秀珍菇采后病原菌的鑒定及精油防治

章 奕，崔 杰，何若銘，何志平，劉興泉，時浩杰

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 浙江省糧食局直屬糧油儲備庫，浙江 杭州 310000；3. 浙江省糧食干部學(xué)校，浙江 杭州 310000）

秀珍菇Pleurotus geesteranus是一種常見的食用菌[1]，營養(yǎng)豐富、味道鮮美。但秀珍菇采后易發(fā)生病害而造成品質(zhì)下降，常溫下僅能儲藏2 ～3 d[2]。微生物侵染是秀珍菇儲藏過程中品質(zhì)下降的主要原因。秀珍菇由于質(zhì)地脆嫩，品質(zhì)易受溫度影響，傳統(tǒng)低溫儲藏雖能在一定程度上延長秀珍菇保鮮期，但易產(chǎn)生低溫冷害，無法長期保存[3?4]。食用菌采后病害影響其儲藏品質(zhì)，不同種類食用菌的致病菌不同，哈茨木霉Trichoderma harzianum是引發(fā)金針菇綠霉病的主要致病菌，托拉斯假單胞桿菌Pseudomonas tolaasii能夠引發(fā)雙孢菇濕泡病等[4]。

植物精油是一類從植物中提取的次生代謝物質(zhì)，具有廣譜的抑菌性，易于生物降解和相對安全的特性，近年來在果蔬采后病害防治領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[5?6]，但在食用真菌的防腐保鮮研究較少。具有采后病害控制作用的植物精油主要有香茅Mosla chinensis精油、桉Eucalyptus robusta精油、甜橙Citrus sinensis精油等，在果蔬的防腐保鮮中均有較好的防治效果[7?9]，精油是具有潛在應(yīng)用價值的生物防治保鮮劑[10-12]，不同的精油對各類果蔬采后致病菌的防治效果不盡相同。本研究對秀珍菇采后儲藏中的主要病原菌進(jìn)行分離鑒定，篩選有效精油對其進(jìn)行抑制，以期為植物精油的秀珍菇采后保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秀珍菇采自浙江杭州臨安鼎新農(nóng)業(yè)科技有限公司；精油購于江西國光香料廠(純度＞99%)，主要來自檀香Santalum album、艾蒿Artemisia argyi、石菖蒲Acorus tatarinowii、甜橙、香茅、洋甘菊Anthemis nobilis、青蒿Artemisia annua、柏木Cupressus funebris、大蒜Allium sativum、橘Citrus reticulata、花椒Zanthoxylum bungeanum、茴香Foeniculum vulgare、桉等植物。

培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA，上海博微生物科技有限公司)和馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB，上海博微生物科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器有LDZX50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械)、智能光照培養(yǎng)箱(寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)、SW-CJ-IC型雙人單面凈化工作臺(蘇州蘇信環(huán)境科技有限公司)、HI2315型高精度電導(dǎo)率儀(北京哈納科科技有限公司)、Sigma 500掃描電子顯微鏡(德國)、HZ-2111KA恒溫?fù)u床(華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)。

1.3 方法

1.3.1 秀珍菇主要致病菌分離純化 用無菌手術(shù)刀在秀珍菇發(fā)病處切取病害和健康交界處的組織，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇表面消毒30 s，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干水分后置于PDA平板中心，28 ℃培養(yǎng)3 ～5 d至組織發(fā)病。用無菌接種針挑取病癥表面菌絲，置于PDA平板中心，28 ℃培養(yǎng)5 d后，挑取邊緣菌絲純化接種，直至菌落單一。出現(xiàn)單一菌落后，接入PDA斜面試管，用甘油封存后置于4 ℃冰箱保存。

