基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和睪丸間質(zhì)細(xì)胞模型探討恩施巴戟促進(jìn)睪酮分泌的作用機(jī)制

朱成姍，李子寒，彭洪兵，尹 聰，李 娟，陳科力，肖 凌，聶 晶，劉義梅*

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和睪丸間質(zhì)細(xì)胞模型探討恩施巴戟促進(jìn)睪酮分泌的作用機(jī)制

朱成姍1，李子寒1，彭洪兵1，尹 聰1，李 娟1，陳科力1，肖 凌2，聶 晶2，劉義梅1*

1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065 2. 湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430075

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和睪丸間質(zhì)細(xì)胞模型探究恩施巴戟對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響和潛在作用機(jī)制。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接預(yù)測(cè)恩施巴戟治療睪酮缺乏癥的主要作用靶點(diǎn)及通路；通過LC-MS/MS技術(shù)分析恩施巴戟主要化學(xué)成分；構(gòu)建睪丸間質(zhì)細(xì)胞模型，采用MTT法檢測(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的存活率，采用ELISA法檢測(cè)睪酮分泌量，采用qRT-PCR檢測(cè)睪酮合成和凋亡相關(guān)基因表達(dá)，采用Western blotting檢測(cè)睪酮合成蛋白表達(dá)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接結(jié)果顯示，恩施巴戟主要通過絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）等靶點(diǎn)和環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、MAPK、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等信號(hào)通路發(fā)揮作用，水晶蘭苷為其主要有效成分。LC-MS/MS分析和睪丸間質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)分析，恩施巴戟提取物和水晶蘭苷均具有促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和睪酮分泌的作用，其作用機(jī)制與促進(jìn)類固醇生成急性調(diào)控蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，）、膽固醇側(cè)鏈裂解酶（cholesterol side-chain cleavage enzyme，）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，）/Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，）mRNA表達(dá)（＜0.05、0.01）并促進(jìn)StAR蛋白表達(dá)有關(guān)（＜0.01）。恩施巴戟具有促進(jìn)睪酮分泌的作用，水晶蘭苷為其主要活性成分，其作用機(jī)制與作用于MAPK、PI3K/Akt通路調(diào)控睪酮合成有關(guān)。

恩施巴戟；水晶蘭苷；睪丸間質(zhì)細(xì)胞；睪酮缺乏癥；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；睪酮合成

睪酮是雄性生殖系統(tǒng)分化發(fā)育的重要物質(zhì)、可促進(jìn)精子的發(fā)生、成熟及蛋白質(zhì)的合成[1]。任何因素導(dǎo)致睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少或活性下降將引起雄激素合成量不足。如睪丸間質(zhì)細(xì)胞的過量凋亡，使睪酮的分泌量明顯下降，進(jìn)而促進(jìn)生精細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致男性不育[2]。睪酮缺乏癥是指生物學(xué)上缺乏睪丸激素和精子產(chǎn)生從而導(dǎo)致性腺軸功能減退的一種癥狀[3]?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為性腺軸功能衰退與腎虛證關(guān)系密切，尤其是男性睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能衰退[4]。采用補(bǔ)腎法可以升高腎虛證患者血清睪酮水平[5]，從而治療此類疾病。臨床有關(guān)生殖系統(tǒng)的腎陽虛證通常采用補(bǔ)腎壯陽類中藥如巴戟天、淫羊藿等，藥理實(shí)驗(yàn)表明這些補(bǔ)腎壯陽類中藥對(duì)睪酮的合成與分泌均有調(diào)節(jié)作用。因此補(bǔ)腎壯陽類藥物用于睪酮缺乏癥治療具有重要意義。

