海南降香黃檀（黃花梨）樹籽中總黃酮含量的超聲波輔助提取

傅琪彥 符秀娟 林麗珍 丁兆建

（1.海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 海南 ?？?570216；2. 瓊臺師范學(xué)院 海南 ?？?571127）

我國特有的瀕危藥用植物降香黃檀，其樹干和根的干燥心材是一味珍貴的傳統(tǒng)中藥降香，含有的主要成分為黃酮類化合物。眾所周知，降香黃檀樹齡達(dá)10年左右開始形成心材，轉(zhuǎn)化速度慢，20~30年后才有一定收獲價值；但其一般5年就可開始結(jié)籽，之后每年均可收獲，不像獲取心材那樣需要砍伐林木。降香黃檀籽在海南民間也像心材那樣被普遍利用，具有降血壓血脂、舒筋活血和鎮(zhèn)痛消炎等功效，然而，對降香黃檀樹籽中黃酮類成分的提取和利用的研究仍不多見。

本文應(yīng)用超聲波提取法，以降香黃檀樹籽為研究對象，對其中黃酮類成分進(jìn)行提取分離和測定，研究提取工藝參數(shù)如乙醇濃度、溶劑用量、超聲作用時間、提取溫度和提取次數(shù)對提取得率的影響，探索一種快速簡便的降香黃檀籽黃酮提取方法，挖掘降香黃檀的應(yīng)用價值，為其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，從而有效保護(hù)海南降香黃檀的林木資源。

1.實驗材料與儀器

實驗用的降香黃檀樹籽在海南省屯昌縣采集，挑選其中粒大飽滿完好無損的樹籽，烘箱烘干后整理，然后粉碎過60目篩，粉末在4℃環(huán)境密封保存。

主要儀器：普析UV-1810APC紫外可見分光光度計、SDO-1018T超聲波發(fā)生器、BL-200型高速多功能粉碎機、TDL-50B型 臺式離心機、DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

藥品：蘆?。?biāo)準(zhǔn)品），95%乙醇（分析純）、硝酸鋁、亞硝酸鈉等。

2.實驗方法

2.1 提取工藝

將上述得到的降香黃檀籽粉末浸泡到不同濃度、不同溶劑用量倍數(shù)的乙醇溶液中，不同溫度下水浴加熱于超聲波發(fā)生器中，進(jìn)行不同功率和時間的超聲波作用，所得溶液用離心機在4000r/min條件下作用15分鐘，上清液抽濾后，定容得到所需的提取液。

2.2 降香黃檀籽中含有黃酮類化合物的確定

取 1.0g 降香黃檀籽粉末，加入95%乙醇25.0mL在65℃中超聲提取30min，離心后取適量的上清液于兩支試管中，分別進(jìn)行鹽酸-鎂粉反應(yīng)和三氯化鐵反應(yīng)，看是否有黃酮類化合物的特征顯色反應(yīng)。降香黃檀籽醇提取液加入鹽酸-鎂粉后顯紅色，加入 5%三氯化鐵醇溶液后出現(xiàn)深褐色沉淀，表現(xiàn)出明顯的黃酮類化合物的特征顏色反應(yīng)。對照試驗排除了假陽性。

2.3 分光光度計波長范圍的確定

用 50%乙醇溶解精確稱取的20mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，定容至 100mL，得到 200μg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。另在50mL 50%乙醇中加入3.00g 降香黃檀籽粉末，于65℃超聲提取30min，離心后取上清液，再重復(fù)將濾渣層提取一次，合并兩次提取液，定容至 100mL。

取上述 1.0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和 1.0mL 降香黃檀籽提取液，分別加入0.3mL 5%NaNO2溶液，搖勻后靜置 6min，加入 0.3mL 10% Al（NO3）3溶液，再搖勻后靜置6min，加入 4.0mL 4%NaOH 溶液，50%乙醇定容至 10mL，放置10min，用分光光度計測量460～550nm范圍內(nèi)的吸光值。

