碳氮培養(yǎng)條件下伊氏殺線蟲真菌的代謝組研究

李興鵬，張 楊，王瑞珍，董雷鳴

（1. 北華大學(xué) 林學(xué)院，吉林 吉林 132013；2. 吉林省林業(yè)科學(xué)研究院，吉林 長春 130033；3. 北京市植物園 北京市花卉園藝工程技術(shù)研究中心，北京 100093）

松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus病在亞洲和歐洲造成嚴(yán)重的生態(tài)和經(jīng)濟損失[1?2]，伊氏殺線蟲真菌Esteya vermicola(EV菌)是松材線蟲的內(nèi)寄生真菌，產(chǎn)生的新月形孢子能侵染并殺死松材線蟲，在松材線蟲的生物防治方面具有良好的應(yīng)用前景[3]。同時，EV菌亦可侵染擬松材線蟲B. mucronatus、水稻干尖線蟲Aphelenchoides besseyi等線蟲。研究表明：EV真菌胞內(nèi)存在共生細(xì)菌[4]，共生細(xì)菌對真菌的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)具有重要的作用，如Rhizopus microsporus胞內(nèi)的共生細(xì)菌Burkholderia能產(chǎn)生植物毒素根霉素，然后由宿主真菌分泌到環(huán)境中，導(dǎo)致水稻枯萎病[5]。菌絲內(nèi)的共生微生物(細(xì)菌或病毒)是重要的能直接或間接改變真菌和宿主關(guān)系的互作生物[6?8]，提高宿主真菌的生態(tài)適應(yīng)性[9?10]。存在共生細(xì)菌的真菌對碳氮源如何響應(yīng)，其代謝產(chǎn)物發(fā)生何種變化，目前尚未見相關(guān)報道。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)研究中非常重要的一個環(huán)節(jié)，旨在研究生物體或組織，甚至單個細(xì)胞的全部小分子代謝物成分及其動態(tài)變化[11]。通過對代謝物質(zhì)的分析，可以從生物樣本中檢測并篩選出具有重要生物學(xué)意義和顯著差異的代謝物質(zhì)，并以此為基礎(chǔ)研究生物體的代謝過程和變化機制[12]。對EV菌在不同碳、氮培養(yǎng)條件下代謝物的變化進行分析，明確顯著差異代謝物，特別是重要的信號分子，不僅為EV菌的應(yīng)用提供重要理論基礎(chǔ)，而且對深入研究內(nèi)共生細(xì)菌在EV菌的功能亦具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株

伊氏殺線蟲真菌Esteya vermicolaCBS115803購于荷蘭菌物保存中心。

1.2 培養(yǎng)基

碳培養(yǎng)基為24 g 馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB，Becton， Dickinson and Company，美國)和10 g瓊脂溶于1 L雙蒸水。氮培養(yǎng)基為5 g酵母粉(OXOID公司，英國)和10 g瓊脂溶于1 L雙蒸水。

1.3 儀器和試劑

Nano高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析儀QE (Thermo Q-Exactive，德國)；賽多利斯BSA124S電子天平；真空濃縮儀(Labogene MaixVac Alpha, 丹麥)；Sigma 3-30KS高速離心機，KQ5 200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，中國)；色譜級甲醇(Fisher，美國)。

1.4 處理

配制碳、氮固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基凝固后放入已滅菌的尼龍膜(孔徑3 μm，賽多利斯)，接種EV菌后于25 ℃培養(yǎng)7 d。將長滿菌絲和孢子的尼龍膜用無菌鑷子取出，用超純水沖洗尼龍膜，再用無菌的吸水紙吸掉尼龍膜接觸培養(yǎng)基面的水分，而后將菌絲和孢子刮入2 mL圓底滅菌干燥離心管，裝樣品前后分別稱量離心管的質(zhì)量，迅速將樣品管放入液氮中淬滅后于?80 ℃保存。每處理設(shè)置5次生物學(xué)重復(fù)，編號依次為C1～C5和N1～N5。加入冷凍潔凈無菌的直徑為3 mm的鋼珠2個，液氮冷凍條件下使用萊馳RETSCH MM 400研磨2 min。將研磨好的樣品管置于干冰上，加入2 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為80%甲醇于?80 ℃冰箱靜置1 h，4 ℃、14 000g離心20 min后將上清液轉(zhuǎn)移至另一相同體積離心管，真空濃縮干燥樣品后于?80 ℃保存。用300 μL體積分?jǐn)?shù)為90%甲醇超聲復(fù)溶并經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，完成親水代謝產(chǎn)物提取。

