脈動真空滅菌器滅菌效果驗證

牛振東，路銀環(huán)，劉文杰，陳 卓，井良義

（北京市藥品檢驗研究院·中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206）

國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品安全監(jiān)管司/藥品認證管理中心《藥品生產驗證指南》要求，藥品生產過程中使用的滅菌設備安裝、調試結束后，在正式投入使用前和使用一定時間后必須確認性能，可進行期間核查，應采用經過驗證的滅菌工藝、操作規(guī)程和檢測方法進行操作。高壓滅菌器應經過生物指示劑挑戰(zhàn)試驗和B-D試驗測試滅菌效果，合格后方可使用。生物指示劑挑戰(zhàn)試驗是驗證滅菌器滅菌效果的重要手段，2020年版《中國藥典（四部）》中將生物指示劑（BI）定義為一種對特定滅菌程序有確定及穩(wěn)定耐受性的特殊活微生物制成品［1］。脈動真空滅菌器采用濕熱滅菌法滅菌，即利用飽和蒸汽使微生物菌體中的蛋白質、核酸發(fā)生變性從而殺滅微生物。蒸汽穿透力強，滅菌效果可靠，使用方便，廣泛應用于病原微生物實驗室，尤其是對器械、培養(yǎng)基、感染性廢棄物等的消毒滅菌［2］。滅菌程序的建立、確定、驗證和日常監(jiān)控中，實驗室需合理選擇和使用BI，全面了解滅菌產品，確保滅菌參數(shù)能達到所需無菌保障水平。BI的耐受性及標準化應用等問題是決定滅菌工藝驗證效果是否合理的關鍵，而合理有效的滅菌工藝直接關系醫(yī)藥產品的安全［3］。本研究中通過生物指標劑挑戰(zhàn)試驗及B-D試驗分析脈動真定滅菌器的滅菌效果?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：1300 Series A2型生物安全柜（美國Thermo Fisher公司）；BIOBASE型生化培養(yǎng)箱（山東博科科學儀器有限公司）；BIST-A-D型電熱脈動真空滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，含1號鍋和2號鍋，其裝載車分上下兩層）。

試劑：壓力蒸汽滅菌生物指示劑，包括嗜熱脂肪地芽孢桿菌Geobacillus stearothermophilusATCC 7953［芽孢數(shù)為（1～5）×106cfu/片，D值為1.3～1.9 min］，以及培養(yǎng)基（上海福澤醫(yī)藥器材有限公司，批號為210720）；B-D試驗包（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，批號為21H02）。

1.2 方法

生物指示劑挑戰(zhàn)試驗：該試驗能直接反映滅菌器在滅菌過程中的滅菌能力和效果，是滅菌器滅菌過程中最重要的監(jiān)測手段［4］。試驗分為試驗組、陽性對照組、陰性對照組。脈動真空滅菌器裝載車分為上下兩層（1，2號鍋），分別對上下兩側布點進行生物指示劑測試，每層布置9個監(jiān)測點，分別進行空載和滿載測試。試驗組BI經121.0℃滅菌15 min，置換6 min后釋放芽孢桿菌，于56℃培養(yǎng)48 h；陽性對照組芽孢桿菌于56℃培養(yǎng)48 h；陰性對照組僅有培養(yǎng)基，于56℃培養(yǎng)48 h。布點見表1，裝載方式見圖1。

圖1 滅菌鍋不同裝載方式試驗結果A1，B1.No.1 pot A2，B2.No.2 potA.No-load B.Full-loadFig.1 Test results of different loading modes of sterilizer pots

表1 生物指示劑挑戰(zhàn)試驗結果Tab.1 Results of the biological indicator challenge test

B-D測試法：將試驗包置滅菌器室內排氣口處關閉柜門［5］，134℃滅菌3.5 min，脈動3次，完畢，取出測試圖，觀察測試結果（試驗試紙由黃色轉為黑色，表明滅菌有效）。實驗室應根據滅菌器使用的年限和頻率等因素制訂相應的B-D監(jiān)測規(guī)范。

