鐵皮石斛RRT家族全基因組鑒定及表達分析

聶 聰，龍小琴，何基澤，孫語釩，趙欣宇，王萬軍，朱乾坤

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)是一種名貴的中藥材，主要分布于云南、貴州、四川等地。多糖是鐵皮石斛的主要成分之一，主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖等多種單糖組成[1-2]，且具有極高的藥用價值。湯志遠(yuǎn)等[3]研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖可提高糖尿病小鼠的血清胰島素水平，降低其空腹?fàn)顟B(tài)的血糖值，具有降低血糖的良好作用；寧曉妹等[4]研究發(fā)現(xiàn)長期喂食鐵皮石斛多糖可有效降低小鼠的體質(zhì)量增長率；鐘惠娟等[5]研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖能夠抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能；張珊珊等[6]研究發(fā)現(xiàn)免疫力低下的小鼠在喂食鐵皮石斛多糖后免疫調(diào)節(jié)作用顯著增強；陳舜讓等[7]研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖可以減輕過氧化氫對HaCaT細(xì)胞的損傷作用。

糖基轉(zhuǎn)移酶在植物中廣泛存在，可將活性糖基從核苷糖(通常為UDP-glucose)轉(zhuǎn)移到小分子受體上，使其糖基化，從而影響植物的代謝平衡、生長發(fā)育及應(yīng)對非生物脅迫的能力[8]。UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)是糖基轉(zhuǎn)移酶家族數(shù)量最多[9]，主要有以UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-半乳糖、UDP-木糖等為供體的糖基轉(zhuǎn)移酶[10]。近年來，愈來愈多的研究表明UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶在植物應(yīng)對非生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用，葡糖基轉(zhuǎn)移酶UGT91Q2的下調(diào)可以提高茶樹對冷脅迫的耐受性[11]；在鹽、干旱、脫落酸脅迫下，擬南芥UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶74E2可以提高種子的發(fā)芽率[12]；張一凡等[13]研究發(fā)現(xiàn)楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶GT14家族中有3個基因參與鹽脅迫響應(yīng)。

Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖(rhamngalacturonan-Ⅰ,RG-Ⅰ)包含重復(fù)的結(jié)構(gòu)單元 [→4)-α-D-GalpA-(1→2)-α-l-Rhap-(1→ ]，其GalA可在O-2及O-3處被乙?；?，與同型半乳糖醛酸聚糖類似[14]，RG-Ⅰ的合成需要半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶等[15]，但參與RG-Ⅰ主干合成的糖基轉(zhuǎn)移酶研究較少。最近的研究在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了編碼鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ鼠李糖轉(zhuǎn)移酶(rhamnogalacturon Ⅰ rhamnosyltransferase，RRT)的AtRRT1，其可將UDP-β-Ⅰ-鼠李糖中的鼠李糖殘基轉(zhuǎn)移到RG-Ⅰ寡糖上[16-17]。目前，關(guān)于RRT在鐵皮石斛多糖合成中鮮見報道，本研究根據(jù)AtRRT的蛋白序列進行BLAST比對，在全基因水平篩選到7個鐵皮石斛RRT (DoRRT)蛋白序列和4個DoRRT基因，剔除冗余序列后得到4個DoRRT蛋白序列，并進行系統(tǒng)進化、保守基序、基因結(jié)構(gòu)及表達特性等分析，為深入研究DoRRT生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以在西南交通大學(xué)植物組織培養(yǎng)室光照培養(yǎng)箱中生長的5月齡的鐵皮石斛幼苗為試材，光照培養(yǎng)箱的條件設(shè)定為：22 ℃，16 h光照/8 h黑暗，光照強度為100 μmol·m-2·s-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 DoRRT蛋白的理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載擬南芥RRT家族的蛋白序列，在BLAST中選擇Protein BLAST，將物種限定在鐵皮石斛中進行搜索，下載鐵皮石斛的RRT蛋白序列，去除冗余序列，最終選取XP_028556032.1、XP_020691735.1、XP_028555770.1、 XP_020703023.1進行研究。在ProtParam在線網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)分析DoRRT蛋白家族的理化性質(zhì)，如氨基酸長度、分子質(zhì)量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)及總平均親水系數(shù)。在Plant-mPLoc[18]在線網(wǎng)站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)對DoRRT蛋白家族進行亞細(xì)胞定位 分析。

