沒食子水提物對體外培養(yǎng)口腔生物膜的影響*

艾 林，李 愷，高 鵬，張若冰

（1.中國人民解放軍空軍第九八六醫(yī)院，陜西 西安 710054；2.陜西省藥品監(jiān)督管理局，陜西 西安 710065）

牙菌斑會導致口腔疾病的發(fā)生、發(fā)展，其中齲齒、牙齦炎和牙周炎較常見［1］。牙菌斑生物膜是自然界中最復雜的微生物群落，其黏附于口腔細胞外基質(zhì)中。目前物理機械方法（如刷牙）最常用于破壞牙菌斑生物膜，但效果有限［2］，因此，化學藥物（如口腔維護藥物［3］）方法越來越受到重視，大部分市售非處方漱口水產(chǎn)品含有針對各種口腔問題的活性成分。沒食子有效成分主要為鞣質(zhì)、沒食子酸及沒食子酸烷基酯等，其性寒、味苦，有固澀、收斂、燥濕、止血作用，已被證明具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和抗菌活性［4］。本課題組既往研究結(jié)果表明，沒食子具有選擇性抑制口腔細菌的潛力，有助于控制口腔微生物，保持口腔健康和體內(nèi)微環(huán)境平衡。為此，本研究中通過建立體外生物膜模型，研究沒食子提取物對體外口腔生物膜細菌組成和代謝活性的影響，為其應(yīng)用于口腔炎性疾病的防治提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：t100型PCR儀、PR4100型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；IX71型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；ROCH-454型基因組測序儀FLX鈦系統(tǒng)（瑞士巴塞爾羅氏公司）；VCX-130型Sonics超聲波細胞破碎儀（廣州奕宣儀器設(shè)備有限公司）。

試藥：沒食子藥材（新疆奇康哈博維藥有限責任公司，批號為20161112）；20%葡萄糖酸氯己定（上海麥克林生化科技有限公司，批號為C832370）；胎牛血清（批號為12103C）、胰蛋白酶（批號為T2600000）、DMEM培養(yǎng)基（批號為D0819）、佛波酯（PMA，批號為P1585）、羥基磷灰石（HA）磁盤（批號為677418）、蛋白胨水磷酸鹽緩沖液（批號為77187）、酪蛋白胨卵磷脂聚山梨酸酯肉湯（MHB，批號為22089）、胰蛋白酶大豆瓊脂（批號為22091），均購自美國Sigma公司；McBain培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，批號為LA5600）；水為蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 樣本來源與獲取

納入標準：牙齦炎或輕、中度牙周炎；3個月內(nèi)未行口腔治療；不吸煙。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（批件號為202001005），患者簽署知情同意書。

排除標準：嚴重全身系統(tǒng)性疾?。恢委熐?個月接受抗生素治療；對硝唑類和/或青霉素類藥物過敏；齲齒；牙周指數(shù)（DPSI）≤3，或在沒有牙齦退縮的情況下牙周袋≤5 mm。

病例選擇：選取醫(yī)院2020年4月至2020年8月收治的牙齦炎或輕、中度牙周炎男性官兵患者12例，平均年齡（22.4±5.7）歲?；颊呔捎冒褪希˙ASS）刷牙法，在取樣前24 h內(nèi)不進行口腔清理且在取樣前2 h內(nèi)不進食或服用飲料（可少量飲水）。

樣本獲?。河谏衔?：30-9：30在患者的左上頜和左下頜區(qū)域以無菌塑料刮匙沿著所有頰面和舌面的齦緣收集牙齦上菌斑，置含有100 μL半胱氨酸蛋白（CPW）的Eppendorf瓶中，稱定質(zhì)量，攪拌30 s，12 000 r/min離心，再次稱定質(zhì)量，以每10 mg牙菌斑添加1.3 mL CPW補足減失的質(zhì)量，0℃保存。隨后，患者均咀嚼1片無菌薄膜1 min，使用無菌通用小瓶采集1 mL刺激唾液，0℃保存。

1.2.2 樣品處理與分組

樣品處理：取沒食子藥材適量，粉碎為粗粉，以1∶5（m/m）加水浸泡4 h，煎煮3次，每次1 h，分別濾過，合并煎液后再濾過，真空干燥為浸膏，稱定質(zhì)量，分裝待用［5］。制備10 mg/mL沒食子提取物浸膏磷酸鹽緩沖液（PBS）混合溶液及0.2%氯己定漱口液（取20%葡萄糖酸氯己定適量，加水稀釋制成）。

分組：實驗分為陰性對照組（A組，等體積生理鹽水）、沒食子提取物組（B組，10 mg/mL沒食子水提物浸膏）、氯己定漱口液組（C組，等體積氯己定漱口液）。

1.2.3 牙菌斑生物膜制備

按文獻［3］方法制備活性附著牙菌斑生物膜模型。采用24孔聚苯乙烯培養(yǎng)板（其蓋子為定制的不銹鋼蓋子），每份牙菌斑樣本使用單獨培養(yǎng)板，上面固定可插入不同底座的尼龍夾子，夾鉗的位置使插入的基板能與培養(yǎng)板的孔相匹配。使用標準化的12 mm羥基磷灰石（HA）磁盤作為基板，組裝后的模型121℃高壓滅菌1 h。