1.3.2 病原菌致病性檢測 根據(jù)柯赫氏法則，確定秀珍菇致病性。挑取健康無病害，無機(jī)械損傷，大小均一的秀珍菇，采用針刺法將純化后的菌絲回接至秀珍菇表面。置于室溫(25 ℃)培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況，以不接菌絲作為對照。發(fā)病后進(jìn)行致病菌的分離純化，方法同1.3.1。判斷發(fā)病后純化的菌株與回接的菌株是否一致，如一致，則進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將試管中保存的菌絲活化，接種于PDA平板中，于28 ℃下培養(yǎng)，每天觀察菌落特征，產(chǎn)孢后在菌落邊緣挑取適量菌絲，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)，并根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征初步判斷其種屬。

1.3.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定 將培養(yǎng)4 ～5 d的平板，委托上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列擴(kuò)增引物為ITS1和ITS4[13]，其引物序列為ITS1：5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGGC-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，測序所得 rDNA 序列在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上，利用BLAST將ITS序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行對比，尋找同源性較大的物種，下載其序列，利用MEGA軟件構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，并根據(jù)其序列的相似度，確定其所屬物種。

1.3.5 精油對主要致病菌的抑制作用 將不同種類的精油配制成體積分?jǐn)?shù)為500 μL·L?1的PDA平板，用無菌打孔器在病原菌平板上打取直徑6 mm的菌餅，放入平板中央，28 ℃培養(yǎng)至6 d時，用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑并記錄[14?15]。設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.6 石菖蒲精油對主要致病菌菌絲生長的影響 用無菌打孔器在病原菌平板上打取直徑6 mm 的菌餅，放入PDA平板中央，28 ℃培養(yǎng)，定期觀察菌落，用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑并記錄[16?17]，設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.7 石菖蒲精油對主要致病菌孢子萌發(fā)率的影響 將孢子懸浮液分別混合于體積分?jǐn)?shù)為0 (ck)、250、500、750、1 000 μL·L?1的石菖蒲精油和質(zhì)量濃度為1.0%的葡萄糖混合溶液中，將上述混合溶液50 μL分別滴入雙凹載玻片，置于培養(yǎng)皿中(直徑 200 mm)，25 ℃保濕培養(yǎng)，6、12、18 h時在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，每個處理鏡檢孢子數(shù)為200 個，以芽管長度超過孢子直徑一半計(jì)為孢子萌發(fā)[18]，設(shè)置3次重復(fù)。孢子萌發(fā)率計(jì)算公式為：孢子萌發(fā)率=(萌發(fā)孢子數(shù)/檢查孢子總數(shù))×100%

1.3.8 石菖蒲精油對主要致病菌細(xì)胞膜通透性的影響 ①丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度測定。將體積分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫80與石菖蒲精油混合充分后乳化，在PDB中加入一定量的孢子懸浮液，使孢子終濃度為 109CFU·L?1。分別抽濾取 5 g 菌絲在體積分?jǐn)?shù)為 0 (ck)、250、500、750、1 000 μL·L?1石菖蒲精油的PBS緩沖液中培養(yǎng)，0、2、4、6、8、10 h后取0.2 g菌絲冰浴研磨，加入1 mL無菌雙蒸水提取，4 ℃10 000 r·min?1，20 min離心取上清液，采用硫代巴比妥酸法測定吸光度。②相對電導(dǎo)率測定。抽濾取5 g PDB中的菌絲在不同體積分?jǐn)?shù)(0、250、500、750、1 000 μL·L?1)的石菖蒲精油-PBS緩沖液中培養(yǎng)，分別在0、10、20、40、60、120、180 min取樣測定電導(dǎo)率，并計(jì)算相對電導(dǎo)率[19]，設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.9 石菖蒲精油對主要致病菌細(xì)胞內(nèi)容物泄漏的影響 將菌絲(濕質(zhì)量2 g)加入到體積分?jǐn)?shù)為0 (ck)、250、500、750、1 000 μL·L?1的石菖蒲精油無菌水中，28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)，分別于1、2、3、4、5 h后收集上清液測量可溶性碳水化合物、可溶性蛋白和核酸泄漏量[20]，設(shè)置3次重復(fù)。以蔗糖為標(biāo)準(zhǔn)，使用蒽酮試劑法測量藤倉鐮刀菌可溶性碳水化合物的泄漏程度；使用蛋白質(zhì)檢測試劑盒(生工生物技術(shù)有限公司，上海)檢測可溶性蛋白泄漏程度；通過檢測上清液在波長260 nm處的吸光度D(260)來判斷核酸的泄漏程度，設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.10 石菖蒲精油對主要致病菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響 菌絲固定采用戊二醛、鋨酸的雙重固定法。取適量0、500 μL·L?1的石菖蒲精油平板上生長的菌絲邊緣部分，浸泡于體積分?jǐn)?shù)為3%的戊二醛溶液中，20 ℃固定，過夜后用pH 6.8的PBS緩沖液沖洗15 min，而后用體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸溶液4 ℃固定2 h，再經(jīng)乙醇梯度脫水、包埋、聚合、切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后置于透射電鏡下觀察[21]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用GraphPad Prism 8進(jìn)行繪圖，通過SPSS 24.0單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 秀珍菇主要致病菌分離鑒定

