秦艽WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學分析

何懿菡，尹洋洋，胡 偉，李 鉑，孫曉春，王 楠，黃文靜，岳正剛

? 藥材與資源?

秦艽WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族生物信息學分析

何懿菡，尹洋洋，胡 偉，李 鉑，孫曉春，王 楠，黃文靜，岳正剛*

陜西中醫(yī)藥大學陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心秦藥資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育），陜西 咸陽 712046

利用生信技術(shù)分析秦艽WRKY家族，為進一步研究GmWRKY轉(zhuǎn)錄因子對秦艽次生代謝產(chǎn)物生物合成的分子調(diào)控機制提供信息?；谇剀崔D(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果挖掘WRKY家族成員，通過NCBI-tBlastx和SMART保守結(jié)構(gòu)域預測進一步篩選得到41條WRKY序列并進行生信分析?；趃etorf預測開放閱讀框（open reading frame，ORF）區(qū)，對41條序列的ORF片段進行MEME保守基序分析和ClustalW比對，采用MEGAX構(gòu)建鄰接法（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹。利用Omicshare GO對41個WRKY成員進行富集分析，利用String進行WRKY成員蛋白互作網(wǎng)絡預測分析。通過轉(zhuǎn)錄組FPKM值對成員的基因表達情況進行熱圖分析，并對蛋白互作核心成員進行基因相對表達分析。41個秦艽WRKY成員中大部分成員的保守基序為“WRKYGQK”，僅GmWRKY27保守基序發(fā)生氨基酸突變，為“WRKYGKK”。依據(jù)WRKY特征結(jié)構(gòu)域?qū)?1條序列的51個結(jié)構(gòu)域分為3大類和8個亞類型，第I大類為氮端（N）和碳端（C），第II大類下設(shè)5個亞類型，以及第III大類；此外，系統(tǒng)進化樹可將51個WRKY結(jié)構(gòu)域分成4大組，Group I [I(N)]、GroupII（IIa＋IIb）、GroupIII [I(C)＋IIc]、GroupIV（IId＋IIe和III），該結(jié)果與經(jīng)典的WRKY家族分類特點基本一致。GO分析發(fā)現(xiàn)秦艽WRKY家族成員廣泛參與代謝調(diào)控過程。當茉莉酸甲酯（jasmonic acid methyl ester，MeJA）誘導秦艽后，蛋白網(wǎng)絡互作的核心成員GmWRKY1和GmWRKY17表達顯著提高，推測這些WRKY成員與秦艽次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控關(guān)系密切。為進一步開展秦艽WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能研究奠定基礎(chǔ)。

秦艽；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學；轉(zhuǎn)錄組分析；次生代謝產(chǎn)物

秦艽Pall.為“秦藥”大宗道地中藥材，是龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬L. 的一種多年生草本植物，以干燥根入藥，具有祛風濕、清溫熱、止痹痛、退虛熱之功效[1-2]，其主要的次生代謝產(chǎn)物是以龍膽苦苷（gentiopicroside）為代表的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物[3]，這類化合物是秦艽發(fā)揮臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是評價秦艽藥材質(zhì)量的重要指標[4]。

植物次生代謝產(chǎn)物也稱“植保素”，是植物為了適應環(huán)境脅迫而產(chǎn)生的物質(zhì)[5]。當植物受到外界脅迫后，體內(nèi)會有一系列信號連鎖反應，其中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是細胞內(nèi)部調(diào)控網(wǎng)絡中的重要一環(huán)，而轉(zhuǎn)錄因子能夠通過協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄酶與DNA模板的相互作用，來激活或抑制下游基因的表達[6]。WRKY是植物中重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，可參與植物的生長發(fā)育[7]，調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成[8]，以及響應各種生物和非生物脅迫[9]等生物進程。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控藥用植物次生代謝產(chǎn)物生物合成是當前研究的熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)，過表達可促進丹參毛狀根中丹參酮含量的積累，其主要通過激活丹參酮合成途徑酶關(guān)鍵基因來提高丹參酮的合成[10]。人參基因可響應病原菌的誘導，同時過表達基因可顯著提高人參皂苷含量[11]。過表達基因可將短小蛇根草中喜樹堿的含量提高3倍，干涉基因則顯著降低喜樹堿的含量[12]。過表達長春花基因可以顯著提高代謝途徑的關(guān)鍵酶基因色氨酸脫羧酶和轉(zhuǎn)錄抑制因子ZCT的表達，并抑制轉(zhuǎn)錄激活因子ORCA2、ORCA3和CrMYC2，從而使長春花轉(zhuǎn)基因毛狀根中的蛇根堿含量顯著增加[13]。這些研究都表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物代謝產(chǎn)物積累中發(fā)揮著重要的作用。

