叢枝菌根真菌對白刺花苗期抗旱酶系及生理特性的影響

田 方,陳 錫,,鐘 理,李 巖,王普昶,

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護與保護種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室，貴陽 550025；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州省草業(yè)研究所，貴陽 550006)

白刺花(Sophoradavidii)是豆科槐屬多年生灌木或小喬木。它具有抗逆性強、適應(yīng)性廣、適口性好、營養(yǎng)價值高、水土保持能力強等優(yōu)良特性，是干旱、貧瘠地區(qū)的節(jié)水抗旱先鋒植物，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)[1-3]；該植物還是一種民間草藥，已被證明是類黃酮、生物堿、類固醇、木脂素和酚酸的豐富來源，其根、葉、花和果實用于治療腹瀉、膀胱炎、胃痛、水腫和疥癬等疾病[4-6]。貴州槐屬植物種質(zhì)資源較為豐富，具有極高的觀賞價值、藥用價值和生態(tài)防護等用途。然而貴州是典型的喀斯特山區(qū)，地表裸露著大面積的碳酸鹽、石漠化和水土流失嚴重、旱災(zāi)頻發(fā)，但喀斯特山區(qū)水熱條件好，適合灌木、草本植物生長，充分合理利用地理條件優(yōu)勢，開展對槐屬植物白刺花抗旱栽培技術(shù)研究，建立草地農(nóng)業(yè)生態(tài)循環(huán)系統(tǒng)，對喀斯特山區(qū)生態(tài)恢復(fù)具有重要的實際應(yīng)用價值[7-8]。

叢枝菌根是球囊菌門真菌與植物根系形成的互惠共生體。相關(guān)研究表明約80%的陸地植物與AMF存在共生現(xiàn)象[9]。寄主植物通過光合作用合成碳源，并將其傳送給AMF，提供菌絲生長和孢子發(fā)育所需營養(yǎng)和能量，同時AMF幫助寄主植物吸收礦質(zhì)養(yǎng)分，促進植物生長發(fā)育，氣孔開閉、滲透調(diào)節(jié)和抗氧化保護系統(tǒng)等一系列生理生化反應(yīng)，誘導(dǎo)植物提高對逆境脅迫的抗性[10]。AMF與植物共生互作一直是菌根領(lǐng)域的研究重點內(nèi)容之一，在增強植物抗旱性、提高對高低溫的耐受性、增強耐鹽及耐酸能力、緩解重金屬對植物的毒害，以及提高植物抗病性和抗蟲性等方面有著重要作用[11-12]，而其中有關(guān)AMF提高植物抗旱性的報道較多，如干旱條件下柑橘(Poncirustrifoliata)接種AMF后發(fā)現(xiàn)菌根吸水能力提高2～7倍，顯著提高了植株的抗旱能力[13]；烤煙(NicotianaL.)幼苗侵染AMF后，煙苗氮、磷、鉀含量增加及抗旱性大幅提升[14]；構(gòu)樹幼苗接種AMF后可以緩解干旱脅迫對幼苗生長和光合參數(shù)的影響，提高其抗旱性[15]。施用AMF可以提高植物抗旱性，發(fā)揮作用的大小因菌劑種類、施用方式及實施對象具有一定差異[16-18]。岳海等[19]對澳洲堅果幼苗接種土著AMF后發(fā)現(xiàn)植株根系的定植能力更強，抗旱性增強；許慶龍等[20]對南高叢藍莓接種4種AMF后發(fā)現(xiàn)植株根、莖、葉的磷和鉀含量以及根圍土壤酸性磷酸酶、脲酶和過氧化氫酶活性增加，尤以侵染摩西球囊霉菌時抗旱效果最佳。另外在小麥(TriticumaestivumL.)、任豆 (Zeniainsignis)和西紅柿(Lycopersiconesculentum)等作物中普遍發(fā)現(xiàn)接種AMF能提高宿主植物的抗旱性[16-18]。

