形非腺毛） B-幼嫩葉下表面（白箭頭示I型T形非腺毛） C-成熟葉上表面 D-成熟葉下表面（白箭頭腺毛，紅箭頭示I型T形非腺毛）

A-幼嫩葉上表面的腺毛（白箭頭） B-未具分泌功能的腺毛（白箭頭示T形非腺毛的柄） C-具有分泌功能的腺毛（白箭頭示裂孔） D-充滿分泌物的成熟腺毛（白箭頭示裂孔） E-角質層破裂后的腺毛（白箭頭示頂部兩細胞間的界限） F-上表面的I型T形非腺毛 G-下表面（白箭頭示II型T形非腺毛的柄，紅箭頭示腺毛） H-下表面上的II型T形非腺毛（白箭頭示柄） I-下表面上T形非腺毛的脫落痕（白箭頭） J-下表面上的氣孔（白箭頭）

艾葉樣品前期處理良好時，可以觀察到I型T形非腺毛的柄和頂細胞都形態(tài)飽滿、表面光滑（圖6-F）。下表面的II型T形非腺毛頂細胞細長、扁平且扭曲、兩臂向兩側延伸并逐漸變細（圖6-G），柄由2～5個細胞構成，少數(shù)柄的下端細胞膨大（圖6-H），艾葉的兩種T形非腺毛的柄脫落后在表皮細胞上都會留下圓形的脫落痕（圖6-I）。艾葉上表面氣孔稀少，下表面氣孔密集，這些氣孔的2個保衛(wèi)細胞都略高出表面，外拱蓋光滑，氣孔周圍有3～5個表皮細胞，為不定式氣孔（圖6-J）。

葉柄橫切制片可觀察到5～7個大小不等的外韌維管束，中間的最大；韌皮纖維和木纖維被甲苯胺藍O染成深藍色（圖7-A）。葉柄上分布I型T形非腺毛和少量的腺毛，I型T形非腺毛頂細胞長度較短，臂長小于300 μm。葉柄表皮由一層細胞構成，表皮細胞下有一些厚角組織細胞（圖7-B），而葉的中脈只有一個外韌維管束（圖7-C）。葉柄中的一些薄壁細胞中分布有草酸鈣簇晶，最大可達40 μm，還有少量的草酸鈣方晶（圖7-D），在中脈橫切片中也發(fā)現(xiàn)有較大的草酸鈣簇晶，偏振光下觀察非常顯著（圖7-E）。對葉柄和中脈縱切制片觀察發(fā)現(xiàn)韌皮纖維的細胞壁較厚，有明顯的單紋孔（圖7-F），葉柄和中脈中有梯紋（圖7-G）、網(wǎng)紋（圖7-H）、孔紋和螺紋導管（圖7-I）。

3.2 組織化學分析

組織化學研究顯示：4-對亞硝基苯酚處理艾葉后，腺毛顯示棕紅色（圖8-A），表明存在單萜類物質；濃硫酸染色處理后，腺毛顯示黃色（圖8-B），表明存在倍半萜類物質；NADI處理腺毛后，顯示藍色（圖8-C），表明有萜類物質存在；蘇丹IV處理后，腺毛顯示紅色（圖8-D），表明有脂類物質存在；香草醛-濃鹽酸處理后，腺毛顯示紅色（圖8-E），經(jīng)過DPBA處理后藍光激發(fā)后腺毛發(fā)出黃色熒光（圖8-F），表明有黃酮類物質存在。

3.3 粉末顯微觀察

艾葉粉末顏色為綠褐色。腺毛頂面觀為橢圓形，可見頭部最頂端細胞的2細胞相對而生（圖9-A），腺毛側面觀也呈橢圓形，由4或6細胞（更常見）相對疊合而成，腺毛柄部常脫落（圖9-B）。非腺毛均為T形，柄由2～5細胞構成，常部分或全部脫落，頂細胞有兩種類型：一種頂細胞長梭形彎曲，細胞腔狹小，表面較光滑，兩臂不等長（I型T形非腺毛，圖9-C）；另一種頂細胞兩臂呈細絲狀極長、扁平且扭曲（II型T形非腺毛），柄易脫落，常見長而扁平、扭曲的頂細胞部分（圖9-D）。成熟艾葉上、下表皮細胞垂周壁均為波狀彎曲（圖9-E，F(xiàn)）。上表面氣孔稀少，下表面氣孔多，氣孔類型為不定式（圖9-F）。螺紋導管最為常見（圖9-G），偶見環(huán)紋、梯紋、網(wǎng)紋和孔紋導管。常見草酸鈣簇晶，直徑在3～40 μm（圖9-H），偶見方晶（圖9-I）。

