荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)小鼠機體損傷的保護作用

趙亞芳，姜雨喬#，李郁茹，程國良，王恩力，譚玉軍，姚景春，趙 琰*，張貴民*

荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)小鼠機體損傷的保護作用

趙亞芳1，姜雨喬1#，李郁茹2，程國良1，王恩力3，譚玉軍3，姚景春3，趙 琰1*，張貴民3*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029 3. 魯南制藥集團股份有限公司，中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東臨沂 276000

研究荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)小鼠機體損傷的保護作用及其作用機制。雄性昆明小鼠隨機分為對照組、模型組和荊防顆粒高、中、低劑量（16、8、4 g/kg），每組8只。給予相應(yīng)藥物連續(xù)干預(yù)7 d，同時每天進行冰水浴寒冷刺激以建立小鼠機體損傷模型，每天測定小鼠體質(zhì)量，實驗結(jié)束后測定并計算臟器指數(shù)；觀察小鼠耳組織外觀和病理損傷程度；檢測檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性及三酰甘油（triglycerides，TG）、肌酐（creatinine，CRE）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平；檢測肌肉組織中抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）水平。經(jīng)荊防顆粒干預(yù)后，各組小鼠體質(zhì)量無顯著性差異，體質(zhì)量變化較為平穩(wěn)，其中荊防顆粒低劑量組小鼠體質(zhì)量增長較快，臟器指數(shù)無顯著差異；耳組織外觀及病理切片結(jié)果顯示，小鼠受寒冷刺激誘導(dǎo)的損傷程度減輕；血清中IL-6、IL-1β、TNF-α和BUN水平降低（＜0.05、0.01）；肌肉組織中AFP水平升高（＜0.05、0.01）。荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)的機體損傷具有保護作用，其作用機制與抑制炎癥反應(yīng)、增加AFP水平有關(guān)。

荊防顆粒；寒冷刺激；機體損傷；炎癥；抗凍蛋白

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為寒冷是一種常見的應(yīng)激原，流行病學(xué)結(jié)果表明，寒冷會對人體的生理和代謝產(chǎn)生不良影響。寒冷刺激程度過強或持續(xù)時間過長則導(dǎo)致機體的異常反應(yīng)，輕者會引起軀體凍傷，重者不僅會出現(xiàn)感覺障礙，同時還可能造成心、腦、肺臟、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多臟器、多系統(tǒng)的損傷，甚至危及作業(yè)者的生命安全。同時增加了風(fēng)濕類疾病、心腦血管疾病發(fā)生的風(fēng)險[1]。因此，對于寒冷刺激致機體損傷機制的研究以及預(yù)防和改善措施一直是研究特殊自然環(huán)境的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域持續(xù)關(guān)注和亟待解決的重要課題，對于保障人民的身體健康和生活質(zhì)量具有重要意義。

荊防顆粒[2-4]是根據(jù)古代經(jīng)典名方荊防敗毒散，采用現(xiàn)代制藥工藝提取、加工、濃縮制成的中成藥顆粒制劑，是源于經(jīng)典、遵古守方的現(xiàn)代中成藥典范。荊防敗毒散方劑的使用距今已400多年，對后世影響深遠，沿用至今。荊防顆粒制劑的生產(chǎn)銷售也已達30多余年，其可靠的療效和安全性被臨床實踐反復(fù)驗證，該方具有發(fā)汗解表、散風(fēng)祛濕之功效，是臨床中常用于治療風(fēng)寒侵襲所致類病的辛溫之劑。荊防顆粒由提取物浸膏和大量輔料組成，為避免添加輔料對實驗的影響，本研究以荊防顆粒浸膏為研究對象，采用冰水浴建立寒冷刺激誘導(dǎo)的小鼠機體損傷模型，評價荊防顆粒浸膏對寒冷刺激誘導(dǎo)機體損傷的保護作用，并通過檢測血清中炎癥因子、肌肉組織中抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）的水平初步探究其可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性昆明小鼠40只，體質(zhì)量（35±2）g，7周齡，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，合格證號SYXK（京）2020-0033。動物飼養(yǎng)于濕度55%～65%、溫度（25±1）℃、晝夜節(jié)律12/12 h的條件下，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號BUCM-4-2021052802-2044）。

1.2 藥品與試劑

荊防顆粒浸膏（批號80022202002）由魯南制藥集團股份有限公司提供；小鼠AFP ELISA試劑盒（批號07/2021）購自上海江萊生物科技有限公司；小鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號L210701101）、IL-1β ELISA試劑盒（批號L210520738）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號L21064727）購自武漢云克隆科技股份有限公司；本實驗用水均為去離子水。