本研究建立在秦艽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因表達水平、轉(zhuǎn)錄因子蛋白互作等方面進行了分析，為后期研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控秦艽次生代謝產(chǎn)物的機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

樣品采自甘肅慶陽正寧縣由陜西中醫(yī)藥大學李鉑教授鑒定為秦艽Pall.的種子，于溫室撒播種子給予16 h 光照，8 h 黑暗處理，覆膜出苗后培養(yǎng)一年生用于試驗。多通道熒光定量PCR儀qTOWER 2.0（德國耶拿公司）。

2 方法

2.1 秦艽WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定

研究前期以50 μmol/L檸檬酸銨（ammonium citrate，AC）、200 μmol/L茉莉酸甲酯（jasmonic acid methyl ester，MeJA）為誘導子，水處理為對照分別處理秦艽幼苗6 h，送于深圳千年基因（Macrogen公司，中國）完成秦艽轉(zhuǎn)錄組測序和分析。本研究基于轉(zhuǎn)錄組基因注釋結(jié)果，初步篩得74條潛在的秦艽基因，逐條進行NCBI-tBlastx序列相似度比對，參數(shù)為默認，以判定序列確為WRKY家族。并進一步利用SMART數(shù)據(jù)庫（http://smart. embl.de/）比較序列家族特征，去掉WRKY結(jié)構(gòu)域不完整的序列，最終篩選得到41條基因。

2.2 GmWRKY保守基序分析、蛋白多重比對以及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

首先利用getorf（http://emboss.bioinformatics.nl/ cgi-bin/emboss/getorf）在線分析41條序列的開放閱讀框（open reading frame，ORF）區(qū)，并選擇含有WRKY基序的ORF長片段。隨后，通過MEME在線軟件（https://meme-suite.org/meme/）對秦艽WRKY蛋白序列進行保守基序鑒定，參數(shù)選擇分析3個保守區(qū)。利用MEGAX[14]對秦艽WRKY家族序列的ORF區(qū)域進行ClustalW比對，選取保守區(qū)，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，Bootstrap檢測值為1000，其他使用參數(shù)均為默認值。

2.3 GmWRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員（GO）注釋及蛋白質(zhì)網(wǎng)絡互作

利用Omicshare GO富集分析工具建立WRKY家族轉(zhuǎn)錄組注釋信息。利用String蛋白互作數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org/）對秦艽WRKY蛋白進行互作網(wǎng)絡預測分析，選擇擬南芥為參考物種。并利用Cytoscape 3.8.0[15]對互作結(jié)果進行視圖優(yōu)化。

2.4 GmWRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的表達分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘MeJA、AC和對照組的GmWRKY轉(zhuǎn)錄因子的FPKM值，用Omicshare熱圖分析工具對FPKM值進行聚類分析和可視化，分析類型選pearson。

對蛋白互作網(wǎng)絡核心成員和進行基因相對表達分析，為內(nèi)參[16]，引物信息見表1。用200 μmol/L MeJA和對照水分別噴施處理秦艽幼苗6 h，收集對照和處理組的葉，重復3組，分別提取RNA，對1%凝膠電泳和Nanodrop檢測合格的RNA用于后續(xù)的定量實驗。使用德國耶拿熒光定量梯度PCR儀qTOWER 2.0，反應條件為95 ℃、30 s預變性，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán)。利用2?ΔΔCt計算基因相對表達水平[17]。