目前，對干旱脅迫下AMF與白刺花抗旱性的相關(guān)研究鮮有報道。本研究對干旱處理后白刺花幼苗施用3種種屬和4個濃度梯度的AMF，測定白刺花葉片過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide disimutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、谷胱甘肽S-移換酶(glutathione S-transferase，GST)等酶活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，還測定淀粉、可溶性糖和纖維素等生理生化指標，探究AMF對白刺花苗期抗旱酶系及生理特性的影響，并進行綜合評價，篩選出最優(yōu)AMF菌株及最適濃度，為喀斯特山區(qū)白刺花節(jié)水抗旱調(diào)節(jié)措施提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 試驗材料為貴州省草業(yè)研究所審定品種‘盤江白刺花’(Sophoradavidii(Franch.) Skeels)，種植于貴州省草業(yè)研究所溫室大棚內(nèi)[光照強度為 700 μmol·m-2·s-1，溫度為(20±5) ℃，光照14 h，黑暗10 h，濕度為60%] 。

1.1.2 供試菌種 供試菌種為根內(nèi)球囊霉1株(Glomusintraradices，BEG Number 193，簡稱 BEG-193)，幼套球囊霉1株(Glomusetunicatum，BEG Number 168，簡稱BEG-168)，摩西球囊霉1株(Glomusmosseae，BEG Number 167，簡稱BEG-167)。3株菌種由貴州大學(xué)山地植物資源保護與保護種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室惠贈。試驗前經(jīng)高粱(SorghumbicolorL.) Moench)擴繁后得到由孢子、菌絲、菌根節(jié)段和培養(yǎng)基質(zhì)組成的菌劑。

1.2 材料處理

選取籽粒飽滿、大小均一的白刺花種子，自來水沖洗2 h，浸泡24 h。用75%的酒精浸泡 1 min，蒸餾水沖洗3～4次，然后用84消毒液浸泡2 min，蒸餾水沖洗3～4次，置于30 ℃恒溫箱中催芽。待種子自然萌發(fā)后采用育苗穴盤(上口徑60 mm；底部28 mm；深度53 mm)進行育苗，選取長勢一致且無病蟲害的幼苗。試驗共設(shè)空白對照CK(未接種處理接等量滅菌真菌接種物)+3種AMF接種物(培養(yǎng)基質(zhì)、孢子、菌根根段和菌絲作為接種物)，每種真菌分別設(shè)置3個濃度梯度10%、20%、40%(對應(yīng)每處理分別施用20、40、 80 g菌劑)。將滅菌的基質(zhì)裝入塑料花盆中，每盆裝入供試基質(zhì)(營養(yǎng)土+蛭石)和相應(yīng)濃度的真菌接種物，共0.2 kg。每個處理生物學(xué)重復(fù)10次。前期正常澆水，進行緩苗處理，緩苗生長15 d后，根據(jù)葉片特征變化，自然狀態(tài)下連續(xù)干旱處理10 d后測定其葉片生理生化指標。

1.3 生理生化指標測定

選取白刺花植株中上部、受光較一致的第 3～7片功能葉，擦凈表面污漬后用液氮速凍，置于-80 ℃保存，備用。按SOD抑制氮藍四唑(NBT)光化還原法[21]測定葉片超氧化歧化酶(SOD)活性；采用紫外吸收法[22]測定過氧化氫酶(CAT)活性；采用硫代巴比妥酸法[23]測定丙二醛(MDA)含量；采用愈創(chuàng)木酚法[24]測定過氧化物酶(POD)活性；采用蒽酮法[21]測定可溶性糖、纖維素和淀粉含量。每處理3次生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)3個技術(shù)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，用 SPSS 24.0軟件進行相關(guān)性分析和單因素方差分析(ANOVA)并通過Duncan氏法在α= 0.05時進行多重比較。對所測樣本的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析、主成分分析，采用隸屬函數(shù)分析法綜合評價3種AMF對白刺花抗旱性的影響[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMF對白刺花表型特征的影響