1.3 儀器

SYD-B-F型石蠟包埋機（沈陽譽德電子儀器有限公司）；RM2016型石蠟切片機（德國Leica公司）；Eclipse Ti-SR型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；AU-480型全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機分為對照組、模型組和荊防顆粒高、中、低劑量（16、8、4 g/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的2、1、0.5倍），每組8只。各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積的去離子水，1次/d，連續(xù)7 d。參考文獻方法[5]建立寒冷刺激誘導(dǎo)的機體損傷模型，每次藥物干預(yù)2 h后，將動物置于冰水?。? ℃）中5 min，取出后用吹風(fēng)機吹干，連續(xù)7 d，最后1次冰水浴結(jié)束后取材，實驗前12 h禁食不禁水。實驗過程中每天定時記錄小鼠體質(zhì)量。

2.2 小鼠臟器指數(shù)測定

各組小鼠摘眼球取血后，脫頸椎處死，迅速摘取心、肺并稱定質(zhì)量，計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/體質(zhì)量

2.3 耳組織外觀形態(tài)及病理學(xué)觀察

取各組小鼠雙耳組織，拍照觀察其損傷程度；剪取同一區(qū)域的耳組織，置入4%多聚甲醛中性固定液固定24 h，乙醇梯度脫水后進行石蠟包埋與蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察耳組織病理變化。

2.4 血清中炎癥因子及生化指標(biāo)檢測

取各組小鼠全血，室溫靜置2 h，3000 r/min離心15 min后收集血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平，通過全自動血清生化分析儀測定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性及三酰甘油（triglycerides，TG）、肌酐（creatinine，CRE）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。

2.5 肌肉組織AFP水平測定

剪取各組小鼠大腿兩側(cè)肌肉組織，PBS緩沖液沖洗后，用濾紙吸干表面水分，置于10 mL的離心管中，加入9倍量PBS緩沖液，制備組織勻漿，5000 r/min離心10 min后取上清液，按ELISA試劑盒說明書測定肌肉組織中AFP水平。

2.6 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量變化的影響

如圖1所示，各組小鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異。荊防顆粒高、中劑量組小鼠體質(zhì)量增長較為緩慢，而荊防顆粒低劑量組小鼠體質(zhì)量增長較為迅速，且荊防顆粒組較對照組體質(zhì)量變化較為平穩(wěn)。

3.2 荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)的小鼠臟器指數(shù)的影響

在寒冷應(yīng)激條件下，心、肺等重要臟器的核心體溫必須經(jīng)常維持在37.2 ℃，對于保證人體正常的生化反應(yīng)具有重要作用。臟器指數(shù)可客觀反映相關(guān)臟器的功能，是實驗動物重要的生物學(xué)指標(biāo)之一[6]。如表1所示，各組小鼠心、肺臟器指數(shù)無顯著性差異，表明寒冷刺激對小鼠心、肺臟器指數(shù)的影響并不顯著。

圖1 荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量的影響(, n = 8)

3.3 荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)的小鼠耳組織外觀形態(tài)及病理變化的影響

小鼠的耳組織幾乎無被毛覆蓋，主要由軟骨組織構(gòu)成，在受到刺激時容易造成損傷，且容易被觀察。如圖2所示，模型組小鼠耳尖出現(xiàn)糜爛、出血，局部血管擴張，病灶邊界清楚。與模型組比較，給予荊防顆粒后，小鼠耳部凍傷癥狀均有不同程度減輕。表明荊防顆粒減輕了寒冷刺激誘導(dǎo)的小鼠耳組織損傷程度。

如圖3所示，與對照組比較，模型組小鼠耳組織有明顯水腫，組織壁增厚，細胞間質(zhì)大量炎性細胞浸潤，且有明顯的微灶出血。給予荊防顆粒后，小鼠耳組織炎癥、水腫以及出血等病理損傷情況均有不同程度的改善，表明荊防顆?？梢酝ㄟ^減輕寒冷對耳組織造成的刺激從而保護耳組織，其中荊防顆粒低劑量組效果最好。

表1 荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)的小鼠臟器指數(shù)的影響(, n = 8)

圖2 各組小鼠耳組織外觀形態(tài)圖

紅色箭頭代表炎性細胞，紅色圓圈代表出血點，紅色方框代表增厚的組織壁

3.4 荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)的小鼠血清中炎癥因子水平的影響

在寒冷刺激狀態(tài)下機體會出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。表明荊防顆粒能夠減輕寒冷導(dǎo)致的炎癥性損傷，且各劑量的荊防顆粒抑制炎癥損傷的作用相當(dāng)。