表1 實時熒光定量基因表達序列引物

3 結(jié)果

3.1 GmWRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定

在秦艽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有74條基因被注釋為秦艽基因，序列最短為209 bp，最長為2671 bp。通過對74條基因逐條進行NCBI-tBlastx比對，初步判定序列均為WRKY家族成員，但因部分序列信息不完整，結(jié)構(gòu)域缺失，結(jié)合在線軟件SMART分析結(jié)果，去除保守結(jié)構(gòu)域不完整的序列，將明確具有WRKY保守結(jié)構(gòu)域的41條序列列為秦艽WRKY家族成員，并依次命名為GmWRKY1～GmWRKY41，作為后續(xù)研究的對象。

3.2 GmWRKY家族成員蛋白質(zhì)保守區(qū)分析

使用在線軟件MEME分析41條秦艽WRKY家族蛋白的保守基序，經(jīng)分析比對后3個保守區(qū)Motif1、Motif2、Motif3的基序長度分別為29、29、50個氨基酸。其中，Motif 1和Motif 3是基因的七肽保守序列，Motif 2是秦艽基因的特征基序（圖1）。41條序列中，其中34條序列包含Motif1和Motif2，這34條序列中又有10條序列含Motif3。此外，GmWRKY7、24、29和31只含有1個保守區(qū)Motif1；GmWRKY16、26和30只含有1個保守區(qū)Motif2。

圖1 秦艽41個WRKY家族成員蛋白保守基序分析

3.3 蛋白質(zhì)序列比對及系統(tǒng)進化分析

多重序列比對分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)41個GmWRKY蛋白均含有完整的結(jié)構(gòu)域核心序列（圖2）。大部分序列具有WRKY家族的保守基序“WRKYGQK”，僅GmWRKY27蛋白保守基序中的“Q”變成“K”。依據(jù)WRKY家族的結(jié)構(gòu)特征，將41個WRKY蛋白分為3大類，其中10個蛋白為第I類，該類蛋白含有2個“WRKYGQK”序列，分別位于序列的N端和C端，以及C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)。第II類有23個蛋白，特點是含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，該大類可根據(jù)序列差異可進一步細化為5個小類，即IIa～IIe。第III類有6個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型。GmWRKY7和GmWRKY16與其他家族成員之間的保守氨基酸位點存在較大差異，分類不明確。

基于MEGAX比對秦艽41個WRKY家族成員的51個WRKY保守域，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，其結(jié)果與保守結(jié)構(gòu)域分類情況基本一致。系統(tǒng)進化樹可將秦艽的3大類WRKY家族成員分為4大組（圖3），Group1 [I (N)]、Group2 [IIc+I(C)]、Group3（IIa＋IIb）、Group4（IId＋IIe和III）。其中，Group2與Group1親緣關(guān)系較近，聚為一大支。Group3與Group4親緣關(guān)系近，被聚為另一大支。對于分類不明確的GmWRKY7和GmWRKY16分別聚類到了I（C）和I（N），與第I類親緣關(guān)系較近。

紅色方框表示W(wǎng)RKY核心結(jié)構(gòu)域，紅色方框＋ 表示鋅指結(jié)構(gòu)；I類的2個WRKY結(jié)構(gòu)域，分別標識為“N”和“C”端

圖3 WRKY家族的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.4 GmWRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員GO注釋

基于轉(zhuǎn)錄組GO數(shù)據(jù)庫信息，對秦艽WRKY轉(zhuǎn)錄因子進行功能注釋。對于大部分秦艽基因在GO的二級分類的生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3個大類中得到注釋（圖4）。在生物過程中細胞過程（cellular process）和代謝過程（metabolic process）富集了40條序列信息。在細胞組分中有40條可富集于細胞（cell）、細胞部分（cell part）和細胞器（organelle）。分子功能中有40條序列可富集于綁定（binding）和核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（Nucleic acid binding transcription factor activity）。

