過氧化物酶基因PagPRX19對銀腺楊‘84K’耐鹽性的影響

黃清晨，賴建新，黃李超，盧孟柱

（1. 浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術學院，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江 杭州 311300）

土地鹽堿化增大了土壤滲透壓，導致植物吸水困難，對植物造成了生理干旱[1]。過多鈉離子(Na+)、氯離子(Cl?)的積累，導致膜結構破壞，對植物造成滲透脅迫[2?3]。鹽脅迫還導致植物內(nèi)源活性氧(ROS)增加，引起細胞膜損傷甚至細胞死亡，抑制植株生長發(fā)育[4]。ROS作為響應鹽脅迫的關鍵因子，在低水平下，誘導增強抗氧化酶活性，抵御鹽脅迫；在高水平下，過量積累造成氧化脅迫，導致生物大分子產(chǎn)生不可逆的損傷，改變細胞形態(tài)結構，抑制植株生長發(fā)育[5]。為緩解ROS積累引起的氧化脅迫，植物通過增強抗氧化酶系統(tǒng)相關酶活性來降低體內(nèi)的ROS，從而提高抗逆性[6]。植物的抗氧化酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化物酶(PRX)等[7]。

在小麥Triticum aestivum中過表達TaPRX-2A，植株抗氧化能力增強，ROS下降，耐鹽性增加[8]。擬南芥Arabidopsis thaliana AtPRX19參與脅迫(鹽害、干旱、病蟲害等)后的氧化應激反應，使得ROS增加，對植物造成氧化脅迫。鹽脅迫下，擬南芥AtPRX19表達量上調(diào)，ROS減少，抵御脅迫能力增強[9]。在胡蘿卜Daucus carota中異源表達OsPRX114同樣降低過氧化氫(H2O2)水平，提高植株的耐鹽性[10]。玉米Zea mays的PRX家族成員ZmPRX26、ZmPRX42、ZmPRX71、ZmPRX75和ZmPRX78參與了對包括鹽脅迫在內(nèi)多種非生物脅迫的響應[11]。部分PRX家族成員通過協(xié)調(diào)水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)等激素水平發(fā)揮作用[12]。

研究林木對鹽脅迫的響應，揭示耐鹽性相關機理，對培育耐鹽性更強林木品種具有重要意義。為研究楊樹PopulusPRX家族對林木耐鹽性的影響，本研究以銀腺楊‘84K’Populus alba × P. glandulosa‘84K’ (84K楊)為材料，通過構建PagPRX19的過表達轉(zhuǎn)基因株系，改變楊樹H2O2水平，并分析了楊樹耐鹽相關生理指標，以期揭示PagPRX19參與調(diào)控楊樹鹽脅迫響應的機制，為楊樹的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料為84K楊，過表達PagPRX19株系為本研究獲得。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 Phytozome v13數(shù)據(jù)庫中獲取毛果楊Populus trichocarpa和擬南芥的PRX家族的蛋白序列、蛋白編碼區(qū)(CDS)序列、啟動子序列。利用P1ant CARE (http：//bioinformatics.psb.u-gent.be/webtooLs/pLantcare/html/)在線軟件對PRX家族啟動子順式作用元件預測。使用MEGA v7軟件，構建擬南芥和楊樹的PRX家族的系統(tǒng)發(fā)育樹，分析楊樹和擬南芥PRX基因家族成員在進化關系上的同源性。利用MEGE v5.4.1 (https：//meme-suite.org/meme/tooLs/meme)在線軟件分析PRX家族基因保守結構域。

1.2.2 基因表達模式分析 選用生長一致的84K楊樹苗，分別從莖尖(SAM)、莖段3 ～10節(jié)間(IN3～IN10)、形成層(Ca)、幼葉(YL)、成熟葉(ML)、根(R)、木質(zhì)部(Xy)取樣，所有材料取3個生物學重復。采用實時熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測該基因在不同組織內(nèi)的表達模式。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因苗獲得 在84K楊基因組數(shù)據(jù)庫中，通過Blast獲取毛果楊PRX19同源基因PagPRX19，設計引物擴增獲得目的基因(F端引物：ATGTATACAACAATCATGCCT，R端引物：TTATGTATG CATACTGCAAAC)，使用Gateway技術構建過表達載體35S：PagPRX19，利用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化84K楊獲得過表達PagPRX19轉(zhuǎn)基因苗[13]。