3.5 荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)的小鼠血清中ALT、AST活性及TG、BUN、CRE水平的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中BUN水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，荊防顆粒低劑量組小鼠血清中BUN水平顯著降低（＜0.05），其余指標(biāo)各組之間均無明顯差異。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

表2 荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)的小鼠血清中ALT、AST活性及TG、BUN、CRE水平的影響(, n = 8)

與對照組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05

#< 0.05control group;*< 0.05model group

3.6 荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)的小鼠肌肉組織中AFP水平的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠肌肉組織中AFP水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠肌肉組織中AFP水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖5 荊防顆粒對寒冷刺激誘導(dǎo)的小鼠肌肉組織中AFP水平的影響(, n = 8)

4 討論

荊防敗毒散應(yīng)用歷史悠久，臨床記載頗多。該方味辛性平，處方嚴(yán)謹(jǐn)。方中荊芥辛溫，氣味芳香質(zhì)輕透散，驅(qū)肌膚風(fēng)寒之邪，防風(fēng)辛溫而甘，散骨肉風(fēng)寒之痹，2藥相伍共散表里之邪；羌活、獨活皆為辛溫之品，羌活入太陽之經(jīng)，善透游走之風(fēng)；獨活入少陰之脈，能移入里之寒，4藥相伍則內(nèi)外動靜之邪可除，上4味共為主藥。茯苓、甘草補氣健脾，使水濕得化，正氣得充。桔梗、枳殼、前胡、柴胡使氣血暢行無阻。生姜助以解表，薄荷防邪化熱，共為使藥[7]。全方合用共奏驅(qū)風(fēng)散寒、宣疏解表之功。全方之氣又以“平”性為主，“平而不凡，卓而有度”，拓寬了該方的臨床適應(yīng)證和受眾人群。因此荊防敗毒散具有巨大的臨床潛在應(yīng)用價值。荊防顆粒作為荊防敗毒散的中成藥顆粒制劑，在臨床中應(yīng)用廣泛，其簡便、易于保存和運輸，本研究選用荊防顆粒浸膏探討其對寒冷刺激致小鼠機體損傷的保護作用來拓展荊防顆粒的臨床應(yīng)用。

本研究中各組小鼠的體質(zhì)量變化無顯著性差異，但荊防顆粒組的小鼠體質(zhì)量變化較為平穩(wěn)，可能的原因為荊防顆粒能夠減少寒冷對小鼠的刺激從而使其體質(zhì)量波動不大，同時荊防顆粒低劑量組小鼠體質(zhì)量增長迅速也提示該劑量的藥物能更好地幫助小鼠抵抗寒冷的刺激，對小鼠進食進水的狀況影響較小，更加有利于體質(zhì)量的穩(wěn)定增長。而心、肺對于維持人的核心體溫，保證機體的生理生化反應(yīng)以及進行正常的神經(jīng)傳導(dǎo)具有重要作用[1]，各組小鼠心、肺臟器指數(shù)無顯著性差異，表明寒冷刺激對心、肺臟器的影響不大。

寒冷刺激會造成機體損傷，同時在復(fù)溫和復(fù)凍過程中會引起組織充血水腫，甚至糜爛壞死，同時血管的收縮和舒張會損傷內(nèi)皮，造成血栓加劇組織損傷的程度[8-10]。小鼠耳組織外觀形態(tài)及病理切片結(jié)果表明荊防顆?？梢悦黠@改善寒冷刺激造成的組織損傷，具有保護作用。正常生理情況下，人體處于炎癥與抗炎動態(tài)平衡狀態(tài)，而在寒冷應(yīng)激時，促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高。在艾葉炭抗凍能力研究中，小鼠冰水浴后血清中IL-1β、TNF-α水平顯著升高[5]；同時有研究證實寒冷刺激會增加血清中IL-6、TNF-α的水平[11]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯高于對照組，而荊防顆粒各劑量組小鼠血清中炎癥因子水平顯著降低。表明荊防顆?？梢詼p輕小鼠寒冷應(yīng)激過程中的炎癥反應(yīng)，減少寒冷刺激對機體的損傷。

動物在受到寒冷應(yīng)激后，生理代謝過程有機地發(fā)生變化。氧化過程加強，產(chǎn)熱增加，某些蛋白質(zhì)也被分解供能[12]，由于ALT和AST參與機體內(nèi)轉(zhuǎn)氨基作用，可反映蛋白質(zhì)合成和分解代謝的狀況。BUN是蛋白質(zhì)代謝后產(chǎn)生的廢物，機體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝良好則血清中BUN含量降低；反之則升高[13]。而CRE代表蛋白質(zhì)被分解的程度，含量越高，蛋白質(zhì)被分解得越多[14]。TG的水平則反映脂質(zhì)代謝的情況。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過冷刺激后小鼠血清中ALT、AST活性及TG、BUN、CRE水平降低，表明在寒冷刺激的條件下，小鼠體內(nèi)某些蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的分解減少，同時代謝產(chǎn)物減少，經(jīng)過荊防顆粒干預(yù)后，高劑量的荊防顆粒可增加蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的分解供能。

