呼吸道合胞病毒毛細(xì)支氣管炎嬰幼患兒外周血miR-155與PDCD4表達(dá)的相關(guān)性研究

王剛，王瓊，姜昕，鄭靜

毛細(xì)支氣管炎屬下呼吸道感染性疾病，臨床癥狀主要為咳嗽、喘憋，因嬰幼兒的免疫抵抗力較差，因此該疾病多發(fā)人群以嬰幼兒為主［1］。其中，由呼吸道合胞病毒（RSV）誘發(fā)的毛細(xì)支氣管炎占比較大。病情較輕的患兒經(jīng)治療后可恢復(fù)，嚴(yán)重者如未得到及時有效治療則可能發(fā)展為肺氣腫、哮喘甚至死亡，嚴(yán)重威脅嬰幼兒的生命健康［2］。目前尚未發(fā)現(xiàn)診斷RSV 毛細(xì)支氣管炎的有效因子，因此尋找生物標(biāo)志物十分必要。微小RNA（miRNA）是一類高度保守的小RNA，通過與其靶基因特異性結(jié)合，調(diào)控人類約30%的基因表達(dá)，在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，其中miR-155 是其家族中重要的一員［3］。有研究表明，RSV 肺炎嬰幼兒外周血miR-155 水平升高，且miR-155 水平與炎性因子呈正相關(guān)［4］。程序性細(xì)胞死亡因子4（PDCD4）在多種腫瘤中發(fā)揮抑瘤作用，參與細(xì)胞周期、增殖、凋亡等過程。PDCD4受多種miRNA的調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病血管鈣化患者血清miR-155 和PDCD4 mRNA呈顯著負(fù)相關(guān)，且兩者之間存在結(jié)合位點(diǎn)，推測可能是miR-155 通過靶向PDCD4 影響糖尿病腎病患者發(fā)生血管鈣化［5］。目前，關(guān)于miR-155 和PDCD4 在RSV 毛細(xì)支氣管炎中的研究較少。本研究擬探究RSV毛細(xì)支氣管炎嬰幼兒外周血miR-155與PDCD4表達(dá)的關(guān)系，旨在為該疾病的診治提供一定的參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 以2018 年2 月—2021 年2 月上海浦濱兒童醫(yī)院兒內(nèi)科收治的106 例RSV 毛細(xì)支氣管炎嬰幼兒為研究組，其中男57 例，女49 例，年齡36 d～36 個月，平均（6.32±1.74）個月。按照《毛細(xì)支氣管炎診斷、治療與預(yù)防專家共識（2014 年版）》［6］分為輕癥組36 例、中癥組41 例和重癥組29例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》中RSV 毛細(xì)支氣管炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。（2）從發(fā)病到入院≤3 d。（3）年齡≤36個月。（4）鼻咽部RSV檢查陽性。（5）雙肺伴有濕啰音和哮鳴音。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有先天免疫系統(tǒng)疾病者。（2）伴有心、肝、腎疾病者。（3）2周內(nèi)服用過糖皮質(zhì)激素及抗菌藥物者。（4）精神系統(tǒng)紊亂、不能積極配合治療者。另選擇同期在本院兒保門診健康體檢的嬰幼兒65 例為對照組，體檢結(jié)果正常，排除2周內(nèi)服用過糖皮質(zhì)激素及抗菌藥物者，其中男36 例，女29例，年齡38 d～36 個月，平均（6.65±1.79）個月。2 組性別（χ2=0.042）、年齡（t=1.175）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)嬰幼兒家屬簽署知情同意書，并經(jīng)上海浦濱兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol 試劑（廣州東盛生物科技有限公司）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司）；miScript SYBR?Green qPCR 試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司）；miR-155、U6 引物（廣東文華氏生物科技有限公司）；人PDCD4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海仁捷生物科技有限公司）；人超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10、腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；PCR儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集 采集各組嬰幼兒空腹外周靜脈血3～5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血清miR-155水平檢測 在血清樣品中加入Trizol試劑提取總RNA。將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用miScript SYBR?Green qPCR 試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃60 s；95 ℃15 s，63 ℃30 s，72 ℃15 s，共40 個循環(huán)，以U6為miR-155的內(nèi)參，其相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算，引物序列見表1。