A-葉柄的橫切（黑箭頭示韌皮纖維，紅箭頭示木纖維） B-葉柄中的厚角組織 C-中脈橫切（黑箭頭示韌皮部，紅箭頭示木質部） D-葉柄薄壁細胞中的草酸鈣方晶（黑箭頭） E-中脈薄壁細胞中的草酸鈣簇晶（偏振光下） F-葉柄中的韌皮纖維（黑箭頭） G-葉柄中的梯紋導管（黑箭頭） H-葉柄中的網(wǎng)紋導管（黑箭頭） I-中脈中的螺紋導管（紅箭頭）和孔紋導管（黑箭頭）

A-4-對亞硝基苯酚染色 B-濃硫酸處理 C-NADI染色 D-蘇丹Ⅳ染色 E-香草醛-濃鹽酸處理 F-DPBA處理

4 討論

熒光顯微鏡下可觀察到艾葉的上、下表面都分布有大小、形態(tài)及結構相同的腺毛，上表面的腺毛密度顯著高于下表面。艾葉腺毛的柄部和基部都由2個細胞構成，其頭部由2層4個或3層6個細胞構成，被共同的角質層包圍，角質層下的間隙可以積累大量的分泌物。艾葉腺毛頂面觀呈橢圓形，腺毛柄部較短，為短柄的頭狀腺毛。由于艾葉短柄的頭狀腺毛生長于葉表面凹陷處，掃描電鏡下觀察到腺毛的頂面觀往往只看到其最頂端的細胞。在艾葉粉末中，腺毛的柄部常脫落，只留下頭部，頂面觀呈橢圓形，側面觀可看到頭部的6（更常見）或4個細胞，并可觀察到角質層下間隙充滿分泌物。艾葉的腺毛類型和黃花蒿[42]的腺毛特點相同，都為2列性。最近Cui等[27-28]研究指出艾葉腺毛除了2列性（10細胞，其中頭部6細胞，柄部和基部各2個細胞）腺毛外，還存在單列性（5細胞）腺毛，而其他關于包括艾Lévi. et Vant.、野艾蒿Candolle、五月艾Willd.等蒿屬植物的研究均未發(fā)現(xiàn)單列性腺毛[20-26]。本研究采用多種顯微手段觀察證實艾葉不存在單列性腺毛，并認為CUI等所述單列性（5細胞）腺毛是由于2列性（10細胞）腺毛在與其頂面觀長軸垂直方向進行切片所致，由于制片原因造成的假象在顯微研究中是較為常見的。1977至2020年，各版《中國藥典》中艾葉腺毛的頂面觀均被描述成“鞋底狀”[1,12-19]，是對頭部最頂端對疊而生的2個細胞的細胞壁輪廓而言，筆者認為腺毛頭部角質層下間隙中的分泌物也是腺毛不可分割的重要組成部分，在粉末觀察中，腺毛的柄部較短，又常脫落，頂面觀和側面觀均呈橢圓形，因此，腺毛的頂面觀和側面觀都描述為橢圓形比較合適。

A-腺毛的頂面觀 B-腺毛的側面觀 C-I型T形非腺毛 D-II型T形非腺毛（白箭頭和紅箭頭分別示柄和頂細胞上柄的脫落痕） E-上表皮 F-下表皮 G-螺紋導管 H-草酸鈣簇晶 I-偏振光下的草酸鈣方晶

A-top view of glandular trichome B-side view of glandular trichome C-Type I T-shaped non- glandular trichome D-Type II T-shaped non- glandular trichome( (white arrow head and red arrow head show the handle and handle's abscission mark on the apical cell respectively ) E-upper epidermis

F-lower epidermis G-spiral vessel H-calcium oxalate cluster crystal I-calcium oxalate square crystal under polarized light

圖9 艾葉粉末顯微特征圖（均放大400×）

Fig. 9 Microscopic features ofpowder(400× for all)

艾葉葉柄，以及上、下表面葉脈處的非腺毛都為I型T形非腺毛（下表面的葉脈間也分布有少量），頂細胞呈長梭形而彎曲、表面光滑、兩臂不等長。這些發(fā)現(xiàn)與1977年以來各版《中國藥典》描述的T形非腺毛形態(tài)學特征基本相同。然而，艾葉下表面葉脈間除了少量的I型T形非腺毛外，更多的是大量密集分布的II型T形非腺毛。II型T形非腺毛最顯著的特點在于：頂細胞極長、扁平且扭曲，且這些II型T形非腺毛的頂細胞相互纏繞。和上表面的I型T形非腺毛的密度（32±5）個/mm2相比，下表面II型T形非腺毛的密度高達（146±10）個/mm2，加上其頂細胞臂極細長，因此就有“上表面有稀疏柔毛”、“下表面密被灰白色絨毛”[1]的性狀。