AFP是生物體為抵御低溫凍害而進化出的一類蛋白質(zhì)，是一種高效的生物抗凍劑[15-16]，最初被應(yīng)用于保存食品或生物標(biāo)本[17]，后逐漸應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。有研究報道在寒冷或冰凍環(huán)境中的生物體內(nèi)AFP含量豐富，這些蛋白質(zhì)以非依從性方式減少寒冷引起的損傷[18-19]。AFP與細胞膜相互作用，穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)和細胞功能，能夠有效地防止細胞在冷凍解凍中的損傷[20]。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠的抗寒能力強于非轉(zhuǎn)基因小鼠[21]，表明AFP有助于生物體抵御寒冷刺激。肌肉在寒冷應(yīng)激中具有重要作用[22]，本研究測定了肌肉組織中AFP水平，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，模型組小鼠肌肉組織中AFP水平顯著降低，給予荊防顆粒干預(yù)后，AFP水平顯著升高。提示荊防顆?？梢酝ㄟ^促進小鼠AFP表達發(fā)揮保護作用，且低劑量荊防顆粒保護作用最佳。

本研究發(fā)現(xiàn)荊防顆粒對寒冷誘導(dǎo)的機體損傷具有很好的保護作用，并初步探討其發(fā)揮藥效的可能作用機制。此研究尊古而又拓古，臨床可將此方進行預(yù)防性給藥減輕寒冷導(dǎo)致的機體損傷。同時荊防敗毒散因其輕巧透散、藥性平和，臨床適用人群廣泛。因此，本研究為拓寬荊防敗毒散的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)，對指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Protective effect of Jingfang Granules on cold-induced injury in mice

ZHAO Ya-fang1, JIANG Yu-qiao1, LI Yu-ru2, CHENG Guo-liang1, WANG En-li3, TAN Yu-jun3, YAO Jing-chun3, ZHAO Yan1, ZHANG Gui-min3

1. School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 3. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276000, China

To study the protective effect and mechanism of Jingfang Granules (荊防顆粒) on body injury induced by cold stimulation in mice.Male Kunming mice were randomly divided into control group, model group and Jingfang Granules high-, medium- and low-dose (16, 8, 4 g/kg) groups, with eight mice in each group. Mice were given corresponding drugs for 7 d, and body injury model was established by ice water bath for cold stimulation every day. Body weight of mice was measured every day, and organ index was measured and calculated after the experiment; The appearance and pathological damage of ear tissue were observed; The activities of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and levels of triglycerides (TG), creatinine (CRE), blood urea nitrogen (BUN), interleukin-6 (IL-6), IL-1β, tumor necrosis factor-α (TNF-α) in serum were detected; The level of antifreeze protein (AFP) in muscle tissue was detected.After Jingfang Granules intervention, there was no significant difference in body weight of mice in each group, and body weight change was relatively stable. The body weight of mice in Jingfang Granules low-dose group was rapidly increased, and organ index had no significant difference; The results of ear tissue appearance and pathological section showed that the degree of injury induced by cold stimulation in mice was reduced; IL-6, IL-1β, TNF-α and BUN levels in serum were decreased (< 0.05, 0.01); The level of AFP in muscle tissue was increased (< 0.05, 0.01).Jingfang Granules has protective effect on body injury induced by cold stimulation, and its mechanism is related to inhibition of inflammatory reaction and increasing of AFP level.

Jingfang Granules; cold stimulation; body injury; inflammation; antifreeze protein

R285.5

A

0253 - 2670(2022)23 - 7455 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.016

2022-08-31

荊防顆粒二次開發(fā)研究項目（2180071720113）

趙亞芳，女，博士研究生。E-mail: zyf2640594023@163.com

通信作者：趙 琰（1973—），女，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向為經(jīng)典方劑的配伍與應(yīng)用。Tel: (010)64286705 E-mail: zhaoyandr@bucm.edu.cn

張貴民（1969—），男，工程碩士，工程應(yīng)用研究員，研究方向為新藥研發(fā)。Tel: (010)64286705 E-mail: lunanzhangguimin@163.com

共同第一作者：姜雨喬，女，碩士研究生。E-mail: 838140387@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]