依達(dá)拉奉對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠肺組織TGF-β1及IL-6表達(dá)的影響

鄭婉，李天發(fā)，左琦，魏俊萍，顏亞妮

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，海南 海口 570102

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是由多種臨床原因引起的肺動(dòng)脈壓力異常升高的病理生理狀態(tài)[1]。低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是由于低氧引起的PAH，可導(dǎo)致患者右心室衰竭并最終引發(fā)死亡[2]。既往研究表明，氧化應(yīng)激水平在HPH形成過(guò)程中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。在HPH的早期時(shí)，肺部細(xì)胞炎性因子大量分泌，氧化應(yīng)激增加，當(dāng)給抗氧化應(yīng)激藥物抑制后，肺動(dòng)脈高壓與肺血管重塑有所改善[3]，表明氧化應(yīng)激可能參與了HPH的過(guò)程，并且對(duì)肺血管的重塑有一定作用[4]。依達(dá)拉奉是一種強(qiáng)抗氧化劑，可防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肌萎縮側(cè)索硬化癥患者運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡，通常被用于治療肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)。研究表明依達(dá)拉奉可以減弱氧化應(yīng)激、抑制TLR-4/NF-κB和JAK1/STAT3炎性信號(hào)通路并增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[5]。CAI 等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)及白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)與低氧性肺動(dòng)脈高壓相關(guān)，靶向抑制兩者可以通過(guò)調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡改善肺動(dòng)脈壓。已有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激能促進(jìn)炎性因子的分泌，增加細(xì)胞凋亡水平[7-8]。然而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平是否能改善低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠體內(nèi)的TGF-β1與IL-6水平進(jìn)而改善肺動(dòng)脈高壓，目前尚不清晰。

本研究采用依達(dá)拉奉治療低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠，成功降低了其體內(nèi)的氧化應(yīng)激，并降低了TGF-β1及IL-6的表達(dá)水平，從而了解依達(dá)拉奉對(duì)于肺動(dòng)脈高壓發(fā)展和治療效果的影響，為低氧性肺動(dòng)脈高壓的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠(8～10 周齡，20～25 g)由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司提供，許可證號(hào)為SXCK(京)2016-0011。所有小鼠處于自然光暗周期的環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫25℃，實(shí)驗(yàn)期間自由飲食飲水。

1.2 主要試劑 依達(dá)拉奉注射液購(gòu)自陜西健民制藥有限公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物試劑研究所；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green試劑購(gòu)自上海翌圣公司；TGF-β1抗體、IL-6 抗體、Caspase3 抗體、Bcl-2抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Biosharp 生物科技有限公司；相關(guān)qPCR 引物由上海生工合成：GAPDH-F，5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'；GAPDH-R，5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'；TGF-β1-F，5'-CGTGGAAATCAACGCT CCAC-3'；TGF-β1-R，5'-CCACGTAGTAGACGATGG C-3'；IL-6-F，5'-GCCTTCTCTGATGCT-3'；IL-6-R，5'-TGTGACTCCAGCTTATCTCTTGG-3'；Bcl-2-F，5'-AGCATGCGACCTCTGTTTGA-3'；Bcl-2-R，5'-GCCA CACGTTTCTTGGCAAT-3'。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物毒性實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)數(shù)表法將同批次40只C57BL/6J小鼠分為0 mg/kg組、20 mg/kg組、40 mg/kg組、80 mg/kg 組，每組10只。每天腹腔注射依達(dá)拉奉，持續(xù)2周，每2 d觀測(cè)小鼠活動(dòng)狀態(tài)并記錄體質(zhì)量。

1.3.2 動(dòng)物建模、分組與給藥 取C57BL/6J小鼠40 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分為四組，每組10只，依據(jù)處理方法不同分為對(duì)照組、低氧組、正常治療組及低氧治療組。正常組和正常治療組置于正常環(huán)境飼養(yǎng)，而低氧組和低氧治療組的小鼠均置于氧含量10%的低氧艙，艙內(nèi)二氧化碳(CO2)由CO2吸附劑清除，連續(xù)8周低氧后，通過(guò)測(cè)量小鼠肺動(dòng)脈峰值流速、右心收縮壓力、右心室厚度，以確定成功構(gòu)建低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠模型后，給予藥物依達(dá)拉奉進(jìn)行治療。正常治療組和低氧治療組每天腹腔注射40 mg/kg 依達(dá)拉奉，持續(xù)兩周，正常組和低氧組給予等體積生理鹽水，兩周后，收集小鼠的血清和肺組織檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.3 小鼠血清/肺組織中MPO、ROS、MDA的質(zhì)量濃度與SOD酶活力檢測(cè) 分別取各組小鼠的血清/肺組織研磨液，根據(jù)試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)所示方法，分別檢測(cè)ROS含量、MPO、MDA和SOD的酶活性。