1.2.4 鹽脅迫處理 ①組培鹽脅迫處理。以組培培養(yǎng)45 d的過表達株系為材料，以非轉(zhuǎn)基因植株為對照。鹽脅迫組接頂芽于100 mmol·L?1氯化鈉(NaCl)生根培養(yǎng)基，對照組接頂芽于0 mmol·L?1NaCl生根培養(yǎng)基。每組處理12瓶，每瓶接2株頂芽。培養(yǎng)溫度為23 ～25 ℃，光周期為8 h/16 h(黑暗/光照)。處理25 d，觀察植株在長期鹽脅迫下耐鹽能力。②土培鹽脅迫處理。以土培生長2個月的過表達株系為實驗材料，以非轉(zhuǎn)基因植株為對照，每組處理5株。鹽脅迫組隔2 d澆灌1次100 mmol·L?1的NaCl溶液，對照組隔2 d澆灌1次0 mmol·L?1的NaCl溶液。培養(yǎng)溫度為23 ～25 ℃，光周期為8 h/16 h(黑暗/光照)。處理7 d，取樣測定各項生理指標，處理12 d后拍照[14]。

1.2.5 生理指標測定 ①脯氨酸質(zhì)量分數(shù)測定。采用脯氨酸測試盒(南京建成，A107-1-1)測定脯氨酸質(zhì)量分數(shù)。②相對含水量測定。取新鮮葉片記錄鮮質(zhì)量(WF)，超純水(ddH2O)浸泡24 h記錄質(zhì)量(WT)，65 ℃烘箱干燥3 d，記錄干質(zhì)量(WD)。葉片相對含水量=(WF?WD)/(WT?WD)×100%[15]。③丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度測定。稱取植物葉片0.2 g，加入4 mL質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸(TCA)溶液和石英砂研磨至勻漿，4 000 r·min?1離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL硫代巴比妥酸(TAB)溶液，對照為2 mL ddH2O。搖勻后沸水浴15 min，?20 ℃迅速冷卻后4 000 r·min?1離心2 min，取上清液，在532和600 nm 波長下測量吸光度。MDA 濃度CMDA(μmol·L?1)=[D(532)?D(600)]/155×1 000，MDA 質(zhì)量摩爾濃度(nmol·g?1)=(CMDA×V提取液體積)/F樣品質(zhì)量[16]。④電解質(zhì)滲透率測定。采用五點取樣法取樣，加入6 mL ddH2O，28 ℃搖床震蕩1 h。取出測第1次電導值(G1)。沸水浴30 min，冷卻至室溫，搖勻測量第2次電導值(G2)。電解質(zhì)滲透率=第1次電導值/第2次電導值×100%[17]。⑤ROS水平定性測量。DAB染色劑試劑盒(索萊寶，DA1010)染色檢測H2O2；氯化硝基四氮唑藍(NBT)粉末(索萊寶，N8140)染色檢測超氧陰離子。

2 結果與分析

2.1 楊樹PRX基因家族的生物信息學分析

使用擬南芥和毛果楊PRX家族的同源蛋白序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)并進行保守結構域分析(圖2)發(fā)現(xiàn)：該家族基因高度保守。對PRX基因家族啟動子進行順式作用元件分析(圖3)發(fā)現(xiàn)：該基因家族成員含有響應生長素(IAA)、脫落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等激素的功能元件以及響應低溫、干旱、鹽害等非生物脅迫的功能元件。因此，PRX家族為植物生長發(fā)育和參與抵御環(huán)境脅迫中的重要家族。毛果楊Potri.004G052100 (84K楊同源基因命名為PagPRX19)與擬南芥AtPRX19 (At2G34 060)的同源關系較近。研究表明：AtPRX19參與調(diào)控擬南芥的抗逆性[9,16]，推測與其同源的楊樹基因PRX19也具有此功能。此外，PRX19啟動子區(qū)域含有與鹽脅迫密切相關的IAA、ABA和MeJA等激素相關順式作用元件，參與植物耐鹽調(diào)控。選取PagPRX19基因分析其在84K楊中的表達模式(圖4)，結果顯示：PagPRX19基因在各個組織均有表達，在木質(zhì)部表達量最高。

