基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探究天山花楸抗哮喘的作用機(jī)制

吳 娜，屯妮薩古麗·艾買提江，李改茹

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830017)

天山花楸(SorbustianschanicaRupr.)為薔薇科花楸屬植物，是新疆民間常用藥材，常以嫩枝葉、果實(shí)和莖皮入藥，主要包括黃酮類、糖類、氰苷類、氨基酸、蛋白質(zhì)、微量元素、有機(jī)酸、生物堿、揮發(fā)油等[1-2]，具有清熱利肺、補(bǔ)脾生津、止咳的功效，主要用于肺結(jié)核、哮喘咳嗽、胃炎及維生素A、C缺乏等癥的治療[3]。哮喘是呼吸道常見疾病，其發(fā)病涉及多種機(jī)制[4]，目前尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥療法在哮喘治療中存在明顯優(yōu)勢，中藥可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)而改善氣道炎癥，減輕哮喘癥狀，并且中藥具有安全性高、副作用小等多種優(yōu)點(diǎn)，可以替代或輔助西藥治療哮喘[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)天山花楸水提物可明顯延長豚鼠的引喘潛伏期，并能使正常豚鼠的離體氣管平滑肌明顯松弛[6]，天山花楸醇提液還可拮抗豚鼠離體平滑肌收縮，具有平喘作用[7]，但是其發(fā)揮抗哮喘活性的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制并不明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，初步探究天山花楸抗哮喘的作用靶點(diǎn)及通路，為深入研究其作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1活性成分的篩選及其靶點(diǎn)的預(yù)測根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立天山花楸化合物庫，從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫獲取了化合物的SMILES信息，并將其導(dǎo)入SwissTargetPrediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)對候選化合物的OB和DL進(jìn)行預(yù)測。要求必須同時滿足胃腸吸收(GI absorption)為“High”、5種類藥性預(yù)測(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)中有2個或2個以上為“Yes”，才能篩選為活性成分[8]。通過TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫和BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數(shù)據(jù)庫收集天山花楸活性成分可能的作用靶點(diǎn)[9]。應(yīng)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對目標(biāo)基因的名稱進(jìn)行名稱規(guī)范并轉(zhuǎn)換為簡寫，刪除無相應(yīng)基因名稱的靶點(diǎn)。

1.2疾病靶點(diǎn)的獲取以“Asthma”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、Herb數(shù)據(jù)庫(http://herb.ac.cn/)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)[10]，進(jìn)行檢索，屬性設(shè)置為“智人”，收集在3個數(shù)據(jù)庫中篩選到的疾病靶點(diǎn)。

1.3蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將化合物和疾病的靶標(biāo)分別上傳到在線維恩圖(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)中，取天山花楸靶點(diǎn)和哮喘靶點(diǎn)的交集，并將所獲得的交集靶點(diǎn)上傳到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，物種設(shè)置為“智人”。刪除游離靶標(biāo)后，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，將其導(dǎo)入Cytoscape3.9.1中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，并利用CytoNCA插件進(jìn)行核心靶點(diǎn)分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4GO和KEGG富集分析通過RStudio (version 1.4.1103 for Windows)軟件對PPI核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。為進(jìn)一步研究，將前20個KEGG信號通路及化合物相關(guān)靶點(diǎn)通過Cytoscape構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.5天山花楸“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建根據(jù)KEGG通路富集分析的前20條通路，和相應(yīng)的核心靶點(diǎn)建立相互作用聯(lián)系，構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)可視化圖。

1.6分子對接分子對接前處理：分別從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)和Pubchem數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)和活性成分的三維立體結(jié)構(gòu)。利用Open Babel軟件(http://openbabel.org/wiki/Main_Page)將化合物的SDF格式轉(zhuǎn)換為MOL2格式。下載的蛋白質(zhì)用AutoDock Tools進(jìn)行脫水、加氫預(yù)處理后，進(jìn)行化學(xué)成分與靶點(diǎn)蛋白的分子對接。采用Pymol對分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1活性成分篩選及靶點(diǎn)篩選通過SWISS ADME數(shù)據(jù)庫對化合物進(jìn)行ADME篩選，共篩選出17個活性成分，見表1。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫和BATMAN平臺預(yù)測靶點(diǎn)，BATMAN平臺設(shè)置“藥物-靶標(biāo)”間相似性得分Score cutoff≥20，AdjustedP-value<0.05，收集靶點(diǎn)，最后合并2次檢索信息，刪除重復(fù)值，共獲得810個靶點(diǎn)。

表1 天山花楸活性成分

2.2藥物作用靶點(diǎn)的篩選利用GeneCards、Herb和DisGeNET數(shù)據(jù)庫，以“Asthma”為關(guān)鍵詞篩選疾病靶點(diǎn)。將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)分別上傳到在線維恩圖中取交集，得到天山花楸作用于哮喘的靶點(diǎn)240個，見圖1。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰧@得的240個交集基因上傳到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，通過CytoNCA插件進(jìn)行分析，得到該網(wǎng)絡(luò)度值Degree平均數(shù)為14.272 727，節(jié)點(diǎn)緊密度Betweenness平均數(shù)為385.318 182，節(jié)點(diǎn)介度Closeness平均數(shù)為0.375 086 1。篩選出Degree、Betweenness值大于兩倍平均數(shù)、Closeness大于平均數(shù)的的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，共19個，核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。

