小兒哮喘巴布劑組方藥材提取與精制工藝研究*

錢桂英，畢肖林，錢云英，吳曉明△

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)常熟附屬醫(yī)院，江蘇 常熟 215500；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023）

中醫(yī)藥治療哮喘具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［1-3］。巴布劑載藥量大，適用于單次大劑量給藥，同時(shí)不含傳統(tǒng)膏藥所特有的黃丹、香油等物質(zhì)，不會(huì)引發(fā)鉛中毒、皮膚過敏等不良反應(yīng)，應(yīng)用廣泛。小兒哮喘方為我院經(jīng)驗(yàn)方，有宣肺化飲、瀉肺袪痰、止咳平喘之效，臨床運(yùn)用多年，收效良好。為進(jìn)一步優(yōu)化劑型，方便患兒使用，本研究中對(duì)該方開展藥材提取、精制工藝研究，確定相關(guān)參數(shù)，在保證有效成分得率的前提下，最終獲得藥物提取物，為后續(xù)中藥復(fù)方制劑小兒哮喘巴布劑的制備提供基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ATY124型分析天平、LC-2010AHT型液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；KH-500B 4L型超聲波清洗機(jī)（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；SHB-ⅢS型真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海標(biāo)和儀器有限公司）。

1.2 試藥

芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品、6-姜酚對(duì)照品、細(xì)辛脂素對(duì)照品（南京金益柏生物科技有限公司，批號(hào)分別為JBZ-0585，JBZ-0561，JBZ-1319，含量均大于98%）；生姜購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)巢建國(guó)教授鑒定為姜科植物姜的根莖。乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。細(xì)辛飲片（產(chǎn)地遼寧，批號(hào)為200609）、白芥子（產(chǎn)地江蘇，批號(hào)為200718），制白附子飲片、花椒（產(chǎn)地四川，批號(hào)分別為200307，200411），均購(gòu)自蘇州天靈中藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 回流提取

色譜條件：色譜柱為Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.08 mol/L磷酸二氫鉀水溶液（B），梯度洗脫（0～19 min時(shí)12%A，19～20 min時(shí)12%A→52%A，20～48 min時(shí)52%A→56%A，48～50 min時(shí)56%A→12%A，50～60 min時(shí)12%A）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm（6-姜酚、細(xì)辛脂素）和326 nm（芥子堿硫氰酸鹽）；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20 μL［4］。

溶液制備：取6-姜酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇超聲（功率500 W，頻率40 kHz，下同）溶解，制得質(zhì)量濃度為0.954 mg/mL的對(duì)照品貯備液，精密吸取0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋制得質(zhì)量濃度為0.047 7 mg/mL的6-姜酚對(duì)照品溶液；取芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇超聲溶解，制得質(zhì)量濃度為0.992 mg/mL的對(duì)照品貯備液，精密吸取1 mL，置5 mL容量瓶中，加乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液（10∶90，V/V）定容，制得質(zhì)量濃度為0.198 4 mg/mL的芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品溶液［5］；取細(xì)辛脂素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇超聲溶解制得質(zhì)量濃度為1.403 mg/mL的對(duì)照品貯備液，精密吸取0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋，制得質(zhì)量濃度為0.070 15 mg/mL的細(xì)辛脂素對(duì)照品溶液。取提取液0.1 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇超聲處理20 min，取2 mL，離心，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：分別吸取上述3種對(duì)照品溶液及供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰。理論板數(shù)按芥子堿硫氰酸鹽、6-姜酚、細(xì)辛脂素計(jì)均應(yīng)不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Sinapine thiocyanate 2.6-Gingerol 3.AsarininA.Sinapine thiocyanate reference solution B.6-Gingerol reference solution C.Asarinin reference solution D.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取上述3種對(duì)照品貯備液各1 mL，加甲醇逐級(jí)倍比稀釋，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積（X）為橫坐標(biāo)、待測(cè)成分質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（Y，μg/mL）進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=8）Tab.1 Results of the linear relation test（n=8）

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)：按相關(guān)規(guī)定進(jìn)行相應(yīng)試驗(yàn)。3種試驗(yàn)結(jié)果的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。

2.1.2 醇沉提取

色譜條件：同2.1.1項(xiàng)。

在外企工作的小趙看到《暫行辦法》后也很高興，“我每月收入近2萬(wàn)元，從2019年起可以少繳近千元稅?！毙≮w是獨(dú)生子女，有一個(gè)4歲的女兒，父母都年滿60歲，租房居住，業(yè)余時(shí)間還在進(jìn)修MBA。根據(jù)新規(guī)定，2萬(wàn)元的收入減“三險(xiǎn)一金”4000元，子女教育專項(xiàng)附加扣除1000元，贍養(yǎng)老人專項(xiàng)附加扣除2000元，住房租金專項(xiàng)附加扣除1500元，繼續(xù)教育專項(xiàng)附加扣除400元，如此計(jì)算，小趙每月應(yīng)繳納的稅款降為600元，而2018年11月前他每月要繳1590元個(gè)稅。