1.5 HPLC-MS分析

采用非靶標(biāo)的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)對樣品進行測定和代謝物識別。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?(2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm)。流動相：0.1% 甲酸-水溶液 (A)，0.1% 甲酸-乙腈(B)。洗脫條件：0 ～0.5 min，95%B；0.5 ～7.0 min，95% ～65% B；7.0 ～8.0 min，65% ～40% B；8.0 ～9.0 min，40%B；9.0 ～9.1 min，40% ～95%B；9.1 ～12.0 min，95%B。質(zhì)譜參數(shù)條件：鞘氣，310 275 Pa；輔助氣，103 425 Pa；噴霧電壓，4 000 V (正)/3 500 V (負(fù))；離子傳輸管溫度：350 ℃。在采集軟件(Xcalibur 4.0.27，Thermo)的控制下，采用一級質(zhì)譜全掃描(全MS)結(jié)合自動觸發(fā)二級質(zhì)譜掃描(MS/MS)模式，使用陰、陽離子模式2種電離方式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。運行時間：0 ～18 min。分辨率：全MS，170 000；MS/MS，17 500。

1.6 代謝物注釋分析

對原始數(shù)據(jù)進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化，最終得到1個保留時間、質(zhì)荷比和代謝物信號(峰面積)的數(shù)據(jù)矩陣。將處理后的代謝物信號與一級和二級數(shù)據(jù)庫進行匹配，將其中二級得分＜30的化合物可信予以剔除。分析時10份樣品共插入3個質(zhì)量對照(QC)樣本以考察整個分析過程中儀器的穩(wěn)定性，QC樣本每種化合物的峰面積的變異系數(shù)若＞30%，則予以剔除。未檢出值設(shè)定為0，缺失值由其余重復(fù)樣品的均值填補。

1.7 差異代謝物篩選

由Metaboanalyst 4.0在線軟件(https：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml)完成。利用對數(shù)轉(zhuǎn)換和pareto縮放對各代謝物相對含量進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。使用主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法判別法(PLS-DA)評估不同處理的分組情況。結(jié)合以下2個標(biāo)準(zhǔn)對2種培養(yǎng)基的陰陽離子模式的差異化合物進行篩選：經(jīng)FDR (false discovery rate)校正的t檢驗的P＜0.05；正交偏最小二乘判別分析(OPLSDA)中變量投影重要性(variable influence on projection，VIP)得分＞1。

1.8 代謝通路分析

代謝通路分析由Metaboanalyst 4.0 (https：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/upload/PathUploadView.xhtml)中的代謝通路分析模塊(pathway analysis module)完成。該分析將選定的差異代謝物與KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫(2019年10月)和人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB)進行匹配，然后選擇酵母Saccharomyces cerevisiae的代謝通路庫作為參照進行富集分析和拓?fù)浞治?。富集分析中采用參?shù)超幾何法(hypergeometric test)檢驗每個代謝通路的顯著性(P＜0.05)；拓?fù)浞治鲋胁町愶@著性檢驗的方法為相對介數(shù)中心性(relative-betweeness centrality)。

2 結(jié)果與分析

2.1 陰陽離子模式下鑒定的化合物

陽離子模式下鑒定到的化合物多于陰離子模式下鑒定的化合物。陰、陽離子模式分別檢測出279和461種化合物，其中74種為2種模式共同檢出，共計666種化合物。通過質(zhì)量控制過濾處理，陰、陽離子模式分別有176和362種化合物，其中2種模式共同含有40種化合物，共計498種化合物。數(shù)據(jù)總的缺失值的比例平均為0.74%：陰離子模式下，碳和氮培養(yǎng)基下的代謝物缺失率均為0.23%；陽離子模式下，碳培養(yǎng)基下的缺失率為2.38%，高于氮培養(yǎng)基0.11%。

2.2 組間差異分析

陰離子和陽離子模式下EV菌菌絲體代謝物的主成分分析得分圖(圖1A ～B)顯示：前2個主成分分別解釋了94.9% (主成分1為92.5%，主成分2為2.4%)和92.5% (主成分1為89.5%，主成分2為3.0%)的變異。2種離子模式下EV菌代謝譜在碳、氮培養(yǎng)基培養(yǎng)后差異大，分組明顯。偏最小二乘法判別法的分組結(jié)果(圖1C ～D)與主成分分析法結(jié)果一致。

圖1 碳、氮培養(yǎng)條件下EV菌代謝物的PCA和PLS-DA分析Figure 1 PCA and PLS-DA of EV metabolites under carbon and nitrogen culture conditions