圖1 PRX基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic analysis of the PRX gene family

圖2 楊樹PRX家族蛋白結構分析Figure 2 Protein motifs of the PRX family in poplar

圖3 楊樹PRX基因家族啟動子順式作用元件分析Figure 3 Cis-elements in promoters of PRX the gene family in poplar

圖4 PagPRX19基因組織特異性表達Figure 4 Tissue-specific expression of PagPRX19

2.2 轉(zhuǎn)基因苗的獲取及表型分析

對轉(zhuǎn)基因技術獲得的6株植株進行陽性苗鑒定，通過RT-qPCR分析不同陽性株系PagPRX19的表達量，選取了相對表達量分別為對照46和12倍的2個株系OE#1、OE#2進行表型分析(圖5)。分別選取6株生長2個月的土培苗統(tǒng)計株高和地徑發(fā)現(xiàn)：株系OE#1的株高(44.15 cm)與對照(47.36 cm)相比極顯著下降(P＜0.01)，而株系OE#2的株高(46.58 cm)與對照相比無顯著差異。株系OE#1的地徑(3.42 cm)和OE#2的地徑(3.49 cm)與對照(3.22 cm)相比極顯著增加(P＜0.01)。取植株第3片葉進行DAB和NBT化學染色(圖6)發(fā)現(xiàn)：與對照相比，PagPRX19過表達植株葉片的ROS水平顯著減少。對植株第7節(jié)間莖段組織切片進行DAB和NBT化學染色(圖7)發(fā)現(xiàn)：與對照相比，過表達植株莖段的ROS水平降低，說明過表達PagPRX19導致植株ROS降低。

圖5 陽性植株鑒定表型分析Figure 5 Identification and phenotypic analysis of transgenic overexpressed plants

圖6 轉(zhuǎn)基因植株第3片葉ROS水平檢測Figure 6 Changes of ROS level in the third leaf of transgenic plants

圖7 轉(zhuǎn)基因植株第7節(jié)間莖段ROS水平變化Figure 7 Changes of ROS level in the stem of the seventh internode of transgenic plants

2.3 鹽脅迫下植株相關生理指標的變化

在100 mmol·L?1NaCl生根培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下(圖8)，對照植株組培苗葉片大面積脫落，植株呈黃褐色，干枯嚴重甚至死亡。而過表達葉片失綠和皺縮情況與對照相比較輕，且無葉片脫落，說明過表達植株較對照具有更高的耐鹽性。在100 mmol·L?1NaCl溶液灌溉處理下，對照植株葉片大面積脫落，皺縮明顯，嚴重失綠。過表達株系OE#2葉片輕度失綠，葉緣處皺縮不明顯。株系OE#1僅葉緣處輕微皺縮，與正常生長的處理差異不明顯，與對照相比，過表達株系有更高的耐鹽性，其中表達量較高的株系OE#1較OE#2耐鹽性更強。

圖8 鹽脅迫下對照和轉(zhuǎn)基因植株的表型特征Figure 8 Phenotypic characteristics of non- and transgenic poplars under salt stress

從圖9可見：正常生長時，對照與過表達植株脯氨酸質(zhì)量分數(shù)、相對含水量、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、電解質(zhì)滲透率無顯著差異。鹽脅迫下，相較于對照植株的脯氨酸質(zhì)量分數(shù)(158.26 μg·g?1)，過表達植株脯氨酸質(zhì)量分數(shù)極顯著增加 (OE#1 為 244.94 μg·g?1，OE#2 為 217.02 μg·g?1)(P＜0.01)。與對照葉片相對含水量(70.05%)相比，過表達植株葉片相對含水量極顯著高于對照(OE#1為82.68%，OE#2為80.25%)(P＜ 0.01)。與對照丙二醛質(zhì)量摩爾濃度 (75.76 nmol·g?1)相比，過表達植株丙二醛質(zhì)量摩爾濃度(OE#1 為 39.44 nmol·g?1，OE#2 為 50.76 nmol·g?1)較低且差異極顯著(P＜0.01)。與對照電解質(zhì)滲透率(32.75%)相比，過表達植株電解質(zhì)滲透率(OE#1為24.24%，OE#2為27.09%)較低，且株系OE#1與對照差異極顯著(P＜0.01)。