恩施巴戟為茜草科植物四川虎刺Huang的干燥根[6]，又名湖北巴戟天，是湖北省土家族習(xí)用的補(bǔ)腎壯陽類藥材，主要用于治療腎虛腰痛、陽痿遺精等。其肉質(zhì)、鏈珠狀根與巴戟天相似，且在成分和功效上有諸多相似之處[7]。因其臨床療效確切、有一定的資源量，將其收入湖北省食品藥品監(jiān)督管理局組織制定的湖北省地方習(xí)用藥材第一部技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)《湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2009年版，并保留于2018年版。藥理研究表明，恩施巴戟能夠促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)，增強(qiáng)小鼠抗疲勞能力，并且具有助陽作用[8]。據(jù)報(bào)道，恩施巴戟的主要成分為蒽醌類、環(huán)烯醚萜類、多糖類等，其中環(huán)烯醚萜類成分在改善腎陽虛證過程中發(fā)揮重要作用[9]，其中水晶蘭苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)可至1.872%，為恩施巴戟的主要成分[10]。同時(shí)，本課題組在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)恩施巴戟提取物能夠提高小鼠血清中睪酮的含量，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[11]和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)其治療睪酮缺乏癥的靶點(diǎn)、活性成分和分子機(jī)制，并采用LC-MS/MS技術(shù)和體外大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞模型進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，為恩施巴戟的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（鄂）2020-0018。所有大鼠均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)，溫度20～24 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，明暗循環(huán)12 h。本研究的實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)SYXK2017-0067）。

1.2 藥材

恩施巴戟采于湖北省恩施土家族苗族自治州咸豐縣高樂鎮(zhèn)田壩村，經(jīng)湖北省中醫(yī)藥大學(xué)劉義梅教授鑒定為茜草科植物四川虎刺Huang的干燥根。

1.3 藥品與試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基（批號(hào)WH0021K191）購自Procell公司；MTT（批號(hào)MKBL6647V）購自美國Sigma公司；膠原酶I（批號(hào)I1904MG100）購自BioFRoxx公司；胎牛血清（批號(hào)21110704）購自浙江天杭生物科技股份有限公司；馬血清（批號(hào)SH3007402）購自Hyclone公司；雙抗（批號(hào)MA0110）、Western及IP細(xì)胞裂解液（批號(hào)MB9900）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；2.5%胰酶（批號(hào)2323073）購自美國Gibco公司；Percoll分離液（批號(hào)69120070）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)BL521A）購自Biosharp公司；水晶蘭苷對(duì)照品（批號(hào)5945-50-6，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；Forskolin（Fsk，批號(hào)GC11920）購自Glpbio Technology公司；睪酮ELISA試劑盒（批號(hào)20220106）購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑（批號(hào)W9712）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)W0106）、Real Universal彩色熒光定量預(yù)混試劑SYBR Green（批號(hào)S7918）購自天根生化科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、類固醇生成急性調(diào)控蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，）、膽固醇側(cè)鏈裂解酶（cholesterol side-chain cleavage enzyme，）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，）引物由生工生物工程股份有限公司合成；GAPDH抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自Servicebio公司；Star抗體購自ABclonal公司。

1.4 儀器

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州郎越儀器制造有限公司）；Synergy 2型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；BNP-80CH型CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；IX-73型熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；LightCycler 480II型熒光定量PCR儀（羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）；Xevo G2-XS QTOF飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；PowerPacTM Basic型電泳儀、Mini Trans-Blot Cell型蛋白轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad公司）；FCQ型熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（上海普諾森生物科技）。

2 方法

2.1 恩施巴戟的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

查閱文獻(xiàn)，將所獲得的恩施巴戟中的化學(xué)成分，通過數(shù)據(jù)庫PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）確認(rèn)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入到SwissTargetPrediction（http:// www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，在Uniprot（https://www.uniprot.org/）中校正靶點(diǎn)。再通過TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https://www. drugbank.ca/）、GeneCards（https://www.genecards. org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/home/）等與疾病靶點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，獲得睪酮缺乏癥相關(guān)的靶點(diǎn)。

將以上2種靶點(diǎn)導(dǎo)入韋恩圖工具（http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中取交集，用STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）將蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）綜合得分＞0.9作為篩選條件，利用Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出潛在靶點(diǎn)。將化學(xué)成分與潛在作用靶點(diǎn)構(gòu)建“活性成分-核心靶點(diǎn)”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖，然后根據(jù)DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david. ncifcrf.gov/）進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2.2 恩施巴戟活性成分與潛在靶點(diǎn)分子對(duì)接