Tab.1 qPCR primer sequence表1 qPCR引物序列

1.3.3 血清PDCD4 及炎性因子水平檢測 采用ELISA 法檢測血清PDCD4 及炎性因子hs-CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 水平，其試驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用軟件SPSS 23.0處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以例表示，2 組間比較行χ2檢驗(yàn)；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。Pearson 相關(guān)分析RSV 毛細(xì)支氣管炎嬰幼兒血清miR-155和PDCD4的關(guān)系，以及兩者與炎性因子的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組嬰幼兒血清miR-155 和PDCD4 表達(dá)水平比較 與對照組相比，研究組患兒血清miR-155 水平升高，PDCD4水平降低（P＜0.01），見表2。

Tab.2 The serum expression levels of miR-155 and PDCD4 in the two groups of infants表2 2組嬰幼兒血清miR-155、PDCD4表達(dá)水平（±s）

Tab.2 The serum expression levels of miR-155 and PDCD4 in the two groups of infants表2 2組嬰幼兒血清miR-155、PDCD4表達(dá)水平（±s）

＊＊P＜0.01。

組別對照組研究組t n 65 106 miR-155/U6 1.02±0.18 2.14±0.36 23.339＊＊PDCD4（μg/L）4.97±0.96 2.84±0.41 20.078＊＊

2.2 病情輕、中、重3 組患兒血清miR-155 和PDCD4 表達(dá)水平比較 與輕癥組嬰幼兒相比，中癥組血清miR-155 水平上升，PDCD4 水平下降（P＜0.05），與中癥組相比，重癥組miR-155 水平上升，PDCD4水平下降（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Expression levels of serum miR-155 and PDCD4 in the three groups of infants表3 3組患兒血清miR-155、PDCD4表達(dá)水平（±s）

Tab.3 Expression levels of serum miR-155 and PDCD4 in the three groups of infants表3 3組患兒血清miR-155、PDCD4表達(dá)水平（±s）

＊＊P＜0.01；a與輕癥組比較，b與中癥組比較，P＜0.05。

組別輕癥組中癥組重癥組F n 36 41 29 miR-155/U6 1.71±0.26 2.01±0.31a 2.85±0.56ab 75.469＊＊PDCD4（μg/L）4.19±0.62 2.44±0.34a 1.74±0.26ab 276.596＊＊

2.3 2組嬰幼兒血清炎性因子水平比較 與對照組相比，研究組患兒血清炎性因子hs-CRP、IL-6、IL-10、TNF-α水平均上升（P＜0.01），見表4。

Tab.4 Comparison of serum inflammatory factors between the two groups表4 2組嬰幼兒血清炎性因子水平比較 （±s）

Tab.4 Comparison of serum inflammatory factors between the two groups表4 2組嬰幼兒血清炎性因子水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01。

組別對照組研究組t n 65 106 hs-CRP（mg/L）131.39±30.27 225.43±49.36 13.838＊＊IL-6（ng/L）109.61±21.47 196.93±33.85 18.616＊＊IL-10（ng/L）116.96±28.59 189.33±31.47 15.105＊＊TNF-α（ng/L）4.02±1.16 5.67±1.54 7.438＊＊

2.4 血清miR-155 與PDCD4 及兩者與炎性因子的關(guān)系 生物信息學(xué)網(wǎng)站ENCORI 顯示，miR-155 和PDCD4 之間存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。且Pearson 相關(guān)性分析顯示，兩者水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.790，P＜0.01）。此外，血清miR-155 水平與炎性因子hs-CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 均呈正相關(guān)（r分別為0.561、0.701、0.651 和0.676，均P＜0.01），PDCD4 與上述炎性因子均呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.580、-0.752、-0.713和-0.671，均P＜0.01）。

Fig.1 Binding site map between miR-155 and PDCD4圖1 miR-155和PDCD4之間的結(jié)合位點(diǎn)圖

3 討論

3.1 RSV 毛細(xì)支氣管炎研究目的及意義 毛細(xì)支氣管炎是由細(xì)菌、病毒、支原體等多種病原體引發(fā)的感染性疾病，RSV 是感染較多的病原體，約占36.32%，該病多發(fā)于3歲以下的嬰幼兒，由于該類人群免疫力差，容易反復(fù)感染，傷及肺部［8-9］。因此，探究可以準(zhǔn)確診斷RSV毛細(xì)支氣管炎以及評估患兒病情發(fā)展?fàn)顩r的輔助指標(biāo)具有積極意義。