1.2.2 DoRRT家族的系統(tǒng)進化樹分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫下載大豆(Glycinemax)、油棕(Elaeisguineensis)、擬南芥(ArabiDopsisthaliana)、茸毛煙草(Nicotianatomentosiformis)、水稻(Oryzabrachyantha)、椰子(Cocosnucifera)的RRT蛋白序列。用MEGA-X鄰近法構(gòu)建進化樹，建樹結(jié)果在ITOL(https://itol.embl.de/)中進行美化。

1.2.3 DoRRT蛋白質(zhì)序列比對及保守基序分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫下載鐵皮石斛RRT蛋白序列，并將其導(dǎo)入MEME[19]在線網(wǎng)站(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)進行分析，將motifs的數(shù)量設(shè)定在10，其他參數(shù)默認(rèn)。將DoRRT蛋白序列導(dǎo)入MEGA-X中構(gòu)建進化樹。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載DoRRT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用TBtools[20]繪制DoRRT保守基序、保守結(jié)構(gòu)域、進化樹圖。將DoRRT蛋白的ClustalW比對結(jié)果導(dǎo)入ESPript 3.0在線網(wǎng)站(https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)進行可視化分析。

1.2.4 DoRRT蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 分別在SOPMA在線網(wǎng)站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和Phyre2[21]在線網(wǎng)站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)對DoRRT蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)進行分析，參數(shù)默認(rèn)。

1.2.5 材料處理 在其他培養(yǎng)條件相同的情況下將鐵皮石斛幼苗分別置于100 mmol·L-1NaCl、5 μmol·L-1ABA(脫落酸，Abscisic acid)、10%PEG(聚乙二醇，Polyethylene glycol)的1/2 MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基中處理6 h。同時將1/2 MS培養(yǎng)基中的鐵皮石斛幼苗在40 ℃和4 ℃處理6 h，吸干水分后將幼苗分裝，迅速置于液氮中1 min，取出放入-80 ℃冰箱保存，待用。

1.2.6DoRRT基因家族表達分析 用購自北京擎科生物科技有限公司的RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒分別提取鐵皮石斛幼苗根、莖、葉和6種處理后的鐵皮石斛幼苗的總RNA，并用購自TaKaRa的PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行cDNA合成，再以cDNA為模板，用購自北京擎科生物科技有限公司的 2×TSINGKE Master Mix及相應(yīng)引物進行PCR擴增。PCR擴增程序為：98 ℃預(yù)變性2 min； 98 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，變性-退火-延伸共35個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。PCR結(jié)果以EF1α為內(nèi)參基因進行相對定量。每個PCR試驗重復(fù)6次。逆轉(zhuǎn)錄PCR引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 DoRRT蛋白家族理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位分析

從鐵皮石斛全基因組水平上篩選出的4個DoRRT蛋白分別命名為DoRRT1、 DoRRT2、 DoRRT3、DoRRT4(表2)。理化性質(zhì)分析表明DoRRT2蛋白序列的氨基酸數(shù)目為530 aa，分子質(zhì)量為61.04 ku，其余DoRRT蛋白序列的氨基酸數(shù)目為491～502 aa，分子質(zhì)量為56.08～ 57.72 ku；DoRRT蛋白的等電點為8.82～9.35；DoRRT蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為41.04～51.92；DoRRT蛋白的脂肪系數(shù)為 89.23～91.91；DoRRT蛋白的總平均親水系數(shù)均為負(fù)數(shù)，為 -0.298～-0.247，表明DoRRT蛋白均為親水蛋白質(zhì)。DoRRT蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示DoRRT1定位在高爾基體和細(xì)胞核，DoRRT2定位在高爾基體，DoRRT3定位在高爾基體和細(xì)胞質(zhì)，DoRRT4定位在高爾基體。

表2 DoRRT蛋白家族理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of DoRRTs

2.2 DoRRT家族系統(tǒng)進化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載大豆(Glycinemax)、油棕(Elaeisguineensis)、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)、擬南芥(ArabiDopsisthaliana)、茸毛煙草(Nicotianatomentosiformis)、水稻(Oryzabrachyantha)、椰子(Cocosnucifera)的RRT蛋白序列。用MEGA-X鄰近法構(gòu)建進化樹，如圖1。結(jié)果顯示這7個物種的34個RRT蛋白聚為4組(A、B、C、D)，A組的RRT蛋白共有5個，B組的RRT蛋白共有5個，C組的RRT蛋白共有6個，D組的RRT蛋白共有18個，其中DoRRT2和DoRRT4蛋白共同聚類在B組 ，DoRRT1、DoRRT3蛋白共同聚類在D組。 DoRRT2、DoRRT4親緣關(guān)系較近，可能是由于比較近的基因復(fù)制造成。