分別在TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://tcmsp-e.com/）和PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載活性成分和潛在靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，然后用AutoDockTools1.5.7軟件對(duì)蛋白進(jìn)行去水、加氫等處理，利用插件“autogrid”及“autodock”進(jìn)行活性位點(diǎn)對(duì)接，并計(jì)算結(jié)合能來評(píng)估活性成分與潛在靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性，最后以結(jié)合能≤?5 kJ/mol作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，用PyMOL 2.5.3軟件展示其結(jié)構(gòu)模式。

2.3 恩施巴戟提取物的成分分析

2.3.1 色譜條件 Welchrom-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～0.5 min，99% A；0.5～14.0 min，99%～85% A；14.0～18.0 min，85%～70% A；18.0～20.0 min，70%～40% A；20.0～22.0 min，40%～20% A；22.0～25.0 min，20%～0 A；柱溫35 ℃；體積流量0.4 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm。

2.3.2 質(zhì)譜條件 采用ESI離子源，正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)；MSE模式采集一級(jí)質(zhì)譜離子和二級(jí)質(zhì)譜離子，采集范圍均為/100～1200；電噴霧電壓3000 V；脫溶劑溫度500 ℃；一級(jí)碰撞能量10 eV，二級(jí)碰撞能量35 eV；碰撞能量波動(dòng)±10 eV。

2.4 樣品制備

取恩施巴戟藥材粉末2.5 g，分別加入10倍量的水及50%、70%、95%乙醇，85 ℃加熱回流2 h，濾過，濾渣再分別加入10倍量溶劑回流1 h，濾過，合并2次濾液，揮至浸膏狀，冷凍干燥，得到藥材不同提取物粉末。將所得提取物粉末用二甲基亞砜溶解，配制成100 mg/mL的母液，即得到水提取物、50%乙醇提取物、70%乙醇提取物、95%乙醇提取物。水晶蘭苷對(duì)照品用二甲基亞砜溶解，配制成50 mmol/L的母液。Fsk用二甲基亞砜溶解，配制成10 mmol/L的母液。

2.5 睪丸間質(zhì)細(xì)胞分離純化及純度鑒定

將雄性大鼠處死，取出睪丸，置于冰上的PBS中，清洗3次。將睪丸脫膜，剪碎，放入離心管中，用DMEM/F12培養(yǎng)基清洗剩余殘留。向離心管中加入適量DMEM/F12培養(yǎng)基，34 ℃震蕩15 min；再加入0.05%膠原酶I，37 ℃震蕩15 min，加入等體積DMEM/F12培養(yǎng)基（含8%馬血清、2%牛血清、1%雙抗）終止消化，用70 μm尼龍濾網(wǎng)濾過，取濾過后的組織重復(fù)操作1次。合并濾液，離心后除去上清，重復(fù)2次。收集所有細(xì)胞，加到不同密度梯度的離心液中[12]（從上往下依次為5%、30%、58%、70%），4 ℃、3000 r/min離心30 min，吸取58%處條帶。加入適量DMEM/F12培養(yǎng)基，離心后除去上清，重復(fù)2次。收集以上細(xì)胞，重懸，加到DMEM/F12培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中，24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)，及時(shí)換液。

將所得的原代細(xì)胞消化，取50 μL細(xì)胞懸液，加入200 μL現(xiàn)配的3β-HSD進(jìn)行染色，孵育2 h，于顯微鏡下觀察，計(jì)算陽性染色細(xì)胞數(shù)，鑒定細(xì)胞純度。

2.6 MTT法檢測(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞存活率

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的睪丸間質(zhì)細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)，配制成細(xì)胞懸液，按照8×103個(gè)/孔均勻鋪在96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，分別加入恩施巴戟不同提取物和水晶蘭苷，作為給藥組。另設(shè)對(duì)照組和空白組，對(duì)照組加入與給藥組等體積含血清的培養(yǎng)液，空白組不含細(xì)胞只加入培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，除去上清液，每孔加入100 μL MTT稀釋液，于培養(yǎng)箱中孵育4 h，加入100 μL的二甲基亞砜，震蕩，使結(jié)晶溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.7 睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌量測(cè)定