2.4GO、KEGG富集分析GO功能分析結(jié)果顯示：共涉及1 876個生物過程(BP)、59個細(xì)胞組分(CC)和110個分子功能(MF)。各篩選前10條以條形柱狀圖展示，見圖3。生物過程主要富集在膠質(zhì)細(xì)胞分化(glial cell differentiation)、化學(xué)應(yīng)激的細(xì)胞反應(yīng)(cellular response to chemical stress)、膠質(zhì)發(fā)生(gliogenesis)、氧化應(yīng)激的細(xì)胞反應(yīng)(cellular response to oxidative stress)、DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)(regulation of DNA-binding transcription factor activity)、氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)、上皮細(xì)胞增殖(epithelial cell proliferation)等。細(xì)胞組分主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物(transcription regulator complex)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物RNA(polymerase II transcription regulator complex)、細(xì)胞基底部(basal part of cell)、膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)、核常染色質(zhì)(nuclear euchromatin)，分子功能主要富集在激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(activating transcription factor binding)、磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)、蛋白磷酸酶結(jié)合(protein phosphatase binding)、組蛋白去乙?；附Y(jié)合(histone deacetylase binding)等。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，共有142條信號通路，篩選出前20條通路以氣泡圖進(jìn)行展示，見圖4。結(jié)果顯示天山花楸干預(yù)哮喘主要涉及白介素17(interleukin-17，IL-17)、Toll樣受體、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、Th17細(xì)胞分化、HIF-1等信號通路。

2.5天山花楸“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建根據(jù)KEGG通路富集分析的前20條通路，和核心靶點(diǎn)建立相互作用聯(lián)系，將靶點(diǎn)、信號通路通過Cytoscape3.9.1軟件進(jìn)行可視化，結(jié)果如圖5所示，核心靶點(diǎn)用橙色節(jié)點(diǎn)表示，通路用綠色節(jié)點(diǎn)表示，度值越大，節(jié)點(diǎn)的形狀越大，根據(jù)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果表明RELA、AKT1、IL6、TNF、JUN、FOS可能是天山花楸治療哮喘的主要作用靶點(diǎn)。

2.6分子對接結(jié)果前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明天山花楸乙酸乙酯提取物具有抗哮喘活性，并且其發(fā)揮抗哮喘作用的物質(zhì)可能是黃酮類、酚類、苯丙素類及氰苷類化合物，如槲皮素、綠原酸、沒食子酸、苦杏仁苷等。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明其發(fā)揮抗哮喘作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能是RELA、AKT1，將這兩個靶點(diǎn)分別與槲皮素、綠原酸、沒食子酸、苦杏仁苷進(jìn)行分子對接，觀察化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合能力。結(jié)果顯示，槲皮素通過8個氫鍵與AKT1蛋白結(jié)合，結(jié)合能為-6.18 kcal/mol，槲皮素通過8個氫鍵與RELA蛋白結(jié)合，結(jié)合能為-5.91 kcal/mol，綠原酸通過5個氫鍵與AKT1蛋白結(jié)合，結(jié)合能為-3.46 kcal/mol，綠原酸通過4個氫鍵與RELA蛋白結(jié)合，結(jié)合能為-2.15 kcal/mol，沒食子酸通過5個氫鍵與AKT1蛋白結(jié)合，結(jié)合能為-3.48 kcal/mol，沒食子酸通過6個氫鍵與RELA蛋白結(jié)合，結(jié)合能為-2.76 kcal/mol，苦杏仁苷通過9個氫鍵與AKT1蛋白結(jié)合，結(jié)合能為-2.48 kcal/mol，苦杏仁苷通過5個氫鍵與RELA蛋白結(jié)合，結(jié)合能為-1.64 kcal/mol。結(jié)合能小于-1.2 kcal/mol時認(rèn)為結(jié)合良好，見表2。分子對接結(jié)果表明槲皮素、綠原酸、沒食子酸、苦杏仁苷均能與AKT1和RELA良好結(jié)合，見圖6。

表2 成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

3 討論

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對天山花楸的抗哮喘作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，結(jié)果表明天山花楸抗哮喘作用可能與AKT1、EGFR、TP53、TNF、JUN、IL-6、HSP90AA1、RELA、MAPK1、IL-1β等靶點(diǎn)有關(guān)，并且可能通過白介素17、腫瘤壞死因子、Toll樣受體、Th17細(xì)胞分化、HIF-1等信號通路發(fā)揮抗哮喘作用。分子對接結(jié)果表明，天山花楸活性成分與抗哮喘活性靶點(diǎn)的結(jié)合能較低，具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。

IL-17主要由CD4+T輔助細(xì)胞分泌并作用于Th17細(xì)胞，IL-17在哮喘氣道中可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤，誘發(fā)中性粒細(xì)胞性炎癥反應(yīng)，促進(jìn)氣道重塑[11]。TNF-α是哮喘發(fā)病過程中的重要炎癥因子，可以激活誘發(fā)多細(xì)胞相互作用并使炎癥持續(xù)發(fā)展，在TNF信號通路中，TNF-α可以激活MAPK/NF-κB[12-13]，同時可激活JNK信號通路[14]，JNK信號通路可以調(diào)控支氣管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡等。Toll樣受體激活可加劇氣道炎癥，未成熟的肺DC表達(dá)TLR，這些細(xì)胞在感染和炎癥進(jìn)程中被激活后導(dǎo)致共刺激分子上調(diào)、釋放Th2細(xì)胞因子，導(dǎo)致EOS浸潤，杯狀細(xì)胞黏液分泌增多，引起慢性氣道炎癥[15]。缺氧是支氣管哮喘患者中普遍存在的一種病理特征，在低氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1)可以激活VEGF信號通路，刺激氣道重塑[16]。同時，HIF-1α在促炎因子如IL-1β的生成中也發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)，初步探究了天山花楸抗哮喘的作用機(jī)制，找到了多個潛在的作用靶點(diǎn)，為后續(xù)研究天山花楸抗哮喘的作用靶點(diǎn)及通路奠定一定的基礎(chǔ)。