Gm.大豆；Eg.油棕；Do.鐵皮石斛；At.擬南芥；Nt.茸毛煙草；Ob.水稻；Cn.椰子。用MEGA-X鄰近法構(gòu)建進化樹，序列比對采用ClustalW，選擇Bootstrap method，Bootstrap replications選擇500，Model選擇p-distance，Gaps/Missing Data Treatment選擇Partial deletion，Site Coverage Cutoff設(shè)定為50，進行建樹

2.3 DoRRT蛋白二級結(jié)構(gòu)

DoRRT蛋白質(zhì)預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)如表3所示。結(jié)果表明DoRRT蛋白的二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲，其中DoRRT蛋白的α-螺旋的占比為44.62%～48.41%，β-折疊的占比為8.76%～9.62%，β轉(zhuǎn)角的占比為 6.09%～7.54%，無規(guī)卷曲的占比為36.04%～40.37%。

表3 DoRRT蛋白二級結(jié)構(gòu)占比Table 3 Proportion of secondary structure of DoRRTs

2.4 DoRRT蛋白三級結(jié)構(gòu)

DoRRT蛋白三級結(jié)構(gòu)如圖2所示。4個DoRRT的三級結(jié)構(gòu)都是基于模板c3zy6A構(gòu)建的，其中DoRRT1的三級結(jié)構(gòu)覆蓋范圍達61%， DoRRT2的三級結(jié)構(gòu)覆蓋范圍達57%，DoRRT3的三級結(jié)構(gòu)覆蓋范圍達60%，DoRRT4的三級結(jié)構(gòu)覆蓋范圍達61%。在預(yù)測到的DoRRT三級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋的占比為35.06%～37.42%，β-折疊的占比為10.06%～11.2%，無規(guī)卷曲的占比為52.52%～53.65%。這與SOPMA中預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)占比有差異，可能是由于算法差異導(dǎo)致。

4個DoRRT蛋白的三維結(jié)構(gòu)都是基于模板c3zy6A構(gòu)建的，置信度為100%

2.5 DoRRT家族結(jié)構(gòu)分析

利用ClustalW對4個DoRRT蛋白進行多序列比對，結(jié)果顯示DoRRT1、DoRRT3蛋白序列同源性較高，DoRRT2、DoRRT4序列同源性較高，4個DoRRT蛋白序列一致性達67.82%(圖3)。4個DoRRT蛋白均有O-FucT保守結(jié)構(gòu)域(圖4-A)，DoRRT3相較于其他3個DoRRT而言，缺少motif10。4個DoRRT的O-FucT保守結(jié)構(gòu)域均包括完全的motif2、motif3、motif5、motif9這4個保守基序，部分的motif1、motif4保守基序(圖4-A)，表明4個DoRRT的蛋白結(jié)構(gòu)高度保守。對DoRRT的基因結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，4個DoRRT均有2個UTR，且均位于基因的兩端(圖5)。

利用ClustalW對DoRRT蛋白進行多重序列比對，參數(shù)默認(rèn)

A.4個DoRRT蛋白保守基序(左)和保守結(jié)構(gòu)域(右)；B.保守基序示意圖

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載鐵皮石斛基因組數(shù)據(jù)，用TBtools對DoRRT結(jié)構(gòu)進行分析繪圖，CDS表示編碼區(qū)，UTR表示非編碼區(qū)

2.6 DoRRT表達分析

2.6.1DoRRT在根、莖、葉中的表達 鐵皮石斛多糖在不同組織中含量不同，對DoRRT在根莖葉中的表達情況進行研究。結(jié)果顯示DoRRTs在鐵皮石斛根、莖、葉中均有表達，且主要集中在地上部分(圖6)。DoRRT1在葉和莖中的表達顯著高于根中的表達量，其中DoRRT1在葉中的表達量最高，其次為莖，最后為根；DoRRT2在葉和莖中的表達量顯著高于根，其中DoRRT2在莖中的表達量最高，其次為葉，最后為根；DoRRT4在根和葉中的表達量相似，而DoRRT4在莖中的表達量顯著高于根和葉。在試驗過程中未檢測到DoRRT3的轉(zhuǎn)錄，可能是由于DoRRT3的表達量太低或DoRRT3是假基因所致。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=6 ，下同 the same below