采用大鼠睪酮ELISA試劑盒檢測(cè)樣本中的睪酮的含量。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，配制成懸液，按照4×104個(gè)/孔接種在12孔板。待細(xì)胞貼壁后，加入恩施巴戟提取物和水晶蘭苷，作為給藥組，另設(shè)對(duì)照組和陽性組，對(duì)照組加入與給藥組等體積含血清的培養(yǎng)液，陽性組加入10 μmol/L的Fsk。培養(yǎng)24 h，收集上清，2500 r/min離心20 min，取上清，按試劑盒說明書測(cè)定每孔睪酮分泌量。

2.8 qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，按照2.5×105個(gè)/孔接種在6孔板。加入恩施巴戟95%乙醇提取物和水晶蘭苷作為給藥組，另設(shè)對(duì)照組和陽性組，對(duì)照組加入與給藥組等體積含血清的培養(yǎng)液，陽性組加入10 μmol/L的Fsk。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再將所得cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見表1，以為內(nèi)參。

2.9 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

按照“2.8”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，置冰上提取睪丸間質(zhì)細(xì)胞蛋白，BCA法定量蛋白，蛋白變性處理后電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉后加入相應(yīng)一抗（用4%牛血清白蛋白按照1∶1000稀釋），孵育過夜；洗滌后加入二抗（用TBST按照1∶3000稀釋），室溫孵育；洗滌后顯影。

表1 引物序列

2.10 數(shù)據(jù)處理

利用Graph Pad Prism軟件運(yùn)用Dunnett’s檢驗(yàn)對(duì)組間差異進(jìn)行分析，并繪制柱形圖；利用mELISA軟件處理試劑盒數(shù)據(jù)，采用四參數(shù)方程，計(jì)算各組睪酮分泌量；采用MassLynx V4.1軟件對(duì)LC-MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)合參考文獻(xiàn)中的保留時(shí)間和碎片離子，對(duì)各主要分子離子峰進(jìn)行歸屬。

3 結(jié)果

3.1 恩施巴戟網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.1.1 恩施巴戟的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，共得到恩施巴戟36個(gè)成分（表2），總成分對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)為1021個(gè)。整合多個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫，共得到睪酮缺乏癥潛在靶點(diǎn)3401個(gè)。通過韋恩圖將恩施巴戟的成分靶點(diǎn)與睪酮缺乏癥疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，共獲得397個(gè)共同交集靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖1。選取度值排名前10名的靶點(diǎn)，綜合篩選，獲得與睪酮合成緊密關(guān)聯(lián)的6個(gè)靶點(diǎn)，分別為絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300（histone acetyltransferase p300，EP300）、磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亞基α亞型（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform，PIK3CA）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、轉(zhuǎn)錄因子Jun（transcription factor Jun，JUN）。

表2 恩施巴戟的化學(xué)成分

圖1 恩施巴戟治療睪酮缺乏癥的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3.1.2 恩施巴戟“活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將36個(gè)恩施巴戟活性成分和397個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行“活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，結(jié)果見圖2。度值越大，節(jié)點(diǎn)越大，說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要，水晶蘭苷為恩施巴戟中的主要活性成分之一。

3.1.3 恩施巴戟的KEGG通路富集分析 通過富集分析，共獲得178條KEGG通路，選擇前20位結(jié)果繪圖，見圖3。其中富集程度較高，且與睪酮合成緊密關(guān)聯(lián)的條目為環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路等。