每份牙菌斑樣本中，加入McBain培養(yǎng)基+滅菌后的0.2%蔗糖及5%胎牛血清（pH為7）。采用超聲波儀振蕩（功率500 W，頻率20 kHz，下同）牙菌斑樣，懸浮液3 s，渦流混合30 s，以1.2.1項下16∶1（20 mL CPW/1.25 mL懸浮液，V/V）牙菌斑CPW混合物和50∶1（20 mL CPW/0.4 mL唾液，V/V）唾液作為接種液，每孔添加1.5 mL接種液，厭氧培養(yǎng)（37℃，10% CO2、10%H2和80%N2）24 h后，每日更新培養(yǎng)基2次，96 h后將培養(yǎng)的牙菌斑唾液懸浮液置低溫（-20℃）保存，用于提取DNA和分析接種物的細菌組成。

1.2.4 牙菌斑生物膜處理

取1.2.3項下培養(yǎng)96 h后的生物膜樣本，按1.2.1項下分組給予相應(yīng)溶液（每孔1.8 mL）浸泡處理10 min后，用CPW（每孔1.9 mL）沖洗生物膜，在板中上下移動蓋子10次，重復沖洗3次。蓋上蓋子，37℃厭氧條件下培養(yǎng)3 h，-80℃凍存。

1.2.5 牙菌斑生物膜活性檢測

用無菌鑷子取出每個附有生物膜的透明質(zhì)酸圓盤，并將其放入含2 mL PBS的無菌小瓶，置冰上，超聲處理2 min，旋轉(zhuǎn)30 s后進行連續(xù)稀釋，并采用胰蛋白酶大豆瓊脂血平板進行總活菌計數(shù)。在厭氧條件下（37℃，10%CO2、10%H2和80%N2）培養(yǎng)7 d后，進行菌落形成單位（cfu）計數(shù)。采用毛細管電泳法測定生物膜中琥珀酸、甲酸、醋酸、乳酸、丙酸和丁酸水平（檢測時，所有樣本中均添加0.12 mmol/L內(nèi)標物草酸鹽）。

1.2.6 微生物構(gòu)成分析

在500 μL懸浮生物膜中加入2.5 μL PMA，于冰上避光靜置5 min后使用鹵素燈（功率650 W）距離樣品25 cm照射2 min，以篩選膜完整的細胞。提取樣本DNA，采用基因組測序儀FLX鈦系統(tǒng)對每個樣本進行匯總和測序。采用人類口腔微生物組數(shù)據(jù)庫（HOMD）參考集（13.2版）的微生物核苷酸BLAST確定菌屬構(gòu)成。

1.2.7生物膜形成能力檢測

取1.2.4項下-80℃凍存的牙菌斑生物膜，于5 mL MHB中37℃搖菌培養(yǎng)過夜，取100 μL菌液，并調(diào)至0.5麥氏濁度后，精密吸取10 μL菌液置含有190 μL MHB的96孔板中，按分組試劑處理，37℃培養(yǎng)1 d后棄培養(yǎng)液及浮游細菌。以戊二醛固定，振蕩20 min，PBS清洗3次，37℃干燥，加入0.1%結(jié)晶紫液振蕩30 min。加水洗凈，37℃干燥，加入10%乙酸提取結(jié)晶紫液，1 h后采用酶標儀測定530 nm波長處的吸光度（OD530），重復3次，取平均值［4-5］。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行分析。組間比較，行單向排列多變量方差分析；cfu計數(shù)比較，行配對樣本t檢驗；有機酸譜比較，行單因素方差分析；采用配對t檢驗或Wilcoxon秩檢驗比較各處理組試劑與細菌組成的關(guān)系。對P值行Bonferroni校正，校正后P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 相對菌屬豐度

結(jié)果見圖1。可見，檢測得到的生物膜菌屬以韋榮氏球菌屬（otu190，17%）、鏈球菌屬（otu20，21%）和普氏菌屬（otu296，11%）為主。

圖1 12例患者菌斑唾液混合物中主要菌屬相對豐度Fig.1 Relative abundance of major genus of bacteria in plaque saliva mixture of 12 patients

2.2 牙菌斑生物膜菌屬處理效果

結(jié)果顯示，A組生物膜中韋榮氏球菌屬占22%、鏈球菌屬占20%、普氏菌屬占11%。與A組比較，B組生物膜韋榮氏球菌屬（占11%）、鏈球菌屬（占10%）、普氏菌屬（占6%）及C組韋榮氏球菌屬（占13%）、鏈球菌屬（占11%）、普氏菌屬（占5%）相對豐度均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 牙菌斑生物膜活性

