環(huán)狀RNA在糖尿病腎病中的研究進(jìn)展

姜赫，劉武，呂純懿，張?jiān)t△

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是常見的糖尿病并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因［1］。DKD病理機(jī)制復(fù)雜，涉及代謝紊亂、線粒體氧化應(yīng)激與血流動(dòng)力學(xué)紊亂等［2］?，F(xiàn)有治療在一定程度上只能減緩而不能阻止或逆轉(zhuǎn)DKD 的進(jìn)展［3-4］。因此，進(jìn)一步研究影響DKD 進(jìn)展的病理機(jī)制，以鑒定新的分子標(biāo)志物及開發(fā)新的治療策略至關(guān)重要。隨著分子生物學(xué)及測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的環(huán)狀RNA（circular RNA，CircRNA）被發(fā)現(xiàn)，其功能也被廣泛研究。CircRNA反向剪接的共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)外源核酸酶具有天然的抗性，與線性結(jié)構(gòu)相比更穩(wěn)定，也為CircRNA 作為生物標(biāo)志物和調(diào)控因子奠定了基礎(chǔ)。近年來(lái)，大量研究表明CircRNA與某些腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［5-6］。本文旨在歸納與總結(jié)CircRNA 在DKD 腎臟細(xì)胞損傷中的作用，以期為前臨床提供新的思路。

1 CircRNA的結(jié)構(gòu)與功能

1.1 CircRNA 的合成及生物學(xué)特征 CircRNA 是由前 體 信 使RNA（precursor messenger RNA，premRNA）后向剪接，通過5'-帽結(jié)構(gòu)和3'-聚A 尾的共價(jià)鍵結(jié)合形成的閉環(huán)結(jié)構(gòu)。CircRNA通過內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)、RNA 結(jié)合蛋白驅(qū)動(dòng)和套索驅(qū)動(dòng)實(shí)現(xiàn)其環(huán)化機(jī)制的形成［7］。根據(jù)其序列，可將CircRNA 分為4類：外顯子CircRNA（EcircRNA）、環(huán)內(nèi)含子RNA（CiRNA）、外顯子-內(nèi)含子RNA（EIciRNA）和tRNA內(nèi)含子CircRNA（TricRNA）［8］。CircRNA在不同組織與條件下表達(dá)模式不同，其在大腦和腎臟中含量豐富，在病理狀態(tài)下會(huì)異常表達(dá)，并且可在血液、尿液、唾液以及外泌體中檢測(cè)到［9-10］，因而具有作為生物標(biāo)志物的潛力。

1.2 CircRNA功能

1.2.1 CircRNA作為miRNA的海綿 目前研究最廣泛的CircRNA 的生物學(xué)功能是作為miRNA 的海綿，即CircRNA 與miRNA 反 應(yīng)元件（miRNA response elements，MRE）結(jié)合，通過隔離miRNA 發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RNA（competing endogenous RNA，CeRNA）的作用［11］，從而調(diào)節(jié)下游mRNA的表達(dá)。

1.2.2 與RNA 結(jié) 合 蛋 白（RNA-binding proteins，RBPs）結(jié)合 CircRNA 可與多個(gè)RBPs 相互作用，從而影響它們的作用模式，調(diào)節(jié)生物功能。RBP 基因也可以轉(zhuǎn)錄成許多含有相應(yīng)RBP 結(jié)合位點(diǎn)的CircRNA，如RNA 聚合酶Ⅱ（RNA Polymerase Ⅱ，PolⅡ）可以與CircRNA 結(jié)合，影響CircRNA 的剪接、折疊、穩(wěn)定、加工和定位［12］。RBPs quking-5（QKI-5）通過與CircRNA 相互作用，促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）過 程 中CircRNA的生物發(fā)生［5］。