如圖1A所示：在秀珍菇20 ℃儲藏2 d出現(xiàn)病癥后，根據(jù)組織分離法分離致病菌，按照不同的菌落形態(tài)和生長特征，分離到3株致病菌。

圖1 秀珍菇致病菌病癥與形態(tài)Figure 1 Pathogen disease and morphology of P. geesteranus

根據(jù)科赫氏法則，將分離的3株真菌回接至經(jīng)過表面滅菌的秀珍菇上進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)僅1株菌株出現(xiàn)了與病癥相似的表現(xiàn)(圖1B)。再取回接發(fā)病病癥處的菌絲進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察到與其形態(tài)一致，證明該菌株為秀珍菇主要致病菌。

由圖1C ～E可見：菌落規(guī)則，圓形，棉絮狀或毛氈狀，菌絲體初期白色，生長旺盛，后期成淡黃色，菌絲有隔，分枝，大型分生孢子呈鐮刀形或紡錘形，有隔膜，呈無色或透明。與鐮刀菌屬形態(tài)學(xué)基本一致。將測序所得的序列，利用NCBI網(wǎng)站的BLAST在線對比，將ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行對比分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)ITS序列與KJ605159.1Fusarium fujikuroistrain GF3、MT982185.1鐮刀菌屬Fusariumsp. isolate SZMC27192、MN747996.1 層生鐮刀菌Fusarium proliferatumiisolate SC2.2、KF999820.1Fusariumsp. CHJ2、MN871556.1 甜瓜鐮刀菌Fusarium incarnatumclone LS760、MW405882.1Fusarium proliferatumiisolate、KP893211.1Fungalsp.、MT530228.1 叢赤殼屬Nectriaceaesp.、KT351627.1Fusariumsp. T28、MN947247.1Fusarium fujikuroiisolate DL3.2、MW599749.1 尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporumstrain DHRL-04有不同程度的相似，對比發(fā)現(xiàn)該菌株與KJ1605159.1Fusarium fujiuroistrain GF3同源性達(dá)99%，基本確定該菌株為藤倉鐮刀菌。另外，選取幾株同源性不同的序列，下載序列利用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2可知：該菌株與藤倉鐮刀菌聚為一支，有非常近的親緣關(guān)系。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與生物學(xué)鑒定結(jié)果分析，確定該致病菌為藤倉鐮刀菌。

圖2 ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree based on ITS sequence

2.2 植物精油對藤倉鐮刀菌的抑制作用

如圖3所示：培養(yǎng)5 d后，藤倉鐮刀菌在不同精油平板上的菌落直徑不同，菌落直徑越小表征菌絲生長越緩慢，則該精油的抑制效果越好。石菖蒲精油在13種精油中對藤倉鐮刀菌的抑制效果最佳，故選擇石菖蒲精油進(jìn)一步研究。

圖3 植物精油對藤倉鐮刀菌的抑制率Figure 3 Inhibition rate of plant essential oil against F. fujikuroi