A組生物膜的平均總活菌計數(shù)約為每個生物膜5.9×109cfu。與A組比較，B組、C組生物膜的平均總活菌計數(shù)顯著減少（分別約為每張生物膜2.8×109cfu及2.3×109cfu，P＜0.05）。

3組生物膜中琥珀酸含量均較低且組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與A組比較，B組生物膜甲酸、丙酸和醋酸含量及C組生物膜乙酸、丙酸和丁酸含量均顯著降低（P＜0.05）；與B組比較，C組生物膜乳酸含量顯著降低（P＜0.05）。詳見圖2。

圖2 牙菌斑生物膜有機酸含量分析Note：Compared with those in group A，*P＜0.05；compared with those in group B，#P＜0.05（for Fig.2-3）.Fig.2 Content of organic acid in dental plaque biofilm

2.4 生物膜形成能力

與A組比較，B組及C組生物膜OD530均顯著降低（P＜0.05），提示后兩組處理抑制生物膜形成能力均良好。詳見圖3。

圖3 沒食子對生物膜形成能力影響Fig.3 Effect of Galla Turcica on biofilm formation

3 討論

目前主要以化學干預、機械干預以及天然產(chǎn)物治療口腔牙周組織炎癥。局部抗菌藥物使用可有效防止口腔生物膜的發(fā)生發(fā)展，特別是對于難以清潔的口腔區(qū)域。目前氯己定溶液已廣泛用于口腔生物膜控制，但其對口腔黏膜有一定毒性，限制了其長期使用［6］。沒食子水提物是本課題組長期研究的中草藥物質(zhì)，其作用為牙周炎的治療提供了一種有效方法［7］。本研究中通過建立口腔生物膜模型，從微生物學和生態(tài)學的角度研究沒食子提取物對其的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)過不同方法處理口服生物膜的細菌組成、代謝活性等方面有所不同。

目前牙周炎的臨床研究主要集中在牙菌斑的數(shù)量和牙齦炎癥的嚴重程度上，本研究結(jié)果顯示，與A組比較，B組總活菌計數(shù)約降低一半，推測這主要是由于沒食子的選擇抑制特性［8］，B組生物膜中，韋榮氏球菌屬的相對豐度顯著降低，而其他菌屬的相對比例較高。

韋榮氏球菌屬革蘭陰性菌，其特點是缺乏葡萄糖激酶和果糖激酶，在生物膜形成過程中發(fā)揮重要作用［9］，但它不能代謝碳水化合物，而是以乳酸作為能量來源。韋榮氏球菌比例顯著降低可以解釋沒食子提取物處理的生物膜中存在的高乳酸量，同時這些菌屬的相互作用會影響生物膜對乳酸的利用，這可能會影響微生物群落的代謝活性和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，不同的處理方式會導致不同的菌群存活率結(jié)果，同時吸光度也印證了這一結(jié)果。

雖然B組和C組生物膜中乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽的生成量均降低，但C組更顯著。乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽主要由厭氧菌蛋白水解產(chǎn)生，與牙周炎癥有關(guān)［10］。沒食子水提物通過降低乙酸、丙酸和丁酸的濃度及增加齦溝液（GCF）中的乳酸，可促進齦下微生物群對牙周炎癥的控制，從而治療牙周病。而沒食子水提物處理后出現(xiàn)的高濃度乳酸需根據(jù)實際情況分析，當乳酸由益生菌產(chǎn)生時，可作為天然抗菌劑，對牙周炎的治療有效［11］。沒食子水提物在本研究中顯示出良好的處理效果，但仍需進行體內(nèi)實驗以評估這種對非手術(shù)牙周維護治療的潛在影響。C組生物膜中乳酸形成受到抑制，總活菌數(shù)和鏈球菌屬的相對豐度降低和乳酸的產(chǎn)生與既往體外研究結(jié)果一致［12］。

在口腔環(huán)境中，牙齦上菌斑與唾液之間存在持續(xù)的相互作用，因此本研究中使用加熱滅活血清培養(yǎng)基為主體的混合物用作接種物模擬成年人牙齦炎［13］，因為血清是GCF的重要組成部分，影響細菌生長繁殖。本研究中使用唾液和牙菌斑的混合物作為接種源來增加生物膜的多樣性，并將處理期延長至24 h，總處理期延長至96 h，為細菌在生物膜內(nèi)生長提供了時間。有研究證明，同一受試者不同時間取得菌斑和唾液接種物可聚集在一起［14］，表明生物膜在受試者體內(nèi)的微生物組成隨著時間的推移是一致的，其內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，但受試者之間的生物膜物種組成存在明顯差異。本研究結(jié)果顯示，12例患者的體外生物膜菌屬組成存在一定差異，與既往研究結(jié)果類似［15］。

綜上所述，沒食子水提物具有抗口腔生物膜活性，表明其具有治療牙周炎癥的潛力，但仍需在更復雜的生物膜及體內(nèi)、體外環(huán)境下分析其抗口腔生物膜作用。