溶液制備：各對(duì)照品溶液制備同2.1.1項(xiàng)。提取液采用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行醇沉、冷藏靜置后，將上清液減壓濃縮，回收乙醇。分別取濃縮后的濾液1～10 mL置50 mL容量瓶，加甲醇定容，搖勻，離心，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)：按相關(guān)規(guī)定進(jìn)行相應(yīng)試驗(yàn)。3種試驗(yàn)結(jié)果的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。

2.2 揮發(fā)油提取工藝研究

2.2.1 揮發(fā)油提取

采用水蒸氣蒸餾法。取20%處方量的生姜片200 g、花椒粗粉20 g及細(xì)辛粗粉12 g，分別加水浸泡0.5 h，生姜、花椒采用輕油提取器，細(xì)辛采用重油提取器，回流提取，靜置過夜，讀取揮發(fā)油體積［4-8］。

2.2.2 單因素考察

以所得揮發(fā)油體積為考察指標(biāo)，分別對(duì)提取時(shí)間和加水量進(jìn)行單因素考察。固定加水量為8倍，提取時(shí)間為2，4，5，6，7，8 h時(shí)，生姜+花椒揮發(fā)油提取量分別為0.25，0.30，0.40，0.40，0.35，0.40 mL，細(xì)辛揮發(fā)油提取量分別為1.05，0.90，1.00，1.20，0.80，1.00 mL；固定提取時(shí)間為5 h，加水量為6，8，10，15倍時(shí)，生姜+花椒揮發(fā)油提取量分別為0.33，0.40，0.40，0.40 mL；固定提取時(shí)間為6 h，加水量為6，8，10倍時(shí)，細(xì)辛揮發(fā)油提取量分別為0.50，1.20，0.73 mL。故初步確定生姜和花椒加8倍量水、提取5 h，細(xì)辛加8倍量水、提取6 h。水提液合并后備用。

2.3 提取液得率及綜合評(píng)分

綜合評(píng)分：回流提取時(shí)，根據(jù)芥子堿硫氰酸鹽、6-姜酚、細(xì)辛脂素含量計(jì)算，綜合評(píng)分=芥子堿硫氰酸鹽得分×0.3+6-姜酚得分×0.3+細(xì)辛脂素得分×0.3+提取液得率得分×0.1，其中芥子堿硫氰酸鹽、6-姜酚、細(xì)辛脂素得分分別為各自含量/各自最大含量×100；醇沉提取時(shí)，根據(jù)芥子堿硫氰酸鹽、6-姜酚含量計(jì)算，綜合評(píng)分=芥子堿硫氰酸鹽得分×0.5+6-姜酚得分×0.5。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化

2.4.1 回流提取工藝

以水蒸氣蒸餾法提取所剩藥渣及白芥子、制白附子混合物為考察對(duì)象。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素A）、提取次數(shù)（因素B）、加水量（因素C）、提取時(shí)間（因素D）為考察因素，綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)法，因素水平見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。由表3可見，各因素對(duì)考察指標(biāo)的影響［10］強(qiáng)度大小依次為B＞A＞D＞C；由表4可見，4種因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著影響。結(jié)合K值確定最優(yōu)工藝為A2B3C3D3，即以70%乙醇回流提取3次，每次加10倍量水，提取60 min。

表2 回流提取工藝因素水平Tab.2 Factors and levels of reflux extraction process

表3 回流提取工藝L（934）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（n=9）Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test of reflux extraction process（n=9）

表4 回流提取工藝方差分析結(jié)果Tab.4 ANOVA results of reflux extraction process

2.4.2 醇沉提取工藝

以水蒸氣蒸餾法提取后的水提液為考察對(duì)象，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以濃縮程度（藥材、藥液體積比，因素E）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素F）、靜置時(shí)間（因素G）為考察因素，綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)法，因素水平見表5，試驗(yàn)結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。由表6可見，各因素對(duì)考察指標(biāo)的影響強(qiáng)度大小依次為G＞F＞E，由表7可見，3種因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著影響，結(jié)合K值確定最佳工藝為E2F2G3，即濃縮至藥材、藥液體積比為1∶1.5，加60%乙醇，靜置48 h。

表5 醇沉提取工藝因素水平Tab.5 Factors and levels of alcohol precipitation process

表6 醇沉提取工藝L（934）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（n=9）Tab.6 Design and results of the L9（34）orthogonal test of alcohol precipitation process（n=9）

表7 醇沉提取工藝方差分析結(jié)果Tab.7 ANOVA results of alcohol precipitation process

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按優(yōu)選的最佳工藝進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果芥子堿硫氰酸鹽含量為1.521 1 mg/mL，6-姜酚含量為0.236 5 mg/mL。

3 討論

3.1 巴布劑特點(diǎn)