2.3 差異化合物

采用火山圖的形式進行差異化合物展示，見圖2。t檢驗差異顯著(P＜0.05)的化合物共有444種，占總數(shù)的89.2%；陰離子和陽離子模式分別有162和310種，28種為2種模式共有。VIP＞1的化合物共有469種，占總數(shù)的94.2%；陰離子和陽離子模式分別有167和334種，32種為2種模式共有。利用VIP＞1篩選出的化合物包含t檢驗法的篩選結(jié)果，表明后者更嚴(yán)格，且更符合統(tǒng)計要求。

圖2 碳、氮培養(yǎng)條件下EV菌的差異代謝物Figure 2 Differential metabolites of EV bacteria under carbon and nitrogen culture conditions

以碳為對照組，在氮組中上調(diào)代謝物的數(shù)量是下調(diào)的3.4倍，分別為342和102種；上調(diào)和下調(diào)代謝物分別有309和86種匹配到HMDB數(shù)據(jù)庫，有159和71種匹配到KEGG數(shù)據(jù)庫。磷酸胍基乙酸酯和對甲酚硫酸鹽是在氮培養(yǎng)下大量產(chǎn)生的特有代謝物，尿囊素、光色素、吲哚和海藻糖等是代謝物在氮培養(yǎng)條件下顯著上調(diào)(表1)。

表1 部分差異化合物Table 1 Part of significantly different metabolites

2.4 代謝通路分析

由表2和圖3可見：利用KEGG數(shù)據(jù)庫對氮培養(yǎng)中上調(diào)和下調(diào)的顯著差異代謝產(chǎn)物進行富集分析。上調(diào)代謝產(chǎn)物主要富集到氨基酸代謝通路，包括氨酰基tRNA的生物合成，精氨酸和脯氨酸代謝，精氨酸生物合成，牛磺酸和低?；撬岽x，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。下調(diào)的顯著差異代謝產(chǎn)物主要涉及糖類代謝通路，包括氨基糖和核苷酸糖代謝、半乳糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化、淀粉和蔗糖代謝。

表2 碳、氮培養(yǎng)條件下EV菌差異代謝物富集到的KEGG通路Table 2 Enriched KEGG pathways by differential metabolites of EV under carbon and nitrogen culture conditions

圖3 差異代謝產(chǎn)物富集到的顯著代謝通路Figure 3 Significant metabolic pathways enriched by differential metabolites

3 討論

本研究在代謝組水平探究含內(nèi)共生細(xì)菌的生防真菌EV菌對不同碳氮培養(yǎng)基的化學(xué)響應(yīng)，鑒定到一些差異顯著的化合物，尤其是在氮源培養(yǎng)基中特有的代謝產(chǎn)物，并定位到重要代謝途徑上。磷酸胍基乙酸酯和對甲酚硫酸鹽是在氮培養(yǎng)下EV菌大量產(chǎn)生的特有代謝物，尿囊素、光色素、吲哚和海藻糖等是氮培養(yǎng)條件下顯著上調(diào)的代謝物。對甲酚硫酸鹽是細(xì)菌代謝酪氨酸的產(chǎn)物[13]。已有研究證實：擬桿菌科Bacteroidaceae、雙歧桿菌科Bifidobacteriaceae、梭菌科Clostridiaceae、腸桿菌科Enterobacteriaceae、腸球菌科Enterococcaceae、優(yōu)桿菌科Eubacteriaceae、梭桿菌科Fusobacteriaceae、毛螺菌科Lachnospiraceae、乳桿菌科Lactobacillaceae、紫單胞菌科Porphyromonadaceae、葡萄球菌科Staphylococcaceae、疣微菌科Ruminococcaceae和韋榮氏菌科Veillonellaceae等細(xì)菌是對甲酚硫酸鹽的產(chǎn)生菌[14]。已有研究表明：細(xì)菌也可以降解對甲酚[15]，真菌Trichosporon cutaneum和Aspergillus fumigatus也可以利用對甲酚作為碳源[16?17]。因此推測：對甲酚硫酸鹽可能是在高氮源培養(yǎng)下，由于碳源嚴(yán)重缺乏，EV菌胞內(nèi)共生細(xì)菌代謝酪氨酸產(chǎn)生對甲酚或?qū)追恿蛩猁}，從而將其做為碳源進一步利用。