圖2 恩施巴戟治療睪酮缺乏癥的“活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

圖3 恩施巴戟治療睪酮缺乏癥的KEGG通路富集分析

3.2 水晶蘭苷與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接

選擇關(guān)鍵靶點(diǎn)MAPK1、EP300、PIK3R1、PIK3CA、AKT1、JUN，以恩施巴戟的主要成分水晶蘭苷為對(duì)象進(jìn)行分子對(duì)接（表3）。水晶蘭苷與選擇的關(guān)鍵靶點(diǎn)有較強(qiáng)的結(jié)合活性，結(jié)合能均小于?5 kJ/mol，與MAPK1的結(jié)合能最強(qiáng)，其次是EP300、JUN、PIK3CA、AKT1、PIK3R1。水晶蘭苷與關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用見圖4。

表3 水晶蘭苷與睪酮缺乏癥關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能

圖4 水晶蘭苷與關(guān)鍵靶點(diǎn)MAPK1 (A)、EP300 (B)、PIK3R1 (C)、PIK3CA (D)、AKT1 (E)、JUN (F) 的分子對(duì)接模型

3.3 恩施巴戟LC-MS/MS分析

恩施巴戟提取物的LC-MS/MS成分分析總離子圖見圖5。通過數(shù)據(jù)解析，與文獻(xiàn)報(bào)道[13-20]比對(duì)，共鑒定出10個(gè)化合物（表4），包括環(huán)烯醚萜類成分6個(gè)、蒽醌類成分4個(gè)，其中豐度最高的峰為水晶蘭苷，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果一致。

3.4 睪丸間質(zhì)細(xì)胞模型驗(yàn)證

3.4.1 睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離純化及純度鑒定 如圖6所示，原代分離培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞呈多角形、三角形或梭形，核較大，存在“拉網(wǎng)”現(xiàn)象，臺(tái)盼藍(lán)染色后細(xì)胞存活率90%以上；經(jīng)3β-HSD染色的細(xì)胞質(zhì)呈深藍(lán)色，細(xì)胞純度大于90%。

A-正離子模式 B-負(fù)離子模式

表4 恩施巴戟的化學(xué)成分鑒定

A-細(xì)胞形態(tài) (×40) B-3β-HSD染色 (×200)

3.4.2 恩施巴戟提取物和水晶蘭苷對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞存活率的影響 如圖7所示，不同質(zhì)量濃度的恩施巴戟水提取物及50%、70%、95%乙醇提取物和水晶蘭苷作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞后，細(xì)胞存活率均大于90%，對(duì)細(xì)胞無明顯的毒性作用。同時(shí)，與對(duì)照組比較，12.5～100 μg/mL恩施巴戟95%乙醇提取物及25 μmol/L水晶蘭苷作用24 h后，均具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用（＜0.01）。

3.4.3 恩施巴戟提取物和水晶蘭苷對(duì)睪酮分泌的影響 如圖8所示，與對(duì)照組比較，恩施巴戟水提取物、50%乙醇提取物對(duì)睪酮分泌無明顯影響。5～10 μg/mL的恩施巴戟70%乙醇提取物、2.5～10 μg/mL 95%乙醇提取物、12.5～25 μmol/L的水晶蘭苷等可促進(jìn)睪酮分泌，且具有顯著差異（＜0.05、0.01）。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖8 恩施巴戟提取物及水晶蘭苷對(duì)睪酮分泌的影響(, n = 3)

3.4.4 恩施巴戟提取物和水晶蘭苷對(duì)睪酮合成和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 選取具有促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖和睪酮分泌作用的95%乙醇提取物進(jìn)行后續(xù)研究，如圖9所示，與對(duì)照組比較，恩施巴戟的95%乙醇提取物（25 μg/mL）和水晶蘭苷（25 μmol/L）均顯著促進(jìn)和的mRNA表達(dá)（＜0.05、0.01），升高/值（＜0.01）；水晶蘭苷（50 μmol/L）顯著促進(jìn)的mRNA表達(dá)（＜0.05），升高/值（＜0.01）。因而，恩施巴戟的95%乙醇提取物和水晶蘭苷可促進(jìn)睪酮合成相關(guān)基因（和）以及抗凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。

3.4.5 恩施巴戟提取物和水晶蘭苷對(duì)Star蛋白表達(dá)的影響 如圖10所示，與對(duì)照組比較，恩施巴戟的95%乙醇提取物（100 μg/mL）和水晶蘭苷（25 μmol/L）顯著促進(jìn)StAR的蛋白表達(dá)（＜0.01）。