1.3.4 RT-qPCR 檢測(cè)各組小鼠肺組織細(xì)胞因子mRNA 的表達(dá) TRIzol 試劑提取小鼠肺組織中的總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)總RNA的純度和含量。按照RT-qPCR 試劑盒實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，依次進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)。RT-qPCR反體系：上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 ng，SYBR Primix Ex TaqTM5 μL，ddH2O補(bǔ)充至10 μL。RT-qPCR 反應(yīng)條件：95℃(30 s)預(yù)變性后，變性95℃(7 s)，退火55℃(30 s)，72℃(15 s)，40個(gè)循環(huán)周期。根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織中細(xì)胞因子的表達(dá) 收集各組小鼠肺組織，使用RIPA裂解提取總蛋白，通過(guò)BCA方法進(jìn)行蛋白定量。樣品變性后通過(guò)SDS-PAGE 凝膠電泳分離等量蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜。5%脫脂牛奶室溫條件孵育1 h，TBST洗膜5 min，3次，加入TGF-β1抗體(1∶1 000)、IL-6 抗體(1∶1 000)、Caspase3抗體(1∶1 000)、Bcl-2抗體(1∶1 000)，4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜8 min，3次，隨后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔的二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h，TBST 洗膜8 min，3 次。顯影曝光，利用Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 和GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依達(dá)拉奉毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 給予小鼠注射不同濃度(0 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg)依達(dá)拉奉，1 次/d，持續(xù)兩周。兩周后0 mg/kg、20 mg/kg 和40 mg/kg，三組體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與0 mg/kg 組比較，80 mg/kg 組體質(zhì)量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。結(jié)果說(shuō)明，40 mg/kg 以下劑量濃度對(duì)小鼠無(wú)明顯毒性，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇40 mg/kg給藥濃度。

圖1 梯度濃度依達(dá)拉奉對(duì)C57小鼠的毒性實(shí)驗(yàn)

2.2 依達(dá)拉奉改善HPH 小鼠的MPO、ROS 和MDA表達(dá)水平 收集4組小鼠血清和肺組織，檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，正常治療組小鼠血清和肺組織MPO、ROS、MDA 含量、SOD 酶活力比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常對(duì)照組比較，低氧組小鼠血清和肺組織MPO、ROS、MDA 含量升高，SOD 酶活力降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低氧組比較，低氧治療組小鼠血清和肺組織MPO、ROS、MDA 含量降低，SOD 酶活力升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 依達(dá)拉奉改善低氧小鼠氧化應(yīng)激

2.3 依達(dá)拉奉有效降低HPH小鼠細(xì)胞血清炎性因子因子TGF-β1、IL-6 表達(dá) 采用qRT-PCR 和Western blot檢測(cè)四組小鼠肺組織TGF-β1及IL-6表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，正常治療組小鼠肺組織TGF-β1、IL-6 比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常對(duì)照組比較，低氧組小鼠肺組織TGF-β1、IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低氧組比較，低氧小鼠治療組肺組織TGF-β1、IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3和圖4。采用ELISA 檢測(cè)四組小鼠血清和肺組織TGF-β1及IL-6分泌情況。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，正常治療組小鼠血清和肺組織TGF-β1、IL-6含量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常對(duì)照組比較，低氧組小鼠血清和肺組織TGF-β1、IL-6含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低氧組比較，低氧治療組小鼠血清和肺組織TGF-β1、IL-6 含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖3 PCR檢測(cè)各組小鼠肺組織TGF-β1和IL-6 mRNA表達(dá)

圖4 Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織中TGF-β1和IL-6 蛋白表達(dá)

圖5 各組小鼠血清中炎性因子TGF-β1和IL-6濃度水平

2.4 依達(dá)拉奉抑制HPH 小鼠肺組織細(xì)胞凋亡 采用qRT-PCR 和Western blot 檢測(cè)四組小鼠肺組織Caspase3及Bcl-2表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，正常治療組小鼠肺組織Caspase3、Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常對(duì)照組比較，低氧組小鼠肺組織Caspase3、Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與低氧組比較，低氧治療組小鼠肺組織Caspase3、Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6和圖7。

圖6 PCR檢測(cè)依達(dá)拉奉對(duì)各組小鼠肺組織Caspase3和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平

圖7 Western blot檢測(cè)依達(dá)拉奉對(duì)各組小鼠肺組織Caspase3和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平