干旱脅迫下接種不同種類、不同濃度AMF，白刺花表型表現(xiàn)出明顯差異(圖1)。在適宜濃度的AMF處理下白刺花葉片長勢良好,干旱癥狀明顯減弱，對照(CK)則表現(xiàn)出葉片明顯萎蔫卷曲，葉尖和葉基出現(xiàn)焦枯甚至出現(xiàn)植株死亡等癥狀，表明AMF可能具有提高白刺花抗旱能力的作用。

A.摩西球囊霉菌；B.幼套球囊霉菌；C.根內(nèi)球囊霉菌

2.2 AMF對白刺花抗旱酶系的影響

由表1可知，在干旱脅迫下，接種不同種類的AMF后白刺花葉片的抗氧化酶和解毒酶活性顯著上升(P<0.05)。接種40%根內(nèi)球囊霉菌，CAT和POD酶活最高，與未接種相比差異顯著；接種40% 幼套球囊霉菌時，SOD和GST酶活最高，上升幅度最大，差異達到顯著性水平。由試驗結(jié)果可知，接種適宜濃度的AMF可以極大的提高白刺花葉片的CAT、POD、SOD和GST酶的活性，有效的緩解干旱脅迫對白刺花葉片造成的氧化損傷。

表1 干旱脅迫下AMF對白刺花抗旱酶系的影響Table 1 Effect of AMF on drought-resistant enzymes of Sophora davidii under drought stress

2.3 AMF對白刺花生理指標的影響

由圖2可知，干旱脅迫處理下，施用3種不同濃度的AMF后白刺花葉片的淀粉、可溶性糖、纖維素和MDA含量發(fā)生顯著性變化(P<0.05)，接種40%幼套球囊霉菌時，淀粉含量最高，增長58.2%，與對照相比有顯著性；當(dāng)接種40%摩西球囊霉菌時，可溶性糖含量最高，提高25.3%，差異顯著；接種20%根內(nèi)球囊霉菌時，纖維素含量最多，增加45.5%，與未接種相比有顯著性差異；當(dāng)接種20%幼套球囊霉菌時，MDA含量最低，差異達到顯著水平。以上結(jié)果表明，施用適宜濃度的AMF可以顯著提高白刺花葉片淀粉、可溶性糖和纖維素含量，降低MDA含量，以此來降低干旱脅迫帶來的傷害。不同菌株和不同濃度的AMF在不同抗旱指標上各有優(yōu)勢和劣勢，很難判斷各濃度AMF的總體抗旱水平，因此要對各AMF的抗旱指標進一步分析，進行綜合評價。

不同大寫字母表示同一濃度處理下不同AMF間差異顯著，不同小寫字母表示同一AMF不同處理間差異顯著(P<0.05)

2.4 干旱脅迫下白刺花葉片各抗旱指標的相關(guān)性分析

對干旱脅迫下白刺花的生理生化指標進行相關(guān)性分析，結(jié)果由表2可知，在淀粉、CAT、GST、POD和SOD中，任意2個指標之間均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(P<0.01)，其中淀粉與GST的相關(guān)系數(shù)最大為0.808，而淀粉與CAT的相關(guān)系數(shù)最小為0.596；而MDA與淀粉、CAT、GST、POD、SOD、可溶性糖、纖維素之間呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)(P<0.01)，其中最大系數(shù)為0.760，最小為0.525。8個抗旱指標之間都存在一定的相關(guān)性，說明干旱脅迫下對白刺花施加AM真菌使其提高抗旱能力是由多方面因素綜合決定的。

表2 白刺花葉片各抗旱指標相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of drought resistance indexes of Sophora davidii leaves

2.5 干旱脅迫下白刺花葉片各抗旱指標主成分分析

將白刺花幼苗的8個綜合抗旱指標數(shù)據(jù)進行主成分分析，由KMO和Bartlett檢驗結(jié)果得KMO 為0.790，大于0.5的標準；顯著性為 0.000，小于顯著水平0.05，適用于主成分分析方法。根據(jù)各主成分的特征值和貢獻率進行主成分提取，由表3可知特征值大于1的主成分有2個，第一主成分的特征值為5.053，方差貢獻 63.16%，第二主成分的特征值為1.067，方差貢獻13.33%。兩個主成分累積貢獻率達到 76.50%，可將前2個主成分的指標作為AM真菌耐旱處理的綜合評價指標。

