GATA6抑制肝星狀細(xì)胞活化在膽道閉鎖肝纖維化中的研究進(jìn)展

楊仁杰，張聰，詹江華

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是以肝內(nèi)外膽管進(jìn)行性炎性阻塞和肝纖維化為特征的小兒肝膽外科疾病，是引起嬰幼兒梗阻性黃疸的常見原因之一［1-3］。肝門空腸吻合術(shù)（Kasai術(shù)）被公認(rèn)為BA患兒的首選治療手段，能夠改善膽汁引流、逆轉(zhuǎn)膽汁淤積、延長(zhǎng)患兒自體肝生存時(shí)間，但遠(yuǎn)期自體肝生存情況仍不理想，最終需要肝移植來挽救生命［4-6］。GATA結(jié)合蛋白（GATA binding protein，GATA）6具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的功能，可抑制肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化并參與BA肝纖維化進(jìn)程。本文就GATA6的功能特點(diǎn)、作用途徑及在膽道閉鎖肝纖維化中的作用進(jìn)行綜述。

1 GATA6的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能

GATA家族是一組與DNA共有序列GATA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，因其保守的結(jié)合模序（A∕T）GATA（A∕G）而得名，是細(xì)胞分化和整個(gè)生殖軸上成年基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因素，在胚胎發(fā)育中主要參與細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控［7］。脊椎動(dòng)物GATA基因家族包括6個(gè)分子，可能是由脊椎動(dòng)物譜系進(jìn)化早期發(fā)生的2次主要基因復(fù)制事件形成的：第一次復(fù)制產(chǎn)生了GATA1、GATA2和GATA3，主要表達(dá)于造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，對(duì)造血細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的分化具有重要作用；第二次復(fù)制產(chǎn)生了GATA4、GATA5和GATA6，主要在脊椎動(dòng)物的肝臟、膽道、胰腺、心臟、肺、腸道、生殖腺中表達(dá)，通過與其他組織中富集的轉(zhuǎn)錄因子相互作用發(fā)揮發(fā)育調(diào)控功能［7-8］。

1.1 GATA6的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) GATA6是GATA轉(zhuǎn)錄因子家族一員，包含由2個(gè)鋅指（zinc finger）組成的高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DBD）——Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys［9］?？?近羧基端（C-terminus，C-端）的鋅指結(jié)構(gòu)稱為Cfinger，主要負(fù)責(zé)特異識(shí)別WGATAR（W=A或T，R=A或G）DNA堿基序列，從而使其結(jié)合到特定的GATA結(jié)合位點(diǎn)；靠近氨基端（N-terminal，N-端）的鋅指結(jié)構(gòu)稱為N-finger，主要通過與GATA蛋白輔因子的結(jié)合來調(diào)節(jié)C-finger的DNA結(jié)合能力。

1.2 GATA6的功能和作用 GATA6在肝臟、胰腺等器官的發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用［10］。肝臟發(fā)育主要包括內(nèi)胚層肝臟特化、肝芽生長(zhǎng)、肝母細(xì)胞增殖分化以及肝臟形態(tài)發(fā)生4個(gè)階段，整個(gè)過程離不開GATA家族、叉頭框A蛋白（forkhead box A，F(xiàn)oxA）家族和肝細(xì)胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF）家族等肝內(nèi)富集轉(zhuǎn)錄因子間形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，其中GATA6作為譜系特化因子、染色質(zhì)重塑因子、多能性因子和“先鋒因子”，在肝臟發(fā)育各階段發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，是肝臟發(fā)育早期階段所必需的少數(shù)因子之一，通常情況下通過與其他轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)分子的相互作用來發(fā)揮調(diào)控功能［11-12］。有學(xué)者通過對(duì)組蛋白3賴氨酸4二甲基化和組蛋白3賴氨酸27乙酰化標(biāo)記的表觀遺傳學(xué)分析，鑒定出GATA6是小鼠和人HSCs譜系的調(diào)節(jié)因子之一，在維持靜息樣HSCs表型中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13］。HSCs具有轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts，MFB）的能力，已被證實(shí)為肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，HSCs活化導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在肝內(nèi)過度積聚和沉積是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［14］。在四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，敲除GATA6轉(zhuǎn)錄因子的小發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）可導(dǎo)致促纖維化因子表達(dá)水平增高，HSCs激活，加重了CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化，即使停止CCl4對(duì)肝臟的損傷，肝纖維化程度也未見明顯減輕，表明GATA6是肝星狀細(xì)胞失活和肝纖維化消退所必需的，在肝損傷后HSCs發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13，15］。GATA6除調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性功能，還具有細(xì)胞定型、譜系轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)分化方面的作用，可啟動(dòng)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變開關(guān)［16］。