多種革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌(迄今為止共有85種)都會產(chǎn)生大量的吲哚。作為細(xì)胞間信號分子，吲哚控制細(xì)菌生理的多個方面，例如孢子形成、質(zhì)粒穩(wěn)定性、耐藥性、生物膜形成和吲哚產(chǎn)生細(xì)菌的毒力[18]。在細(xì)菌中，吲哚由氨基酸色氨酸的降解產(chǎn)物產(chǎn)生。吲哚是細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)表達的信號分子[19]。EV真菌細(xì)菌共生體可產(chǎn)生吲哚，根據(jù)上述目前的研究只在細(xì)菌發(fā)現(xiàn)吲哚的產(chǎn)生，因此我們推測胞內(nèi)細(xì)菌可能是吲哚的產(chǎn)生者，細(xì)菌可以利用吲哚這一信號分子協(xié)調(diào)兩者行為，以在真菌胞內(nèi)生存。

前期研究表明：EV菌基因組中含有比其他殺線蟲真菌，如Arthrobotrys oligospora、Dactylellina haptotyla、Drechmeria coniospora更多的尿囊素轉(zhuǎn)運蛋白[20]。此外，EV菌胞內(nèi)的共生細(xì)菌屬于假單孢屬Pseudomonas[6]。尿囊素是腺嘌呤和鳥嘌呤代謝的中間產(chǎn)物，尿囊素可以被某些真菌、細(xì)菌和植物用作碳和氮的來源，尿囊素或尿囊素通路的衍生物可能有助于提高真菌向宿主植物提供氮的能力[21]。如在一些外生菌根真菌中，已鑒定出尿囊素/尿囊酸轉(zhuǎn)運蛋白[21?22]。研究發(fā)現(xiàn)：假單孢屬的細(xì)菌和酵母Saccharomyces cerevisiae也可以降解尿囊素[23?24]。在氮源充足的氮培養(yǎng)條件下，尿囊素代謝產(chǎn)物約是碳培養(yǎng)條件下的32倍，因此，尿囊素很可能是EV菌供給胞內(nèi)共生細(xì)菌氮源的一種形式。

海藻糖在自然界中分布廣泛，包括細(xì)菌、真菌、植物、無脊椎動物和哺乳動物。由于其特殊的物理特性，海藻糖能夠保護細(xì)胞的完整性免受各種環(huán)境損害和營養(yǎng)限制。細(xì)菌可以使用海藻糖作為碳和能量的唯一來源，一些分枝桿菌中海藻糖可作為細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分，而酵母細(xì)胞在很大程度上不能以海藻糖為碳源生長[25]。在根瘤菌-豆科Leguminosae植物共生期間，海藻糖在根瘤發(fā)育過程中被儲存在根瘤中，并成為細(xì)菌的主要碳水化合物，而與所供應(yīng)的碳源和氮源類型無關(guān)[26]。內(nèi)源性海藻糖在碳缺乏或在給定培養(yǎng)基中碳源耗盡后被動員。海藻糖很可能是EV共生細(xì)菌的一種碳源，在碳源缺乏時作為儲備能源(氮培養(yǎng)下產(chǎn)生的海藻糖是碳培養(yǎng)下的2.5倍)。

光色素是核黃素的光敏分解產(chǎn)物。關(guān)于光色素的酶促轉(zhuǎn)化路徑已在假單胞菌等細(xì)菌中進行研究[27]。已有研究認(rèn)為：光色素是細(xì)菌群感效應(yīng)的信號分子[28]，是能影響植物生長的細(xì)菌信號分子[29]，同時也是共生的信號分子[30?31]。不同的營養(yǎng)條件(如氮和磷)可改變細(xì)菌產(chǎn)生光色素的濃度[30]。本研究使用的氮源是有機氮源。在該氮培養(yǎng)下產(chǎn)生的光色素是碳培養(yǎng)下的8倍，氮培養(yǎng)條件下光色素的產(chǎn)量遠高于碳培養(yǎng)條件，不同于前人報道的高濃度硝酸鹽降低光色素的產(chǎn)量[30]。

差異最顯著的代謝物多數(shù)未能富集到顯著的代謝通路，原因在于這些化合物的代謝通路尚未研究透徹，或者它們是EV菌的特異化合物，尚未包括在參照數(shù)據(jù)庫中。無論以真菌還是細(xì)菌數(shù)據(jù)庫為參照，富集到的顯著代謝通路基本一致，均與氨基酸和糖類代謝相關(guān)，而這些通路是真菌和細(xì)菌共有的，無法區(qū)分內(nèi)共生細(xì)菌對其真菌宿主代謝的影響。筆者曾試圖利用多種抗生素去除內(nèi)共生細(xì)菌以解決該問題，并未獲得成功，需要更深入的研究。