表3 白刺花葉片各抗旱指標特征值和累積方差貢獻率Table 3 Eigenvalues and cumulative variance contribution rate of each drought resistance index of Sophora davidii leaves

由表4可知，除了MDA對第一主成分產(chǎn)生負向影響外，其余的指標均產(chǎn)生正向影響，載荷數(shù)都比較高，POD最高，為0.944；對第二主成分產(chǎn)生負向影響的指標有可溶性糖和纖維素，載荷數(shù)為-0.071和-0.713，正載荷指標中淀粉最高，為載荷值0.355。

表4 白刺花葉片各抗旱指標主成分荷截得分矩陣Table 4 Principal component charge cut-off score matrix of drought resistance index of Sophora davidii leaves

2.6 不同濃度的AMF對白刺花幼苗生長抗旱酶系和生理指標的綜合評價

對白刺花幼苗施加不同種屬和不同濃度的AMF，使其增強應(yīng)對干旱脅迫的能力，為了科學(xué)地評價AMF對白刺花抗旱性的影響，篩選最佳的菌種和濃度，采用隸屬函數(shù)綜合評價法，分別計算出各濃度菌種接種后，白刺花的抗旱指標的隸屬函數(shù)值，把各項指標的隸屬函數(shù)值累加，取其平均值。隸屬函數(shù)均值越大，AMF提高白刺花的作用效果越明顯。由表5可知，3個菌種的平均隸屬函數(shù)值為0.168～0.847，菌種間差異較大，其中幼套球囊霉菌的抗旱性最佳。施用不同濃度的3種真菌，白刺花抗旱效果排序依次為：40% BEG- 168>40% BEG-193>20% BEG-168>20% BEG-193>10% BEG-168>40% BEG-167>20% BEG-167>10% BEG-167>10% BEG-193>CK，結(jié)果顯示：接種40%幼套球囊霉菌時抗旱效果最佳。

表5 白刺花幼苗抗旱指標的隸屬函數(shù)綜合評價Table 5 Comprehensive evaluation of subordination function of drought resistance indexes of Sophora davidii seedlings

3 討 論

干旱是限制喀斯特山區(qū)植被生長的主要原因之一，白刺花作為喀斯特山區(qū)廣泛分布的灌叢群落優(yōu)勢種，已成為干旱、貧瘠地區(qū)水土保持和飼料行業(yè)的理想材料[26-27]，而AMF與植物的共生關(guān)系又可有效提高對干旱逆境的耐受性[10]，因此研究AMF與白刺花幼苗共生對干旱脅迫的適應(yīng)策略，對喀斯特地區(qū)飼料資源開發(fā)和生態(tài)植被恢復(fù)都具有重要的理論與實踐指導(dǎo)意義。

在長期的進化過程中，植物通過一系列特征變化、生理生化響應(yīng)等機制，以緩解干旱脅迫帶來的損害[28]。如植物體內(nèi)的抗旱酶(SOD、POD、CAT和GST)主要是通過促進H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)過量的過氧化產(chǎn)物和脂質(zhì)氫過氧化物，以防止ROS(reactive oxygen species，不完全還原的氧，自由基和非自由基)過度積累而導(dǎo)致細胞損傷和死亡。CAT、POD、SOD和GST是植物體內(nèi)主要的抗環(huán)境脅迫的酶系，通過它們的變化程度可以反映植物的抗逆性。本研究中白刺花幼苗接種3種AMF后均表現(xiàn)出較高酶活性，說明AMF侵染能有效清除脅迫下產(chǎn)生的有害活性氧自由基，降低脅迫帶來的傷害。許慶龍等[20]對南高叢藍莓接種四種AMF后，發(fā)現(xiàn)葉片SOD活性均顯著高于未接種株，其中以摩西球囊霉菌的抗旱效果最佳；劉兆娜等[29]研究發(fā)現(xiàn)，百合混合接種摩西球囊霉和地表球囊霉菌種后生長加快，植株體內(nèi)CAT、POD和SOD活性提高。接種不同菌株的AMF抗氧化酶的變化程度不同，說明白刺花在不同環(huán)境中對過氧化物積累和過氧化物清除能力有差異，這與鮑根生對小花棘豆(OxytropisglabraDC)接種叢枝菌根真菌后的研究結(jié)果類似[30]。MDA作為植物細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，植物受到氧化傷害的程度越小體內(nèi)積累MDA量越少[31-32]。鄧杰等[33]研究發(fā)現(xiàn)，AMF的存在可以緩解逆境脅迫對植物造成的傷害，接種AMF后在一定程度上不僅能促進植物生長、磷吸收以及光合作用的進行，提高抗氧化酶活性，還能降低丙二醛(MDA)濃度。本研究發(fā)現(xiàn)AMF侵染白刺花后，丙二醛(MDA)濃度顯著低于對照，植株受到的氧化傷害降低，這與鄧杰等[33]研究結(jié)果類似。