《中國藥典》2020年版載艾葉：“另一種為單列性非腺毛，3～5細胞，頂端細胞特長而扭曲，常斷落”[1]。然而，徐國鈞院士等編撰的《中藥材粉末顯微鑒定》描述艾葉：“T形毛，常纏結。頂細胞橫生，大多極細長而扭曲……，胞腔線形或不明顯”[43]。其并未發(fā)現(xiàn)有“單列性非腺毛”，與歷版《中國藥典》不一致。1988年，劉訓紅等[27]研究認為艾葉的非腺毛都為T形，其并根據(jù)頂細胞特點將T形非腺毛分為2種，一種頂端細胞長而彎曲，兩臂不等長；另一種頂端細胞特長而扭曲（密布于下表皮）。同樣也并未提及“單列性非腺毛”。宋平順等[44]對艾、野艾蒿等12種蒿屬植物進行了研究，發(fā)現(xiàn)這些植物的葉表面均分布有腺毛和T形非腺毛，而未發(fā)現(xiàn)存在“單列性非腺毛”，并明確指出艾葉T形非腺毛頂細胞存在兩種情況：“細胞壁厚、略彎曲、或細胞壁薄而成纏繞狀”，這一結論也與本研究結果十分相近。顯然，徐國鈞院士提到的“大多極細長而扭曲”的非腺毛就是本研究中的II型T形非腺毛，而“胞腔線形或不明顯”則為I型T形非腺毛頂細胞的特點；其與本研究描述的區(qū)別在于：前者將T形非腺毛的特征作了簡化而一并描述之；而本研究依據(jù)T形非腺毛頂細胞特點直接將其分為2類，更加清晰、不易引起誤讀。需要特別指出的是：前期對1000多個批次的艾葉樣品進行研究，從未發(fā)現(xiàn)頂端細胞特長而扭曲的“單列性非腺毛”。同時，發(fā)現(xiàn)粉末中II型T形非腺毛的柄易脫落，留下長而扁平、扭曲的頂細胞。仔細分析，不難發(fā)現(xiàn)：粉末中柄脫落的II型T形非腺毛就是現(xiàn)版《中國藥典》所載具有“3～5細胞，頂端細胞特長而扭曲，常斷落”特點的所謂“單列性非腺毛”。

顯微鑒定是中藥基原鑒定的重要依據(jù)，對其質量評價也有重要意義。艾葉顯微特征的深入研究對于艾葉和艾絨的真?zhèn)舞b別及質量評價都具有重要參考價值，也為下一版《中國藥典》艾葉顯微鑒定相關內(nèi)容的修訂和完善提供了參考資料。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Microscopic identification and histochemical study of glandular trichomes inleaves

Liu Meng-qi1, Hui Cheng-cheng1, Chen Sui-qing1, Guo Tao1,2, Wang Hai-bo3, XIN Hai-liang2,4

1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Zhongjing Chinese Medicine Industry Research Institute,Nanyang 473001, China 3. NMPA Key Laboratory for Quality Control of Traditional Chinese Medicine, Henan Institute for Food and Drug Control, Zhengzhou 450018, China 4. School of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

To provide reliable reference for microscopic identification and quality evaluation ofleaves and moxa floss.The microstructure and histochemistry ofwere studied by fluorescence microscope and scanning electron microscope.Glandular trichomes and non- glandular trichomes were distributed on the upper and lower surfaces of. The glandular trichome was composed of two rows of cells, with four or six cells overlapping each other at the head, two cells at the stalk and two cells at the base. Non- glandular trichomes are characteristic of T shape, and their stalk was composed of 2－5 cells. According to the characteristics of apical cells, the T- shaped non- glandular trichomes can be divided into two types: One was apical cells with long spindle and curved shape (type I), and the other was filamentous, extremely long, flat, and twisted (type II). Calcium oxalate cluster crystals with diameters ranging from 3 to 40 μm were found mostly in mesophyll cells. There were few stomata on the upper surface and many stomata on the lower surface, and the stomata were amorphous. The vertical walls of upper and lower epidermal cells were wavy and curved. The spiral vessel was often found. While the scalariform, reticulate and pitted vessel are occasionally found. The results of histochemical study showed that glandular trichomes contained volatile oil, terpenoids, flavonoids and other components.The results of this study provide an important reference for the revision and improvement of the microscopic identification ofin the next edition of.

Lévi. et Vant.; microscopic identification; glandular trichomes; non-glandular trichomes; histochemistry

R286

A

0253 - 2670(2022)23 - 7532 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.025

2022-06-06

教育部產(chǎn)學研合作協(xié)同育人項目（202102294010）；河南省科技廳科技攻關項目（222102310110）；科技基礎資源調(diào)查專項子課題（2018FY100802-03）

劉孟奇（1971—），男，副教授，研究方向為中藥資源與鑒定。E-mail: 2009liumq@163.com

通信作者：郭 濤（1976—），男，教授，研究方向為中藥鑒定與質量控制。E-mail: gt010010@163.com

辛海量（1976—），男，教授，研究方向為中藥鑒定、質量評價及中藥藥理。E-mail: hailiangxin@163.com

[責任編輯 時圣明]