結(jié)果表明，在堿性條件下蘆丁和降香黃檀籽黃酮提取液與NaNO2-Al（NO3）3-NaOH生成紅色鋁螯合物，其在510nm波長附近都有最大吸收峰。實驗發(fā)現(xiàn)，上述供試品的吸光值在30min內(nèi)較穩(wěn)定，之后吸光值下降較快。為得到穩(wěn)定可靠的吸光值，本實驗在加入顯色劑10min內(nèi)測定，選取測定的吸收波長為 510nm。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取2.3節(jié)中配制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL，分別置于不同的10mL容量瓶中，然后依次加入0.3mL 5%NaNO2溶液、0.3mL 10%Al（NO3）3溶液，最后再加入4.0mL 4%NaOH 溶液，每種溶液加入后均需搖勻并靜置 6min再加入后一種溶液，最后用50%乙醇定容至刻度，搖勻放置 10min。

準(zhǔn)備好的樣品用分光光度計在 510nm波長處測吸光度，以空白溶液為參比，作蘆丁濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖 1），得回歸方程y=0.0112x-0.0003，R2=0.9982。式中y為吸光度A值，x為蘆丁濃度C（μg/mL），測定范圍為 10～60μg/mL。

圖1 蘆丁濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 原料中總黃酮得率的測定 方法

為了測定降香黃檀籽中黃酮（包括黃酮 、異黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇、雙黃酮等）的總含量，可使黃酮結(jié)構(gòu)中相鄰羰基、羥基與金屬離子絡(luò)合而顯色，根據(jù)顯色深淺，即吸光度A值大小，依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品曲線建立的回歸方程，計算總黃酮含量。

精密稱取5.0g降香黃檀籽樣品粉末，浸泡于一定濃度乙醇溶液60min，而后在水浴中進(jìn)行超聲波提取，離心，上清液減壓抽濾，收集濾液，用50%乙醇溶液定容，制得供試品溶液，測其在510nm吸收波長下吸光度A。用2.4節(jié)的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算供試品溶液中總黃酮濃度C（μg/mL），從而計算超聲波輔助提取降香黃檀籽粉末中總黃酮得率W %。

式中：W%—供試品中提取總黃酮的得率（%），C—供試品溶液中總黃酮的濃度（μg／mL），n—稀釋倍數(shù)，V—供試品溶液定容體積（mL），m—降香黃檀籽粉樣品的質(zhì)量（g）。

3.結(jié)果與分析

運用單因素試驗法研究影響得率的工藝關(guān)鍵參數(shù)，測量了各參數(shù)與總黃酮提取得率的關(guān)系。稱取5.0g降香黃檀籽樣品粉末，固定其他條件，分別考 察單因素，如乙醇濃度（20%、40%、50%、60%和80%）、樣品粉末 與 溶 劑 用 量（10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍）、超聲波功率（120W、130W、140W、150W、160W、170W、180W）、超聲作用時間（10、20、30、40和50min）、提取溫度（35、45、55、65、75℃）和提取次數(shù)（1-3次）對總黃酮得率的影響。

3.1 乙醇濃度的影響

在固定其他條件時，分別考察影響總黃酮得率的關(guān)鍵單因素乙醇濃度（20%、40%、50%、60%和80%），按照2.5節(jié)的方法操作，計算得率。

由圖2可見，隨著乙醇濃度從20%逐步增加，降香黃檀籽總黃酮的得率也快速增加，得率最大值對應(yīng)的乙醇濃度為60%；當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加并升至70%時，總黃酮提取得率反而緩慢降低。因此選定60%乙醇作為降香黃檀籽總黃酮的最佳提取溶劑濃度。分析原因認(rèn)為主要是提取溶劑極性發(fā)生變化造成的影響，根據(jù)相似相溶原理，只有在一定的極性即合適的乙醇和水的混合比例下，黃酮類成分才能比較充分地溶解出來。

圖2 乙醇濃度對提取降香黃檀籽總黃酮得率的影響

3.2 提取溶劑用量的影響

在固定其他條件時，分別考察樣品粉末與溶劑用量（10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍）與降香黃檀籽總黃酮得率的關(guān)系。

隨著溶劑用量從10倍逐步增加，總黃酮的得率也快速增加，得率最大值對應(yīng)的溶劑用量為25倍；當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加并達(dá)到30倍，總黃酮得率仍有所提高。通常認(rèn)為，提取過程中乙醇溶劑量越大，有效成分越能充分溶解，因此提取量也越大。圖3中當(dāng)溶劑用量大于30倍，得率曲線趨緩并形成平臺，是因為此時有效成分的溶解和擴散已達(dá)到平衡，增加乙醇溶劑不會增加有效成分的溶解，反而是增加了溶劑成本以及后續(xù)工藝中提取液的過濾濃縮和溶劑回收難度。當(dāng)選定60%乙醇作為降香黃檀籽總黃酮的最佳提取劑濃度時，最佳溶劑用量選擇為25倍。