圖9 恩施巴戟95%乙醇提取物及水晶蘭苷對(duì)睪酮合成和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響(, n = 3)

Fig. 9 Effect of 95% ethanol extract of Damnacanthi Officinari Radix and monotropein on testosterone synthesis and apoptosis-related genes expressions (, n = 3)

圖10 恩施巴戟95%乙醇提取物及水晶蘭苷對(duì)StAR蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

喬智勝等[21]通過文獻(xiàn)考證和實(shí)地考察認(rèn)為，唐代至清末廣泛運(yùn)用的巴戟天為歸州巴戟天，即《湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載的恩施巴戟。恩施巴戟是傳統(tǒng)補(bǔ)腎壯陽藥，一般認(rèn)為該類藥材主要通過提高血清中睪酮水平，緩解陽虛癥狀，從而維持正常性功能[22]。LC-MS分析顯示，恩施巴戟主要含有水晶蘭苷、車葉草苷酸、去乙?；嚾~草苷酸等環(huán)烯醚萜苷類成分及1-羥基-2羥甲基蒽醌等蒽醌類成分。水晶蘭苷等環(huán)烯醚萜苷類成分對(duì)腎損傷有著一定治療作用[20]，同時(shí)本研究表明水晶蘭苷具有促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和睪酮分泌的作用，因而水晶蘭苷可能為恩施巴戟補(bǔ)腎壯陽作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接預(yù)測(cè)恩施巴戟治療睪酮缺乏癥的潛在靶點(diǎn)主要為MAPK1、EP300、PIK3R1、PIK3CA、AKT1等。MAPK1作為MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分，可激活MAPK/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）途徑[23]；PIK3R1、PIK3CA、AKT1均屬于PI3K/Akt通路上的靶點(diǎn)；而EP300通過與磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB）特異性結(jié)合來介導(dǎo)cAMP基因調(diào)控[24]。由此可見，恩施巴戟的潛在靶點(diǎn)主要分布于cAMP、MAPK、PI3K/Akt等信號(hào)通路，與KEGG通路富集分析結(jié)果一致。cAMP信號(hào)通路[25]、p38 MAPK等的磷酸化水平[26]以及PI3K/Akt通路[27]等均可調(diào)控睪酮合成相關(guān)蛋白（StAR、HSD3B1、Cyp11a1等）和CREB磷酸化水平，從而調(diào)控睪酮合成的過程，調(diào)節(jié)睪酮水平[28]。

睪酮由膽固醇經(jīng)Star、Cyp11a1等一系列蛋白酶作用下合成并分泌，雄性體內(nèi)95%的睪酮由睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌[29]。本實(shí)驗(yàn)采用原代分離培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，cAMP促進(jìn)劑Fsk具有促進(jìn)睪酮分泌的作用[30]，以Fsk作為陽性對(duì)照。睪丸間質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，水晶蘭苷含量較高的提取物（70%和95%乙醇提取物）促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和睪酮分泌的作用更顯著。作用機(jī)制與其上調(diào)與的比值，增強(qiáng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的抗凋亡能力，以及促進(jìn)等睪酮合成相關(guān)酶的基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接結(jié)果顯示，恩施巴戟主要通過MAPK1、EP300、PIK3R1、PIK3CA、AKT1等潛在靶點(diǎn)和cAMP、MAPK、PI3K/Akt等信號(hào)通路發(fā)揮作用，水晶蘭苷為其補(bǔ)腎壯陽作用的主要有效成分之一。LC-MS/MS分析和睪丸間質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)分析，恩施巴戟提取物和水晶蘭苷均具有促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和睪酮分泌的作用，其作用機(jī)制與增強(qiáng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的抗凋亡能力和促進(jìn)睪酮合成相關(guān)酶的表達(dá)有關(guān)。本研究提供了恩施巴戟的藥理學(xué)研究基礎(chǔ)和新的思路，為恩施巴戟質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定和臨床應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Smith L B, Walker W H. The regulation of spermatogenesis by androgens [J]., 2014, 30: 2-13.