2.6.2DoRRT在脅迫處理下的表達 鐵皮石斛生長在懸崖峭壁上，會受到各種非生物脅迫，鐵皮石斛多糖含量豐富，有可能參與非生物脅迫響應(yīng)。多種糖基轉(zhuǎn)移酶參與多糖的合成，因此研究非生物脅迫下DoRRTs的表達具有重要意義。對100 mmol·L-1NaCl、5 μmol·L-1ABA、10%PEG、40 ℃、4 ℃及空白對照處理6 h后的鐵皮石斛的RRT基因轉(zhuǎn)錄水平進行研究(圖7)，結(jié)果表明：除低溫外，NaCl、ABA、PEG、高溫脅迫處理下的DoRRT1相對表達量均降低，但與對照組相比無顯著差異；DoRRT2在PEG和高溫脅迫處理下的相對表達量顯著低于CK組，而在其他脅迫處理下DoRRT2的相對表達量與對照組相比無顯著差異；DoRRT4在NaCl和ABA脅迫下相對表達量均升高，與對照組相比無顯著差異，而其在高溫脅迫處理下的相對表達量極其顯著低于對照組。這些結(jié)果表明DoRRTs響應(yīng)非生物脅迫。

CK(對照).1/2 MS培養(yǎng)基中處理6 h；NaCl.含100 mmol·L-1 NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中處理6 h；ABA.含5 μmol·L-1的ABA的1/2 MS培養(yǎng)基中處理6 h；PEG.含10%PEG的1/2 MS培養(yǎng)基中處理6 h；HT.鐵皮石斛幼苗在40 ℃下處理6 h；LT.鐵皮石斛幼苗在4 ℃下處理6 h

3 討 論

鐵皮石斛多糖含量豐富，且種類較多，Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖就是其中一種。通過BLAST搜索發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛中的4個RRT基因，系統(tǒng)進化樹顯示DoRRT2、DoRRT4蛋白聚類在一組，DoRRT1、DoRRT3蛋白聚類在一組。鐵皮石斛的RRT蛋白被聚類為兩組，表明DoRRT蛋白出現(xiàn)功能分化，具體功能有待進一步研究。因為編碼鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ鼠李糖轉(zhuǎn)移酶的AtRRT1已經(jīng)被證實參與RG-Ⅰ的合成，且AtRRT1、AtRRT2、AtRRT3、AtRRT4的蛋白同源性在52%～86%，故推測DoRRT也參與鐵皮石斛中RG-Ⅰ的合成。理化性質(zhì)分析表明DoRRT蛋白均為親水蛋白質(zhì)，且均可定位在高爾基體，而RG-Ⅰ可作為細(xì)胞壁的組成成分，這與推測的DoRRT參與RG-Ⅰ合成的結(jié)果一致；DoRRT蛋白的α-螺旋和無規(guī)卷曲較多；4個DoRRT蛋白均有O-FucT保守結(jié)構(gòu)域，且序列一致性達 67.82%；對DoRRTs在根、莖、葉中的表達特性分析發(fā)現(xiàn)，DoRRTs在地上部分的表達量顯著高于地下部分，這與已有研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖在莖中含量更高結(jié)果一致[22-23]。對不同處理6 h后的DoRRT的表達量分析發(fā)現(xiàn)，不同脅迫處理下DoRRTs的表達量有所差異。在高溫脅迫下DoRRT2、DoRRT4的表達量均顯著低于對照組，這與陳璐[24]研究發(fā)現(xiàn)的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76F1在高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄受到抑制結(jié)果一致。綜上所述DoRRT對PEG和高溫脅迫較為敏感，表明DoRRT可參與非生物脅迫響應(yīng)。

糖基化可參與植物的生長發(fā)育、對逆境脅迫的防御、次生代謝產(chǎn)物的合成等[25-27]。研究參與糖基化的相關(guān)酶的生物學(xué)功能可以更好地從分子層面認(rèn)識糖基化對植物產(chǎn)生影響的機理。糖基轉(zhuǎn)移酶存在于所有生物中，它們可以催化糖基殘基從活化的供體轉(zhuǎn)到受體分子中，從而使一系列分子糖基化[28]。參與RG-Ⅰ主干合成的糖基轉(zhuǎn)移酶研究較少，本研究對鐵皮石斛的鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ鼠李糖轉(zhuǎn)移酶進行生物信息學(xué)分析及相關(guān)表達分析，可為后續(xù)深入研究DoRRT參與鐵皮石斛的多糖合成及非生物脅迫響應(yīng)提供數(shù)據(jù)支撐。