指示膠帶的使用：應在每次滅菌過程中使用，主要用于區(qū)分是否進行過滅菌處理。但不能據此結果判定滅菌是否合格［6］，只有結合其他手段綜合評估才能判斷滅菌效果。

2 結果

生物指示劑挑戰(zhàn)試驗結果見表1（試驗組及陰性對照組滅菌前后均呈紫紅色、澄清狀）和圖1。B-D測試結果顯示，試驗試紙由黃色轉為黑色。

3 討論

2020年初新型冠狀病毒肺炎疫情（簡稱新冠疫情）的暴發(fā)，加深了人們對生物安全的認識，實驗室生物安全也愈加凸顯。我國出臺《生物安全法》并于2021年4月15日起實施，該法細致詳細，為生物安全領域首次立法，凸顯國家對生物安全的重視。對此，病原微生物實驗室應建立質量與生物安全管理體系、人員管理、菌（毒）種和陽性樣本的管理、環(huán)境與設備管理、廢棄物安全、個人防護和應急預案等。加強滅菌器性能驗證及其規(guī)范操作對微生物實驗室至關重要。

第40版《美國藥典》及第8版《歐洲藥典》均指出，BI是一種對特定滅菌程序有確定及穩(wěn)定耐受性的特殊活微生物制成品，其常用于確認滅菌設備性能，及特定物品的滅菌工藝研發(fā)、建立和驗證等。BI主要分菌片式和自含式，菌片式BI需要未滅菌的菌片和無菌培養(yǎng)基，本試驗中所用的為自含式BI，本身含有菌種和培養(yǎng)基，可有效避免外界雜菌的污染。Bowie等發(fā)明的驗證預真空滅菌器的真空系統(tǒng)是否功能正常的方法即B-D測試法［7］，適用于預真空壓力蒸汽滅菌器空氣排除效果的檢測，及日常滅菌中空氣排除效果監(jiān)測、設計滅菌操作規(guī)程時的核查、滅菌器研制中及維修后性能的測定、新滅菌器安裝調試后效果的測定等。醫(yī)用消毒滅菌指示膠帶是滅菌過程指示產品，通過膠帶上的指示油墨在經消毒滅菌作用后顏色發(fā)生變化，從而判定物品是否經消毒處理，直觀簡潔地反映物品滅菌狀態(tài)。

隨著生物安全要求越來越受到重視，有效的滅菌效果監(jiān)測和滅菌器工藝開發(fā)顯得尤為重要，和歐美國家相比，我國滅菌工藝相關的法規(guī)、標準、規(guī)范和指導原則相對不健全。近年來，國家藥品改革不斷深入，對于藥品無菌工藝保障要求越來越多，無菌工藝也是藥品安全性保障的重要指標，對相應指導原則或標準規(guī)范的需求就更迫切，為此，2020年版《中國藥典（四部）》通則在以往版本的基礎上對滅菌法進行了重大修訂，增加了與滅菌工藝相關的2個BI的指導原則，即通則9207（滅菌用生物指示劑指導原則）和通則9208（生物指示劑耐受性檢查法指導原則）。2020年12月31日，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（CDE）正式發(fā)布《化學藥品注射劑滅菌和無菌工藝研究及驗證指導原則（試行）》并試行。上述指導原則的發(fā)布，為BI的質量控制提供了參考，為檢測實驗室和藥品生產企業(yè)在滅菌工藝研究、滅菌效果驗證和日常滅菌監(jiān)控中正確選用BI提供了技術指導，同時，良好的滅菌工藝能減少藥品污染，降低實驗室感染性材料滅菌不徹底的風險。

綜上所述，本研究中確立了適用于本實驗室的脈動真空滅菌器的滅菌程序、裝載方式及其日常監(jiān)測的方法。初步確定的滅菌程序（121℃滅菌15 min），能殺滅孢子菌而達到預期滅菌效果，保障培養(yǎng)基和試劑的滅菌質量。在日常微生物檢驗過程中，用該滅菌程序能徹底殺滅包括孢子菌在內的所有微生物，而不會因為殺菌不徹底，檢驗用物品引入微生物造成假陽性風險。蒸汽滅菌器可滿足日常檢驗時的滅菌使用要求。需注意在每次滅菌時應使用指示膠帶，根據滅菌器的使用年限和使用頻率定期進行B-D試驗和生物指示劑挑戰(zhàn)試驗。