圖9 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的生理指標Figure 9 Physiological index of transgenic plants under salt stress

2.4 ROS水平定性測定

對鹽脅迫處理后的土培苗葉片進行NBT和DAB染色(圖10)發(fā)現(xiàn)：與對照相比，過表達植株葉片的ROS信號少。對鹽脅迫處理后的組培苗根部進行DAB和NBT染色(圖11)后發(fā)現(xiàn)：與對照相比，PagPRX19過表達植株根部的ROS信號少。說明在鹽脅迫下，由于過表達PagPRX19導致植株ROS水平下降。

圖10 鹽脅迫下土培植株葉片ROS檢測Figure 10 Detection of ROS in leaves of soil culture plants under salt stress

圖11 鹽脅迫下組培植株根部ROS檢測Figure 11 Detection of ROS in roots of culture plants under salt stress

3 討論

過氧化酶PRX可催化H2O2，降低ROS水平，減輕脅迫對細胞的傷害[3]。因此，通過抗氧化酶清除鹽脅迫產(chǎn)生的ROS，以抵御脅迫帶來的細胞損傷，提高林木的抗性，可作為抗逆分子育種手段。本研究通過過表達過氧化酶基因，改變84K楊內(nèi)源ROS水平，從而探究ROS水平對楊樹耐鹽性的影響。

生物信息學分析發(fā)現(xiàn)：PagPRX19存在多個與IAA、ABA、或MeJA相關的順式作用元件，這些激素與鹽脅迫密切相關，參與植物耐鹽調(diào)控?；虮磉_模式分析發(fā)現(xiàn)：PagPRX19在植株各個組織都有表達。因此選取該基因作為研究對象，創(chuàng)制過表達植株。與對照植株相比，過表達植株葉片和莖段ROS水平降低。過基因植株H2O2降低，也隨之降低?？赡苁沁^表達加速了H2O2的清除，植物自身調(diào)控SOD酶加速分解產(chǎn)生H2O2，從而導致了減少[9]。對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行鹽脅迫處理，在100 mmol·L?1NaCl處理下，對照植株出現(xiàn)了脅迫癥狀，但過表達植株癥狀輕或沒有出現(xiàn)癥狀。過表達植株可能通過降低鹽脅迫下植株氧化脅迫程度，增強耐鹽性。ROS水平檢測結果驗證了這一推論，鹽脅迫下，過表達植株與對照相比，ROS水平仍保持較低水平。表明過表達PagPRX19可降低鹽脅迫下ROS的傷害，從而增強了轉(zhuǎn)基因植株的抗性。

研究表明：鹽脅迫下脯氨酸質(zhì)量分數(shù)增加[17]，葡萄Vitis vinifera砧木在一定程度內(nèi)的耐鹽性越強，脯氨酸等有機滲透物質(zhì)就越多[18]。本研究表明：鹽脅迫下，過表達PagPRX19植株脯氨酸質(zhì)量分數(shù)高于對照植株，使得植株的耐鹽能力增強。此外，鹽脅迫造成植物葉片含水量下降，植物生理活動會受到影響[19]。丙二醛和電解質(zhì)滲透率反映了細胞膜損壞程度[20]。鹽脅迫下，植株細胞膜被破壞，細胞膜內(nèi)物質(zhì)外滲，電解質(zhì)滲透率升高，丙二醛增加[21?22]，而耐鹽品種一般表現(xiàn)為葉片相對含水量高、電解質(zhì)滲透率和丙二醛低的特點[19,23]。本研究中，鹽脅迫下PagPRX19過表達植株葉片相對含水量比對照高，丙二醛、電解質(zhì)滲透率降低，表明轉(zhuǎn)基因植株細胞膜完整性較好，耐鹽性增強。

4 結論

過表達過氧化物酶基因PagPRX19可降低84K楊植株內(nèi)源ROS水平，且在鹽脅迫下過表達植株ROS仍保持低水平，細胞膜的破壞程度降低、葉片的持水能力增強。表明在楊樹中過表達PagPRX19，能促進鹽脅迫下植株內(nèi)源ROS的清除，從而減緩鹽脅迫造成的氧化脅迫，提高植株的耐鹽性。