[2] 吳劍鋒. 男性基礎(chǔ)性激素水平與精子質(zhì)量參數(shù)的相關(guān)性探討 [J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2020, 35(3): 69-71.

[3] Salter C A, Mulhall J P. Guideline of guidelines: Testosterone therapy for testosterone deficiency [J]., 2019, 124(5): 722-729.

[4] 許兵, 王蕭楓, 王冠華, 等. 補(bǔ)腎活血顆粒對(duì)去勢(shì)大鼠腎虛證的影響及機(jī)制研究 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2015, 33(12): 2846-2849.

[5] 顧銀霞, 羅毅. 補(bǔ)腎法在去勢(shì)抵抗性前列腺癌治療中的應(yīng)用 [J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥, 2020, 39(5): 149-151.

[6] 湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn): 2018年版 [S]. 2019: 188-189.

[7] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì). 中國植物志(第六卷, 第一分冊(cè)-蕨類植物門) [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1999: 175.

[8] 喬智勝, 吳煥, 蘇中武, 等. 巴戟天、鄂西巴戟天和川巴戟藥理活性的比較 [J]. 中西醫(yī)結(jié)合雜志, 1991, 11(7): 415-417.

[9] 李正磊. 基于補(bǔ)腎陽譜效關(guān)系的鹽巴戟天質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 [D]. 武漢: 湖北中醫(yī)藥大學(xué), 2019.

[10] 段金輝, 劉陽, 黃容吉, 等. 恩施巴戟環(huán)烯醚萜苷類成分提取工藝優(yōu)選及抗氧化活性研究 [J]. 藥學(xué)實(shí)踐雜志, 2020, 38(4): 346-349.

[11] 牛明, 張斯琴, 張博, 等.《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》解讀 [J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4119-4129.

[12] 況海斌, 王新長(zhǎng), 方廉. 大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分離及其鑒定 [J]. 江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2002, 42(5): 7-9.

[13] 蘇現(xiàn)明. 雞眼藤化學(xué)成分及藥理活性研究 [D]. 北京: 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院, 2018.

[14] 張長(zhǎng)弓, 鄢元和, 楊鐵軍, 等. 恩施巴戟化學(xué)成分的研究(Ⅱ) [J]. 同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1991, 20(2): 93-95.

[15] 鄢元和, 張長(zhǎng)弓, 寧嘉賡, 等. 恩施巴戟化學(xué)成分的研究 [J]. 同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1989, 18(3): 201-202.

[16] 趙祥升, 弓寶, 周亞奎, 等. UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定巴戟天中4個(gè)環(huán)烯醚萜苷的含量 [J]. 藥物分析雜志, 2018, 38(9): 1490-1495.

[17] 董雅倩, 張佳幸, 龔琳娜, 等. 白花蛇舌草環(huán)烯醚萜的鑒定及基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的抗腎纖維化作用的機(jī)制研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 55(12): 2934-2941.

[18] 雒曉梅, 宿美鳳, 常曉燕, 等. 基于LC-MS聯(lián)用的杜仲主要化學(xué)成分定性及定量分析 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2019, 21(8): 1029-1040.

[19] 任曉航, 石夢(mèng)鴿, 劉博男, 等. UPLC-QQQ-MS法測(cè)定巴戟天炮制前后10種成分的含量 [J]. 中藥材, 2019, 42(3): 588-593.

[20] 岳建民, 陳紹農(nóng), 楊升平, 等. 簇序草化學(xué)成分的研究 [J]. 植物學(xué)報(bào), 2001, 43(11): 1199-1201.

[21] 喬智勝, 蘇中武, 李承祜. 巴戟天應(yīng)用的名實(shí)沿革考 [J]. 廣西植物, 1993, 13(3): 252-256.

[22] 王錦輝, 樊梅月, 郭連澍. 補(bǔ)腎壯陽藥對(duì)陽萎患者血清睪酮的影響 [J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2002, 11(24): 2468.