1.2.3 參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控與翻譯 定位于細(xì)胞核的CircRNA 通過與PolⅡ或剪接因子U1 SnRNP（U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 SnRNP）相互作用，激活其親本基因的轉(zhuǎn)錄［13-14］。作為非編碼RNA，CircRNA 能否被翻譯尚存有爭(zhēng)議。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，由于缺失5'7-甲基鳥苷（M7G）帽和3'聚A 尾，CircRNA 是不能被翻譯的。然而最近研究表明，一些CircRNA，如CircMb1、CircFBXW7、CircPINTexon2和Circ-SHPRH 等可以被翻譯成蛋白質(zhì)或多肽［15］。但這些CircRNA 翻譯的詳細(xì)機(jī)制及大多數(shù)CircRNA衍生肽的功能仍然未知。

2 CircRNA在DKD腎臟細(xì)胞中的作用

DKD 的特征性臨床表現(xiàn)是持續(xù)、緩慢發(fā)展的蛋白尿，其損害可能累及腎臟所有組織，最終導(dǎo)致小動(dòng)脈壁的透明改變［16-17］。早期可出現(xiàn)系膜細(xì)胞異常增殖、基底膜增厚、系膜基質(zhì)增寬、腎小球硬化和足細(xì)胞丟失。盡管腎小管基底膜增厚，但晚期可出現(xiàn)腎小管萎縮、細(xì)胞凋亡增加、間質(zhì)性炎性浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維化和管周毛細(xì)血管稀疏［18］。DKD 的病理過程涉及多種分子途徑，越來(lái)越多的證據(jù)表明CircRNA 異常表達(dá)在DKD 中發(fā)揮作用［6］。有研究表明，腎小管間質(zhì)細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、足細(xì)胞功能障礙與DKD進(jìn)展密切相關(guān)［19］。本文從腎臟細(xì)胞的角度，歸納與總結(jié)DKD中CircRNA的作用。

2.1 在腎小球系膜細(xì)胞損傷中的作用 腎小球系膜細(xì)胞（mesanial cells，MCs）是腎小球的重要構(gòu)成成分，在生理功能和腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。MCs能夠保持腎小球毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)類似于微血管周細(xì)胞的功能。同時(shí)，MCs 有助于系膜基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)濾過表面積，吞噬凋亡細(xì)胞。系膜細(xì)胞肥大、增殖和纖維化已被認(rèn)為是細(xì)胞損傷的常見生物學(xué)反應(yīng)。由于腎小球系膜細(xì)胞異常發(fā)育與DKD的病理變化密切相關(guān)［20］，腎小球MCs被廣泛應(yīng)用于體外DKD研究。

目前，有關(guān)CircRNA 在MCs 中的研究主要集中在細(xì)胞異常增殖、細(xì)胞外基質(zhì)積聚以及纖維化方面。纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、Ⅰ型膠原（collagenⅠ，COLⅠ）、COLⅣ等纖維蛋白增加是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）堆積和系膜細(xì)胞增殖以及纖維化的病理基礎(chǔ)［21-23］。Liu 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，CircHIPK3 在DKD 患者以及高糖誘導(dǎo)的MCs 中上調(diào)，沉默CircHIPK3 后，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor beta-1，TGF-β1）、COLⅠ、COLⅣ、FN 的mRNA 表達(dá)水平降低，細(xì)胞周期蛋白D1、增殖細(xì)胞核抗原的mRNA 豐度明顯下降，沉默miR-185 可逆轉(zhuǎn)這一效果。 這些結(jié)果表明CircHIPK3 通過調(diào)節(jié)MCs 細(xì)胞周期與纖維蛋白沉積調(diào)控DKD 進(jìn)展。Bai 等［25］發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)的MCs、DKD 患者和DKD 大 鼠模型中Circ_DLGAP4 表達(dá)增加，exo-Circ_DLGAP4_通過吸附miR-143 來(lái)調(diào)節(jié)受體酪氨酸蛋白激酶/核因子-κB/基質(zhì)金屬蛋白酶2（ERBB3/NF-κB/MMP2）軸，進(jìn)而促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖和纖維化，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障受損；進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，Circ_DLGAP4 過表達(dá)后通過調(diào)節(jié)miR143/ERBB3/NF-κB/MMP2 通路促進(jìn)DKD 的進(jìn)展。Liu等［26］研究發(fā)現(xiàn)，Circ_0080425（Circ_WBSCR17）與miR-24-3p的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合釋放了抑制miR-24-3p的成纖維生長(zhǎng)因子11（fibroblast growth factor11，F(xiàn)GF11），從而導(dǎo)致DKD進(jìn)展過程中細(xì)胞增殖和纖維化水平升高。Wang 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，Circ_LARP4 在DKD細(xì)胞模型中下調(diào)，隨后將Circ_LARP4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的Circ_LARP4抑制系膜細(xì)胞增殖并增加凋亡率，降低系膜細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)，該過程通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-424 實(shí)現(xiàn)。因此，可以將Circ_LARP4/miR-424細(xì)胞信號(hào)軸作為體外調(diào)控DKD發(fā)生發(fā)展的候選靶點(diǎn)。