3.2 血清miR-155 表達(dá)與RSV 毛細(xì)支氣管炎發(fā)展及炎癥指標(biāo)的關(guān)系 miRNA 是長為20～25 nt 的小RNA，具有一定的內(nèi)源性，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等重要生理過程，miRNA 在基因網(wǎng)絡(luò)中與多種靶基因形成調(diào)控網(wǎng)，通過降解mRNA 參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程［10］。多種miRNA在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［11］。miR-155 是一種多功能miRNA，其作為促炎基因通過多種調(diào)控過程參與炎性疾病的發(fā)展［4］。馮瓊等［12］研究表明，與對照組相比，新生兒肺炎患者血清miR-155水平明顯上調(diào)，經(jīng)治療后其水平顯著降低，且miR-155 水平與炎性因子降鈣素原（PCT）、IL-6水平呈正相關(guān)，對新生兒肺炎有一定的診斷價值。Arroyo 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，RSV感染患兒鼻腔樣本中miR-155水平較對照組明顯升高，且過表達(dá)的miR-155 與患兒呼吸道疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。在本研究中，研究組嬰幼兒血清miR-155水平顯著升高，且miR-155 水平隨著RSV 毛細(xì)支氣管炎嚴(yán)重程度加重而明顯上升，與Arroyo 等［13］研究結(jié)果一致，提示miR-155 參與了RSV 毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生和發(fā)展。此外，本研究結(jié)果顯示研究組患兒血清炎性因子hs-CRP、IL-6、IL-10、TNF-α 水平均上升，且其水平與miR-155 水平均呈正相關(guān)。這與黃佩等［14］研究結(jié)果一致，提示miR-155 可作為輔助指標(biāo)與常見炎性因子共同監(jiān)測RSV下呼吸道感染疾病的發(fā)生。

3.3 血清PDCD4 表達(dá)與RSV 毛細(xì)支氣管炎發(fā)展及炎癥指標(biāo)的關(guān)系 PDCD4 是新型的腫瘤抑制因子，廣泛表達(dá)于多種組織，在多種腫瘤中抑制癌細(xì)胞的生長，并促進(jìn)其凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的PDCD4可為腫瘤生長創(chuàng)造適宜的環(huán)境［15］。另有研究表明，冠心病心源性猝死患者心肌組織中PDCD4 水平呈低表達(dá)，推測其作用與調(diào)控炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［16］。Wang 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，缺乏PDCD4 可上調(diào)促炎因子（如IL-6）表達(dá)，加重急性結(jié)腸炎病情，進(jìn)而誘發(fā)向結(jié)直腸癌演變。本研究中，研究組嬰幼兒血清PDCD4水平較對照組顯著降低，且其水平隨著RSV 毛細(xì)支氣管炎嚴(yán)重程度加重而明顯下調(diào)，提示PDCD4在該病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮調(diào)控作用。PDCD4與炎性因子均呈負(fù)相關(guān)，推測PDCD4在RSV毛細(xì)支氣管炎中可能發(fā)揮抑制炎癥的作用。Xia等［18］研究發(fā)現(xiàn)，多囊卵巢綜合征患者卵巢組織中miR-155 呈高表達(dá)，且miR-155 靶向負(fù)調(diào)控PDCD4，從而促進(jìn)人卵巢顆粒細(xì)胞株（KGN）的增殖、遷移和侵襲。Liu等［19］研究表明，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中miR-155表達(dá)上調(diào)，PDCD4表達(dá)下調(diào)，表明miR-155可通過直接靶向PDCD4發(fā)揮致癌作用。結(jié)合本研究，生物信息學(xué)分析顯示miR-155 和PDCD4 有結(jié)合位點(diǎn)，相關(guān)性分析顯示兩者水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-155與PDCD4共同參與該疾病的進(jìn)展。

綜上所述，RSV毛細(xì)支氣管炎嬰幼兒血清miR-155和PDCD4水平異常表達(dá)，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且其水平與炎性因子密切相關(guān)，有望成為早期檢測病情發(fā)展的輔助生物標(biāo)志物。但本研究樣本量偏少，且缺少機(jī)制方面的研究，下一步研究將擴(kuò)大樣本量，補(bǔ)充動物實(shí)驗(yàn)，為RSV 毛細(xì)支氣管炎的診治和病情評估提供更加詳實(shí)的數(shù)據(jù)參考。