圖3 提取溫度對黃酮得率的影響

3.3 超聲功率的影響

固定其他條件時，分別考察超聲功率（120W、130W、140W、150W、160W、170W、180W）與降香黃檀籽總黃酮得率的關(guān)系。

當(dāng)功率在120W到180W之間變化時，得率在一定范圍內(nèi)波動，趨勢變化不大，說明超聲功率的大小對黃酮得率的影響不大。可以選取較低的120W常見功率進(jìn)行提取。

3.4 超聲作用時間的影響

在固定其他條件時，分別考察超聲作用時間（10、20、30、40和50min）與降香黃檀籽總黃酮得率的關(guān)系。

當(dāng)提取時間從10min增加至 30min 時總黃酮得率顯著提高，當(dāng)提取時間超過30 min后總黃酮得率曲線顯示出緩慢變化的平臺。與溶劑用量增加的變化規(guī)律相似，當(dāng)提取時間超過30min 后，黃酮類化合物在料液之間的傳遞基本達(dá)到動態(tài)平衡，繼續(xù)增加提取時間不會有更多有效成分析出，因而得率增加的效果不大。綜合考慮總黃酮的得率及提取時間成本，降香黃檀籽總黃酮的最佳提取時間選定為30min。

3.5 提取溫度的影響

在固定其他條件時，分別考察提取溫度（35、45、55、65、75）與降香黃檀籽總黃酮得率的關(guān)系。

圖3可見，提取溫度對總黃酮得率影響較大的溫區(qū)在35℃至65℃之間，此時隨溫度提升總黃酮得率提高得較快，但溫度超過65℃之后提取效果的增加就不大明顯了。因為，適當(dāng)高的溫度可以促進(jìn)植物組織軟化和膨脹，蛋白質(zhì)和酶易被破壞和凝固，增加有效成分的溶解及擴散速度，有利于有效成分的提取。但溫度過高，會造成料液中一些熱不穩(wěn)定成分的氧化和破壞。對比數(shù)據(jù)可以認(rèn)為，降香黃檀籽總黃酮的最佳提取溫度為65℃左右。

3.6 提取次數(shù)的影響

在固定其他條件時，分別考察提取次數(shù)（1~3次）與降香黃檀籽總黃酮得率的關(guān)系。結(jié)果表明，要獲得較高的降香黃檀籽總黃酮得率，需要進(jìn)行至少2次提取。第1次的得率為 3.12%，原料中剩余的黃酮類成分還較多；在第2次提取時得率達(dá)到 3.64%，此時原料中黃酮類成分已剩余不多。而提取3次時總黃酮得率幾乎沒有太多增加。因此，選定降香黃檀籽總黃酮的最佳提取次數(shù)為2次。

4.結(jié)論

對海南降香黃檀（黃花梨）樹籽中總黃酮含量進(jìn)行超聲波輔助提取的優(yōu)化測試，運用單因素試驗法獲得了提取工藝的關(guān)鍵參數(shù)。實驗中采用紫外分光光度計，以蘆丁作標(biāo)準(zhǔn)品，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 作顯色劑，建立了降香黃檀籽總黃酮含量的簡易測定方法。運用單因素試驗法獲得優(yōu)化的關(guān)鍵工藝參數(shù)為：乙醇濃度為 60%、溶劑用量為25倍、提取時間為3 0min、提取溫度為65℃、提取次數(shù) 2次。在這一條件下，降香黃檀籽總黃酮的最高得率能達(dá)到 3.64%。查詢文獻(xiàn)，不同來源的降香總黃酮含量為2.51%~5.82%。因此，與降香黃檀心材相比，黃酮含量較高的降香黃檀籽是一種未被利用的原料，其黃酮類化合物需要進(jìn)一步研究以便開發(fā)利用。

超聲波輔助提取具有高效、節(jié)能和工藝簡單的優(yōu)點，充分利用總黃酮含量較高的降香黃檀籽，將有利于提升對海南降香黃檀林木資源的保護(hù)。