此外，CircRNA 參與氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)調(diào)控系膜細(xì)胞損傷。Chen等［28］研究發(fā)現(xiàn)，CircLRP6通過與miR-205 競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)節(jié)高遷移率蛋白B1（high mobility group protein-B1，HMGB1），激活下游TLR4/NF-κB 通路，從而升高活性氧（reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，降低超氧化物歧化酶（serum superoxide dismutase，SOD）活性，并增加基質(zhì)蛋白FN、COLⅠ、COLⅣ與炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達(dá)，提示CircLRP6 通過調(diào)節(jié)MCs 細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、細(xì)胞外基質(zhì)積聚與炎癥反應(yīng)參與DKD 中MCs 損傷?；钚匝醯倪^量產(chǎn)生是DKD 代謝紊亂與腎臟血流動(dòng)力學(xué)紊亂的共同特征［29］，過量活性氧會(huì)引發(fā)腎臟纖維化與炎癥，并通過促脂質(zhì)氧化、DNA 損傷、蛋白修飾及線粒體功能障礙，導(dǎo)致組織損傷。

2.2 在腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用 DKD 的進(jìn)展伴隨著腎小管損害，腎小管上皮細(xì)胞損傷參與了DKD 的發(fā)生，并且在DKD 患者和DKD 動(dòng)物模型中均發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。Li等［30］研究發(fā)現(xiàn)，Circ_WBSCR17 在DKD 小鼠模型和HK-2 細(xì)胞模型中的表達(dá)顯著上調(diào)，Circ_WBSCR17通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-185-5p 激活轉(zhuǎn)錄因子SOX6，SOX6的過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞炎性因子的釋放，抑制細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化。Wen等［31］研究發(fā)現(xiàn)CircACTR2 在高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞中上調(diào)，抑制CircACTR2 顯著減少嗜酸細(xì)胞，并抑制IL-1β、COLⅠ、COLⅣ、FN 等向培養(yǎng)基中的釋放，提示在高糖環(huán)境下，CircACTR2 可調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的近端腎小管細(xì)胞焦亡、炎癥和纖維化。Zhuang 等［32］研究表明，CircHIPK3 在高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞中下調(diào)，將CircHIPK3高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CircHIPK3 過表達(dá)上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，而下調(diào)了caspase3 和Bax 的表達(dá)。其證實(shí)了CircHIPK3 過表達(dá)通過促進(jìn)HK-2細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡來(lái)減輕高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

2.3 在足細(xì)胞損傷中的作用 足細(xì)胞是終末分化的上皮細(xì)胞，損傷后不易增殖和再生，作為腎小球?yàn)V過膜的組成部分，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與數(shù)量穩(wěn)定是維持腎小球?yàn)V過率的基礎(chǔ)。足細(xì)胞損傷是DKD 細(xì)胞損傷中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［33］，CircRNA 作為miRNA 的海綿與miRNA通過抗氧化、抗炎等途徑共同調(diào)節(jié)DKD足細(xì)胞凋亡和損傷。Yao等［34］研究發(fā)現(xiàn)，Circ_0000285在DKD 足細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，將CIRC_0000285 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠足細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞周期被阻滯在G1 期，細(xì)胞增殖受到抑制，凋亡增加，并且Circ_0000285 充當(dāng)miR-654-3p 的海綿激活絲裂原活化蛋 白 激 酶6（mitogen-activated protein kinase 6，MAPK6），調(diào)節(jié)炎性因子釋放，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。