中藥巴布劑是指水或醇提取的中藥浸膏、超微粒粉碎的中藥粉體、浸泡后的中藥藥泥與巴布劑基質(zhì)混合均勻后加工而成的巴布劑［11］。

巴布劑為藥材提取物、藥材或化學(xué)藥物與適宜親水性基質(zhì)混合后涂布于背襯材料制成的貼膏劑［12］，由背襯（常用無(wú)紡布、彈力布）、膏體、隔離膜組成，并分為保護(hù)層、儲(chǔ)藥層、支持層。保護(hù)層為一層聚酯保護(hù)膜，使用前揭去；儲(chǔ)藥層即基質(zhì)和主藥部分，為水分子和藥物組成的一層水溶性高分子框架結(jié)構(gòu)；支持層即背襯層，為一層流通性強(qiáng)的無(wú)紡布，為膏體載體，起支撐作用。在此結(jié)構(gòu)下，小分子藥物可沿濃度梯度滲入皮膚發(fā)揮作用。

3.2 揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

生姜、花椒、細(xì)辛等均含揮發(fā)油［13-15］，本研究中先根據(jù)既往研究初步確定各揮發(fā)油的提取工藝參數(shù)，并查閱2020年版《中國(guó)藥典（一部）》，依據(jù)生姜、花椒揮發(fā)油密度遠(yuǎn)小于1，采用輕油提取器提取生姜片和花椒粗粉；而細(xì)辛揮發(fā)油密度與1相近，試驗(yàn)過程中，由于揮發(fā)油呈水油混合狀態(tài)，各組分揮發(fā)時(shí)的溫度不同，沸點(diǎn)低的先揮發(fā)，密度通常較小，易漂浮于水面；而沸點(diǎn)高的成分易發(fā)生沉降現(xiàn)象。綜合分別通過兩種提取器提取細(xì)辛揮發(fā)油得出的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，最終采用重油提取器提取細(xì)辛粗粉。以揮發(fā)油提取量為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)法考察不同加水量、不同提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取量的直接影響，得出最佳的揮發(fā)油提取條件為，生姜和花椒加8倍量水、提取5 h，細(xì)辛加8倍量水，提取6 h。

3.3 藥渣中殘留活性成分提取工藝優(yōu)化

藥材經(jīng)提取后，藥渣中仍有活性成分殘留，因而將水蒸氣蒸餾提取后的藥渣和白芥子、制白附子混合后再進(jìn)行提取，該藥渣主要有效成分為脂溶性成分，因此采用乙醇溶液作為提取溶劑［16-17］。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，影響藥渣和其他藥材再提取的因素有乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)、加水量及提取時(shí)間，故以上述4種因素為考察因素，綜合評(píng)分為考察指標(biāo)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)及方差分析結(jié)果，確定最優(yōu)工藝。提取后將藥渣與其他粗粉混勻后進(jìn)行醇提，再次進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，成功確定了藥材再提取工藝條件。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該優(yōu)選工藝可行。

3.4 醇沉提取工藝優(yōu)化

藥材經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取后，提液中存在部分大分子親水性雜質(zhì)，其難溶于乙醇溶液，為進(jìn)一步除去雜質(zhì)，采用醇沉法進(jìn)行精制，將水提液和適量乙醇混合，冷藏靜置后可沉淀這類雜質(zhì)，并通過抽濾的方式除去［18］。提取后的水提液繼續(xù)精制，采用正交試驗(yàn)法考察。因本試驗(yàn)中采用水蒸氣蒸餾法，考慮細(xì)辛脂素為脂溶性物質(zhì)，含量較少，故醇沉提取工藝中未考察其含量。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇濃縮程度（藥材、藥液體積比）、乙醇體積分?jǐn)?shù)、靜置時(shí)間為考察因素，綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，行L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳醇沉提取工藝。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該優(yōu)選工藝可行。

3.5 方法評(píng)價(jià)

近10年來(lái)，哮喘診治方法的更新相對(duì)緩慢［19］。目前，兒童哮喘治療目標(biāo)是盡量減少癥狀負(fù)擔(dān)（日常癥狀、睡眠不安和活動(dòng)受限）和哮喘不良后果的風(fēng)險(xiǎn)（惡化、持續(xù)氣流受限和藥物副作用）［20］。而全球哮喘管理和預(yù)防戰(zhàn)略（GINA）對(duì)哮喘患者藥物治療的主要區(qū)別仍在于類固醇、β受體激動(dòng)劑或白三烯拮抗劑的選擇及藥物劑量的不同優(yōu)先級(jí)。這種治療方法存在3%～10%的“無(wú)反應(yīng)者”［21］。同時(shí)，兒童使用吸入性糖皮質(zhì)激素存在長(zhǎng)期副作用的潛在風(fēng)險(xiǎn)，如腎上腺功能衰竭、傷口愈合延遲、體質(zhì)量增加、骨質(zhì)疏松、白內(nèi)障和發(fā)育遲緩等［22］。

當(dāng)前中藥巴布劑應(yīng)用前景廣闊，潛力較大，但限制因素較多，主要包括：可供使用的國(guó)產(chǎn)輔料品類較少；缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的大型生產(chǎn)設(shè)備；中藥多為復(fù)方，成分復(fù)雜，制備工藝難度大；缺乏統(tǒng)一、科學(xué)的制劑質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)和方法［23］。本研究所建制劑藥材提取工藝可為小兒哮喘巴布劑的制備提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。