[23] López-Bucio J S, Raya-González J, Ravelo-Ortega G,. Mitogen activated protein kinase 6 and MAP kinase phosphatase 1 are involved in the response ofroots to-glutamate [J]., 2018, 96(4/5): 339-351.

[24] Xiang Q P, Wang C, Zhang Y,. Discovery and optimization of 1-(1-indol-1-yl)ethanone derivatives as CBP/EP300 bromodomain inhibitors for the treatment of castration-resistant prostate cancer [J]., 2018, 147: 238-252.

[25] Otani M, Kogo M, Furukawa S,. The adiponectin paralog C1q/TNF-related protein 3 (CTRP3) stimulates testosterone production through the cAMP/PKA signaling pathway [J]., 2012, 58(2): 238-244.

[26] Jing J, Ding N, Wang D D,. Oxidized-LDL inhibits testosterone biosynthesis by affecting mitochondrial function and the p38 MAPK/COX-2 signaling pathway in Leydig cells [J]., 2020, 11(8): 626.

[27] Eid A H, Gad A M, Fikry E M,. Venlafaxine and carvedilol ameliorate testicular impairment and disrupted spermatogenesis in rheumatoid arthritis by targeting AMPK/ERK and PI3K/AKT/mTOR pathways [J]., 2019, 364: 83-96.

[28] 朱清玉, 郭樂薇, 劉紅羽, 等. 睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]. 中國畜牧雜志, 2021, 57(5): 28-33.

[29] Pongkan W, Chattipakorn S C, Chattipakorn N. Roles of testosterone replacement in cardiac ischemia-reperfusion injury [J]., 2016, 21(1): 27-43.

[30] Godard M P, Johnson B A, Richmond S R. Body composition and hormonal adaptations associated with forskolin consumption in overweight and obese men [J]., 2005, 13(8): 1335-1343.

Mechanism ofon promoting testosterone secretion based on network pharmacology and Leydig cells model

ZHU Cheng-shan1, LI Zi-han1, PENG Hong-bing1, YIN Cong1, LI Juan1, CHEN Ke-li1, XIAO Ling2, NIE Jing2, LIU Yi-mei1

1. College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 2. Hubei Institute For Drug Control, Wuhan 430075, China

To investigate the effect and potential mechanism of Enshi Baji () on testosterone secretion in Leydig cells based on network pharmacology and Leydig cells model.Network pharmacology and molecular docking were used to predict the potential targets and pathways ofin treating testosterone deficiency. LC-MS/MS was used to analyze the main chemical components of. In Leydig cells model, MTT assay was used to detected cells survival rate, ELISA kit was used to detect testosterone secretio, qRT-PCR was used to detect the related mRNA expressions of testosterone synthesis and apoptosis, and Western blotting was used to detect the expression of testosterone synthetic protein.Network pharmacology and molecular docking results showed thatmainly played a role through targets such as mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit 1 (PIK3R1), and pathways such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), MAPK, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt). Monotropein was the main active ingredient. LC-MS/MS analysis results and Leydig cells experiment validated the predictive analysis of network pharmacology. Extract ofand monotropein could promote Leydig cells growth and testosterone secretion. Its mechanism was related to promoting steroidogenic acute regulatory protein (), cholesterol side-chain cleavage enzyme (), B-cell lymphoma-2 ()/Bcl-2 associated X protein () mRNA expressions (< 0.05, 0.01), and StAR protein expression (< 0.01).can promote testosterone secretion, and monotropein is the main active ingredient. Its mechanism is related to the regulation of testosterone synthesis by MAPK and PI3K/Akt pathways.

; monotropein; Leydig cells; testosterone deficiency; network pharmacology; testosterone synthesis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)23 - 7430 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.013

2022-08-06

湖北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020ACA007）

朱成姍（1999—），碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及其品質(zhì)。Tel: 15927655062 E-mail: 1094544954@qq.com

通信作者：劉義梅（1971—），教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源及其品質(zhì)。Tel: 18908633139 E-mail: 617656021@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]