2.3 石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌菌絲和孢子的影響

由圖4可知：250 μL·L?1的石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌菌絲生長有明顯的抑制效果，培養(yǎng)4 d后不同體積分?jǐn)?shù)處理的菌絲生長存在顯著差異(P＜0.05)，1 000 μL·L?1的石菖蒲精油能完全抑制藤倉鐮刀菌的生長，且轉(zhuǎn)接至無精油PDA平板后依舊不生長?？纱_定石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌的半數(shù)效應(yīng)體積分?jǐn)?shù)(抑菌率達(dá)50%的體積分?jǐn)?shù)為半數(shù)效應(yīng)體積分?jǐn)?shù) ，EC50)為 500 μL·L?1， 最小抑菌體積分?jǐn)?shù)為1 000 μL·L?1。

圖4 石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌菌絲生長的影響Figure 4 Effects of A. tatarinowii essential oil on mycelial growth of F. Fujikuroi

如圖5所示：隨著石菖蒲精油體積分?jǐn)?shù)的升高，藤倉鐮刀菌孢子萌發(fā)率顯著降低(P＜0.05)。處理18 h以后，對照組孢子萌發(fā)率達(dá)85.7%，而750和1 000 μL·L?1石菖蒲精油處理組孢子萌發(fā)率分別為4.2%和0，孢子萌發(fā)抑制率分別為95.1%和100.0%。表明在一定體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，石菖蒲精油能顯著抑制藤倉鐮刀菌孢子的萌發(fā)。

圖5 石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌孢子的影響Figure 5 Effects of A. tatarinowii essential oil on colony diameter of F. Fujikuroi

2.4 石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌細(xì)胞膜通透性的影響

用相對電導(dǎo)率來表征膜通透率，相對電導(dǎo)率越高，膜通透性越大。如圖6A所示：藤倉鐮刀菌相對電導(dǎo)率隨著石菖蒲精油體積分?jǐn)?shù)的升高而升高。處理組在80 min后顯著高于對照組(P＜0.05)。3 h后對照組相對電導(dǎo)率為23.2%，而1 000 μL·L?1石菖蒲精油處理組的相對電導(dǎo)率達(dá)55.1%。表明精油處理可顯著提高藤倉鐮刀菌的相對電導(dǎo)率(P＜0.05)，從而可進(jìn)一步增加高藤倉鐮刀菌的膜通透性。

圖6 石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌相對電導(dǎo)率和MDA的影響Figure 6 Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi Relative conductivity and MDA content

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，可以反映細(xì)胞膜脂過氧化的程度，是指示膜系統(tǒng)受傷的重要指標(biāo)之一。如圖6B所示：經(jīng)過石菖蒲精油處理的藤倉鐮刀菌，MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著高于對照，1 000 μL·L?1石菖蒲精油處理組在10 h后MDA質(zhì)量摩爾濃度是對照的3倍。表明石菖蒲精油能夠破壞細(xì)胞脂膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致MDA質(zhì)量摩爾濃度上升，加速菌絲細(xì)胞的膜脂過氧化。

2.5 石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)容物泄漏的影響

細(xì)胞內(nèi)容物出現(xiàn)在培養(yǎng)液中說明細(xì)胞的質(zhì)膜受到了破壞，也是細(xì)胞膜損傷的重要表征指標(biāo)。如圖7所示：培養(yǎng)液中可溶性蛋白、核酸、可溶性碳水化合物隨著精油處理時間的延長都有不同程度的上升。表明經(jīng)石菖蒲精油處理后，細(xì)胞內(nèi)容物出現(xiàn)不同程度泄漏，且隨著精油體積分?jǐn)?shù)的增大而升高。說明精油處理能夠破壞脂膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄漏。

圖7 石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌可溶性碳水化合物、可溶性蛋白、核酸泄漏量的影響Figure 7 Effects of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi relative soluble carbohydrate, soluble protein content, nucleic acid leakage