3 討論

HPH具有發(fā)病率高，死亡率高的特點(diǎn)。目前HPH的治療方法主要有：抑制肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧狀態(tài)、逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈血管重構(gòu)、抑制血管收縮因子的作用及間接促進(jìn)血管擴(kuò)張物質(zhì)的形成等。盡管近年來(lái)針對(duì)HPH 的治療方法取得了飛速發(fā)展，但是目前只有肺移植手術(shù)才能根治HPH[9]。因此，尋找可靠的HPH治療方法仍是研究的熱點(diǎn)。

氧氣是維持哺乳動(dòng)物生命所必需的，氧氣供應(yīng)的減少(即缺氧)會(huì)改變線粒體ROS穩(wěn)態(tài)并誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[10]。為了應(yīng)對(duì)缺氧應(yīng)激，細(xì)胞會(huì)發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)，這些反應(yīng)主要由于缺氧誘導(dǎo)因子的激活、線粒體代謝的重編程、ROS 通量增加等[11]所致。缺氧引起的缺氧應(yīng)激與許多疾病的病理生理有關(guān)。HAYASHI 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，睡眠呼吸障礙患者會(huì)表現(xiàn)出間歇性缺氧，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加，加速動(dòng)脈粥樣硬化和肺動(dòng)脈高壓。另外，暴露于低壓缺氧環(huán)境中的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平增加，IL-6水平升高和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加，隨后蛋白激酶ERK1/2被激活，導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖并促進(jìn)低壓缺氧引起的肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展[13]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)的小鼠血清和肺組織中的MPO、ROS、MDA 含量升高，SOD 酶活力降低，說(shuō)明低氧性肺動(dòng)脈高壓導(dǎo)致小鼠肺組織和外周血氧化應(yīng)激水平升高。依達(dá)拉奉具有抗氧化應(yīng)激和抗凋亡特性，用依達(dá)拉奉進(jìn)行治療可以消除由鎘引起的小鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[14]。之前的研究結(jié)果也表明，依達(dá)拉奉通過(guò)降低血清TNF-α水平來(lái)改善新生兒敗血癥模型中肺動(dòng)脈高壓，表明依達(dá)拉奉對(duì)肺動(dòng)脈高壓具有一定的治療作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉治療低氧誘導(dǎo)的小鼠肺動(dòng)脈高壓，依達(dá)拉奉可以降低小鼠血清和肺組織MPO、ROS、MDA 含量，提高SOD 酶活力，表明依達(dá)拉奉對(duì)HPH 小鼠具有降低其氧化應(yīng)激水平的影響。

隨著HPH研究的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)炎癥在HPH中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，成為了HPH關(guān)鍵病理特征之一[15]。TGF-β1是一種多功能生長(zhǎng)因子，具有調(diào)節(jié)纖維化和免疫的特性[16]。TGF-β1被認(rèn)為是炎癥性肺部疾病發(fā)病機(jī)制中的重要調(diào)節(jié)因子，在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，低氧能誘導(dǎo)TGF-β的上調(diào)從而介導(dǎo)低氧性肺動(dòng)脈高壓[17]。IL-6 是常見(jiàn)的炎性因子，研究發(fā)現(xiàn)，IL-6 通過(guò)促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖參與了肺動(dòng)脈高壓的肺血管重塑過(guò)程[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用依達(dá)拉奉可有效抑制HPH 小鼠組織與血清中的TGF-β1和IL-6的表達(dá)水平，表明炎性因子的水平可能受到了氧化應(yīng)激水平的調(diào)節(jié)。

此外，有研究顯示氧化應(yīng)激會(huì)加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促使細(xì)胞凋亡從而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞[19]。LI等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡增加，促進(jìn)肺血管重塑。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明低氧性肺動(dòng)脈高壓可導(dǎo)致小鼠肺組織Caspase3、Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)升高，即細(xì)胞凋亡增加，當(dāng)給予依達(dá)拉奉治療后，可明顯改善小鼠肺組織損傷，降低其細(xì)胞凋亡水平。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠體內(nèi)存在較高的氧化應(yīng)激水平，并且其肺組織中TGF-β1與IL-6表達(dá)增加，而使用依達(dá)拉奉抑制氧化應(yīng)激后，可以顯著降低上述兩個(gè)細(xì)胞因子的水平。另外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠的肺組織中的凋亡水平增加，使用依達(dá)拉奉治療后可降低肺組織細(xì)胞凋亡水平。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明氧化應(yīng)激可能會(huì)成為低氧性肺動(dòng)脈高壓的新型治療靶點(diǎn)，可為進(jìn)一步探索低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生機(jī)制提供了理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。