圖4 秦艽WRKY家族成員的GO注釋信息

3.5 GmWRKY蛋白互作網(wǎng)絡預測

基于String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建了秦艽41條WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的蛋白互作網(wǎng)絡，去除沒有相互關(guān)系作用的成員，秦艽WRKY家族中的11個成員間有蛋白質(zhì)互作的關(guān)系（圖5）。可依據(jù)相互作用分為3塊互作網(wǎng)絡。其中，GmWRKY1、GmWRKY17、GmWRKY25和GmWRKY15為互作網(wǎng)絡中的4個主要中心節(jié)點，相互作用關(guān)系最強。這4個主要中心節(jié)點與GmWRKY31、GmWRKY13和GmWRKY28之間也存在著相互作用關(guān)系。GmWRKY4和GmWRKY16，GmWRKY39、GmWRKY19和GmWRKY41為2塊具有獨立互作的蛋白網(wǎng)絡。

圖5 秦艽WRKY家族成員的蛋白互作網(wǎng)絡

3.6 GmWRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員表達模式分析

基于秦艽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的FPKM值，對WRKY基因在MeJA和AC誘導后的表達水平差異進行熱圖分析，和對照（CK）相比，41條GmWRKY家族成員受誘導調(diào)控顯著，且不同成員對于MeJA和AC誘導響應強度不同（圖6）。基因表達聚類結(jié)果顯示，至，和對照相比，MeJA誘導后表達明顯降低。至在MeJA和AC誘導后普遍降低。至在MeJA和AC誘導后普遍升高。至在AC誘導后表達顯著升高。至在AC誘導后表達顯著升高，而對MeJA誘導響應不強。至，和對照相比，MeJA誘導后表達明顯升高而AC誘導后表達普遍降低。

圖6 基于轉(zhuǎn)錄組FPKM值分析秦艽GmWRKY基因表達差異

以秦艽WRKY家族成員蛋白互作網(wǎng)絡關(guān)系最強的4個節(jié)點GmWRKY1、GmWRKY17、GmWRKY25和GmWRKY15進行qRT-PCR基因表達分析（圖7）。當秦艽受到MeJA誘導后，葉中表達量顯著升高，其次是，和差異不顯著。

4 討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族因N端包含高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域“WRKYGQK”而得名，該結(jié)構(gòu)域能專一地與靶基因啟動子區(qū)中的W盒（TTGACC/T）序列結(jié)合，激活或抑制基因的表達，進而調(diào)控植物的生長代謝，參與響應應激等各種生理活動[18]。秦艽41條GmWRKY家族成員WRKY結(jié)構(gòu)域保守，大部分為“WRKYGQK”，僅GmWRKY27突變?yōu)椤癢RKYGKK”。在丹參、水稻、擬南芥等物種中也發(fā)現(xiàn)了類似的突變體，這種突變的產(chǎn)生也可能與物種長期進化有關(guān)[19]。有研究發(fā)現(xiàn)突變基序中谷氨酰胺（glutamine，G）氨基酸的突變會降低保守基序與DNA結(jié)合的能力[20]。對于WRKY結(jié)構(gòu)域突變體的進化事件、以及突變體參與植物代謝調(diào)控的機制還需要進一步的研究。

不同字母表示差異顯著P＜0.05

Eulgem等[21]依據(jù)WRKY家族成員的結(jié)構(gòu)特點將其分為3大類型I（N端＋C端）、II（a、b、c、d、e）和III。本研究對GmWRKY蛋白家族成員進行多重比對、保守基序分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)秦艽WRKY家族成員也符合該分類特點，這些結(jié)果表明，不同物種的WRKY結(jié)構(gòu)保守，功能可能也會比較相似。此外，系統(tǒng)進化樹依據(jù)親緣關(guān)系將GmWRKY保守域分為2大支，4大組。II類型的WRKY成員不單獨分為一類，說明其并不是單系起源，且具有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域基因的C端可能是具有一個WRKY域編碼基因的祖先[22]。有研究發(fā)現(xiàn)許多來自不同系統(tǒng)發(fā)育群的基因參與植物響應同樣的脅迫應激，說明WRKY家族可廣泛參與植物的各種生理代謝調(diào)控網(wǎng)絡，對WRKY家族的起源、進化關(guān)系的了解可以為其功能的研究提供有價值的信息[22]。

隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多藥用植物的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族被挖掘和研究。WRKY家族在陽春砂和丹參中被挖掘，并預測了參與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子[23-24]。在紅豆杉中挖掘了61條WRKY家族，并發(fā)現(xiàn)過表達WRKY成員能夠提高目標藥用成分的含量[25]。本研究基于秦艽轉(zhuǎn)錄組挖掘了41條WRKY轉(zhuǎn)錄因子，通過GO數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)這些家族成員中有40條具有與核酸結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性，并廣泛參與代謝調(diào)控過程?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基因表達熱圖顯示，WRKY成員對MeJA和AC的響應強度不同，推測不同成員在植物體內(nèi)參與代謝調(diào)控的方式可能存在差異。此外，網(wǎng)絡互作中的核心成員在受到MeJA誘導后基因表達均有所升高，其中和升高最為顯著，推測這些WRKY成員與秦艽次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控關(guān)系密切。對秦艽WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的分析將為進一步研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類代謝產(chǎn)物合成途徑奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Bioinformatics analysis of WRKY transcription factor family of

HE Yi-han, YIN Yang-yang, HU Wei, LI Bo, SUN Xiao-chun, WANG Nan, HUANG Wen-jing, YUE Zheng-gang

State Key Laboratory of Research & Development of Characteristic Qin Medicine Resources (Cultivation), Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Shaanxi university of Chinese, Xianyang 712046, China

To analyze theWRKY family of(GmWRKY) using biotransformation techniques in order to provide information for further research on the molecular regulation mechanism of GmWRKY transcription factor on the biosynthesis of the secondary metabolites of.Based on the annotation results of WRKY family members, 41 WRKY sequences were further screened by NCBI-tBLastx and SMART domains for bioinformatics analysis. Based on getorf prediction of open reading frame (ORF) region, MEME conservative motif analysis and ClustalW alignment were performed on ORF fragments of 41 sequences, and the neighbor-joining (NJ) phylogenetic tree was constructed by MEGAX. The enrichment analysis of 41 WRKY members was performed using Omicshare GO. And prediction analysis of WRKY member protein interaction network was performed by String. The expression of WRKY members was analyzed by heat map based on the FPKM value of the transcriptome, and the relative gene expression of the core members of GmWRKY protein interaction was analyzed.Most of the 41 GmWRKY members had a conserved motif of "WRKYGQK", and only THE GmWRKY27 conserved motif had an amino acid mutation of "WRKYGKK". According to the WRKY characteristic domain, 51 domains of 41 sequences were divided into three categories and eight subtypes. The first category consisted of nitrogen terminal (N) and carbon terminal (C), the second category consisted of 5 subtypes and the third category. Phylogenetic tree can divide 51 WRKY domains into four groups: GroupI [I(N)], GroupII (IIa+IIb), GroupIII [I(C)+IIc], GroupIV (IId+IIe and III). These results were consistent with the classic WRKY family classification. GO analysis revealed that members of the GmWRKY family were extensively involved in metabolic regulation. The expression ofand, the core members of protein network interaction, were significantly increased whenwas induced by MeJA, suggesting that these WRKY members were closely related to the regulation of secondary metabolites of.This study can lay a foundation for further research on the function of GmWRKY transcription factors..

Pall.; WRKY transcription factors; bioinformatics analysis; transcriptome analysis; secondary metabolites

R286.12

A

0253 - 2670(2022)23 - 7499 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.021

2022-05-06

國家自然科學基金項目（81903753）；陜西中醫(yī)藥大學科學基金項目（2017PY06）

何懿菡，講師，研究方向為藥用植物資源及次生代謝產(chǎn)物調(diào)控。Tel: (029)38183207 E-mail: annaaid@126.com

通信作者：岳正剛，副教授，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。Tel: (029)38183301 E-mail: liuxingjian1981@163.com

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