在生理生化適應(yīng)性方面，AMF共生是植物應(yīng)對干旱脅迫環(huán)境的重要途徑[34]，表現(xiàn)為：增加土壤水分攝取，增強植物吸收水分的能力；提高抗氧化酶活性，降低氧化損傷；調(diào)節(jié)內(nèi)源激素和滲透壓平衡、促進植物吸收養(yǎng)分；增加葉綠色含量，促進光合效率，提高宿主植物抗逆性[35-38]。本研究中接種摩西球囊霉菌能顯著提高白刺花葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖含量，改變植物糖代謝水平，以維持細胞的滲透勢，增強細胞的保水能力，從而增強白刺花對干旱脅迫的耐受性。Wu等[39]在干旱條件下接種AMF也顯著提高枳(PoncirustrifoliaL.)葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，進而增強其抗旱性；劉兆娜等[29]在干旱條件在對百合接種AMF后發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白、可溶性糖含量分別比對照提高了25%和46%，減輕膜脂氧化的傷害，增強非酶促防御系統(tǒng)能力，增強植物細胞的抗旱能力。而淀粉和纖維素作為植物體內(nèi)重要碳水化合物和能量儲存體，當(dāng)遭遇干旱脅迫時，植物體內(nèi)的淀粉和纖維素可能會分解成糖類來抵御逆境，以維持滲透壓平衡，增強植株耐旱性，以保持正常的生命活動[40-41]。本試驗中干旱條件下接種AMF后，白刺花幼苗的淀粉和纖維素的含量顯著高于對照(P<0.05)，從而增強植株對干旱脅迫的耐受性。這與孫悅燕等[42]對干旱條件下華北落葉松幼苗接AMF后研究結(jié)果相似。

本研究采用隸屬函數(shù)綜合評價法，評價了不同菌株和濃度的AMF對白刺花幼苗生理生化抗旱指標的影響，在一定程度上宏觀清晰地得出各濃度菌株綜合評價值。但在實際應(yīng)用中，由于受到不同品種、生長環(huán)境和干旱程度不一致等情況的影響，結(jié)果可能存在著一定的局限性，因此需要對植株的生境進行全面考慮，針對性地選擇適宜濃度的AMF。

4 結(jié) 論

干旱條件下對白刺花施加適宜濃度的AMF能提高白刺花葉片的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗旱酶活性，降低葉片的MDA含量，提高淀粉和纖維素含量以改變糖代謝水平，提升白刺花的抗旱性。綜合分析比較不同AMF處理對干旱條件下白刺花幼苗抗氧化酶和生理特性的影響發(fā)現(xiàn)，3種AMF對白刺花幼苗的抗旱提升效果排序依次為幼套球囊霉菌>根內(nèi)球囊霉菌>摩西球囊霉菌，且在施用濃度40%的幼套球囊霉菌時抗旱效果最佳，為白刺花節(jié)水抗旱栽培技術(shù)研發(fā)及AMF的推廣應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)。