另外，高糖環(huán)境促進(jìn)快速氧化應(yīng)激，是足細(xì)胞減少的主要原因［35］?；钚匝醯倪^量產(chǎn)生與抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的還原共同導(dǎo)致細(xì)胞線粒體損傷［36］。而GPX4作為調(diào)節(jié)維持組織內(nèi)環(huán)境平衡的關(guān)鍵酶，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致膜脂過氧化產(chǎn)物積聚［37］，從而導(dǎo)致鐵依賴性非凋亡性細(xì)胞死亡，即鐵死亡［38］。有研究表明，CircRNA 以鐵依賴的方式發(fā)揮作用［39］。Jin 等［40］研究發(fā)現(xiàn)MMU_CircRNA_0000309在DKD小鼠足細(xì)胞中下調(diào)，并通過激活miR-188-3p/GPX4 途徑調(diào)節(jié)線粒體損傷以及鐵死亡，從而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。但由于目前CircRNA 在DKD 足細(xì)胞中的研究較少，證據(jù)尚不充分，因此繼續(xù)明確CircRNA 在足細(xì)胞損傷中的分子機(jī)制，仍是后續(xù)待探討的問題。

3 CircRNA在DKD中的研究前景

氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、纖維化等腎臟細(xì)胞損傷被認(rèn)為是DKD 發(fā)病的相關(guān)因素［2］，因此探索抑制細(xì)胞損傷的有效藥物可以協(xié)助治療。目前，CircRNA已被證實(shí)是前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、阿爾茨海默病以及急性心肌梗死等疾病的候選生物標(biāo)志物［41-43］，而且在DKD 動(dòng)物模型中也展現(xiàn)出基因治療的潛力。Peng 等［44］利用超聲-微泡介導(dǎo)的Circ_010383表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入DKD模型小鼠腎臟中，發(fā)現(xiàn)可以延緩腎小球硬化與腎小管間質(zhì)纖維化，恢復(fù)腎功能。

雖然許多CircRNA 已經(jīng)在腎臟組織中被證實(shí)，但其在DKD 發(fā)展過程中的表達(dá)譜和潛在作用，如何對(duì)其調(diào)控，與特定蛋白以及其他非編碼RNA的相互作用機(jī)制尚不清楚。因此，進(jìn)一步深入了解CircRNA在DKD發(fā)病機(jī)制中的分子功能有助于更好地理解腎臟的病理生理。研究這些分子在細(xì)胞和動(dòng)物模型中的潛在功能，進(jìn)一步探討CircRNA 在腎臟疾病中的預(yù)測(cè)作用，仍是后續(xù)研究應(yīng)努力的方向。

4 小結(jié)

腎小球細(xì)胞與腎小管細(xì)胞具有不同的病理生理功能，但其相互作用，共同調(diào)控DKD 的進(jìn)展。CircRNA可能是DKD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子以及治療的有效途徑。目前的證據(jù)主要來(lái)自腎小球系膜細(xì)胞與腎小管上皮細(xì)胞，CircRNA 在其他腎臟細(xì)胞中的功能有待進(jìn)一步研究。隨著基因芯片和高通量測(cè)序等技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，CircRNA 在DKD 中發(fā)揮的作用會(huì)逐步被闡明，有助于進(jìn)一步深入了解CircRNA 在DKD 發(fā)病機(jī)制中的分子功能，更好地理解腎臟的病理生理機(jī)制，并研究這些分子在細(xì)胞和動(dòng)物模型中的潛在治療能力，為以后科研成果轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。