2.6 石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

采用掃描電鏡觀察石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌菌絲結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)精油處理的菌絲表面光滑，存在孢子叢(圖8A)。精油處理后(圖8B)的菌絲皺縮，無孢子產(chǎn)生。進(jìn)一步說明石菖蒲精油能夠破壞藤倉鐮刀菌菌絲結(jié)構(gòu)，影響菌絲正常生長，并抑制孢子的產(chǎn)生。本研究結(jié)果與顧可飛等[13]發(fā)現(xiàn)精油可造成真菌菌絲畸形或使真菌菌絲斷裂的結(jié)論基本一致。

圖8 掃描電鏡觀察石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌菌絲結(jié)構(gòu)的影響Figure 8 Sem observation of the effect of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi mycelium structure

進(jìn)一步采用透射電鏡觀察石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)精油處理的細(xì)胞形態(tài)完整，質(zhì)膜均勻，細(xì)胞壁清晰(圖9A)。經(jīng)石菖蒲精油處理的菌絲細(xì)胞膜和核膜破壞嚴(yán)重，細(xì)胞各結(jié)構(gòu)也有較大破壞(圖9B)。表明石菖蒲精油的抑菌機(jī)制可能是通過破壞藤倉鐮刀菌細(xì)胞膜的完整性，暴露和侵蝕細(xì)胞器，造成細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

圖9 透射電鏡觀察石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌菌絲結(jié)構(gòu)的影響Figure 9 Effect of A. tatarinowii essential oil on F. fujikuroi mycelium structure observed by transmission electron microscopy

3 結(jié)論與討論

本研究對秀珍菇的采后致病菌進(jìn)行分離，根據(jù)科赫氏法則確定其致病性，在形態(tài)上致病菌菌落呈白色，后期為淡黃色，菌絲有隔有分支，孢子呈鐮刀型，在形態(tài)學(xué)上對比發(fā)現(xiàn)其與鐮刀菌形態(tài)學(xué)描述一致；利用rDNA-ITS序列對比和系統(tǒng)發(fā)育樹分析的方法，發(fā)現(xiàn)致病菌與藤倉鐮刀菌相似度達(dá)99%，由此確定藤倉鐮刀菌為秀珍菇采后儲藏中的主要致病真菌，該菌在百香果Passiflora eduli[22]、櫻桃番茄Lycopersicon esculentumvar.cerasiforme[23]等農(nóng)產(chǎn)品均見報(bào)道，是較為常見的致病菌。

研究13種常見植物精油對對藤倉鐮刀菌抑制效果時發(fā)現(xiàn)：石菖蒲精油對藤倉鐮刀菌控制效果最佳，其EC50為500 μL·L?1，最小抑菌體積分?jǐn)?shù)為1 000 μL·L?1。相同體積分?jǐn)?shù)處理下，石菖蒲精油對孢子萌發(fā)的抑制率高于對菌絲生長的抑制率，說明藤倉鐮刀菌孢子對石菖蒲精油的敏感度更高，這與PEI等[24]探究香芹酚對炭疽菌的抑制效果相似。

經(jīng)對藤倉鐮刀菌培養(yǎng)液中MDA和相對電導(dǎo)率變化情況的觀測，發(fā)現(xiàn)石菖蒲精油的處理可使藤倉鐮刀菌的胞內(nèi)MDA質(zhì)量摩爾濃度增加，MDA質(zhì)量摩爾濃度和相對電導(dǎo)率是表征菌絲細(xì)胞膜脂過氧化程度和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞程度的重要指標(biāo)[25]，MDA質(zhì)量摩爾濃度增加表明石菖蒲精油能夠加速藤倉鐮刀菌的膜脂氧化，加劇細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的外泄；而掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果也顯示藤倉鐮刀菌菌絲表面出現(xiàn)褶皺，菌絲細(xì)胞壁膜被破壞。LIU等[26]研究表明：香草精油的抗真菌活性是由于其能夠破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。PEI等[24]發(fā)現(xiàn)：香芹酚能夠使炭疽菌細(xì)胞膜通透性增加。本研究表明：石菖蒲精油能夠有效抑制藤倉鐮刀菌作用機(jī)制，破壞藤倉鐮刀菌膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，引起內(nèi)容物泄漏，進(jìn)而導(dǎo)致菌體死亡。