2 BA肝纖維化

BA患兒由于感染病毒引發(fā)固有或適應(yīng)性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)炎癥介質(zhì)增多、T細(xì)胞減少，使膽管結(jié)構(gòu)受到破壞或發(fā)育停滯，引起免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，損傷膽管上皮細(xì)胞，并促進(jìn)肝細(xì)胞釋放各種促炎因子、細(xì)胞因子、免疫產(chǎn)物，誘導(dǎo)反應(yīng)性膽管增生或肝祖細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)BA肝纖維化，膽管上皮損傷是BA肝纖維化的重要啟動(dòng)因素［17］。

2.1 BA肝纖維化特點(diǎn) BA肝纖維化是由多種因素參與、受多種基因調(diào)控導(dǎo)致的慢性輕中度肝損傷，伴隨肝臟內(nèi)部瘢痕形成，其過程復(fù)雜，進(jìn)展較快，早期行Kasai術(shù)僅改善了膽汁引流，而不能阻止肝纖維化進(jìn)展，導(dǎo)致遠(yuǎn)期自體肝生存情況不理想，最終需肝移植來挽救生命［5，18］。因此，BA肝纖維化機(jī)制成為小兒外科領(lǐng)域研究的重點(diǎn)，以期發(fā)現(xiàn)有效遏制肝纖維化的靶點(diǎn)，提高BA患兒自體肝生存率。

2.2 HSCs活化促進(jìn)BA肝纖維化 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是促進(jìn)BA肝纖維化進(jìn)程的一個(gè)關(guān)鍵因子，可由浸潤(rùn)細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞∕巨噬細(xì)胞）、HSCs、肌成纖維細(xì)胞和血小板等合成及分泌，當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，這些細(xì)胞都是TGF-β1的潛在來源［19-20］。巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生大量的炎性因子，如TGF-β1、白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-4、IL-6等誘導(dǎo)HSCs活化，激活的HSCs增殖并遷移至門管區(qū)或?qū)嵸|(zhì)ECM，產(chǎn)生并積累過多的纖維結(jié)締組織，形成纖維狀瘢痕，增殖的HSCs同時(shí)經(jīng)歷表型轉(zhuǎn)化形成肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞分化導(dǎo)致膽道纖維化、肝纖維化、肝硬化，HSCs一旦激活也可不斷分泌TGF-β1等，起到自身激活的作用，使這一過程持續(xù)下去［21］。此外，在肝臟損傷后，樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）通過分泌促炎因子，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）激活HSCs、T細(xì)胞，加劇肝纖維化。促進(jìn)肝纖化進(jìn)程的另一個(gè)關(guān)鍵因子纖維結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）也能通過調(diào)節(jié)HSCs的活化以促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。這兩個(gè)關(guān)鍵因子在膽道上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞上均有表達(dá)，并隨著肝纖維化程度的加重而愈加明顯。在慢性肝損傷中，血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）刺激HSCs釋放出纖維化的細(xì)胞外囊泡，HSCs自噬在維持肝臟穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，其自噬抑制纖維化因子的釋放，從而減輕肝纖維化［3，21-22］。

3 GATA6與BA肝纖維化

膽管上皮損傷是BA 肝纖維化的重要啟動(dòng)因素，HSCs的活化是肝纖維化形成和發(fā)展的核心，GATA6參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化，與炎癥反應(yīng)、HSCs活化、肝纖維化分期及肝損傷后修復(fù)等密切相關(guān)，可減輕肝細(xì)胞凋亡和纖維化損傷，是HSCs失活和肝纖維化消退所必需的，在肝損傷后調(diào)節(jié)HSCs發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3.1 GATA6與HSCs活化 在胚胎發(fā)育早期，GATA6表達(dá)于胚胎肝細(xì)胞和成體肝細(xì)胞，且能夠與FoxA、HNF、骨形態(tài)生成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等信號(hào)分子相互作用，調(diào)控肝臟發(fā)育并影響肝臟特化，隨著增殖遷移，肝母細(xì)胞分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞［23-25］。在肝臟發(fā)育早期，GATA6在膽管細(xì)胞和肝細(xì)胞中均有明顯表達(dá)，但在發(fā)育晚期僅表達(dá)于膽管細(xì)胞。Soini等［26-27］研究發(fā)現(xiàn)BA肝中GATA6表達(dá)上調(diào)后，已知的膽管細(xì)胞分化調(diào)節(jié)因子鋸齒狀蛋白1（jagged protein 1，JAG1）、肝細(xì)胞核因子1β（hepatocyte nuclear factor 1β，HNF1β）和HNF6表達(dá)也上調(diào)，Kasai術(shù)使血清膽紅素正?；驡ATA6表達(dá)降低，表明GATA6是BA中肝細(xì)胞導(dǎo)管化生的一個(gè)新的標(biāo)志物和潛在的誘導(dǎo)劑。研究表明，JAG1、HNF1β和HNF6分別通過Notch信號(hào)通路、HNF6∕HNF1β級(jí)聯(lián)反應(yīng)廣泛表達(dá)于多種組織器官，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和生長(zhǎng)發(fā)育，減輕肝細(xì)胞凋亡和纖維化損傷［28-30］。HSCs的活化在不同病因的肝纖維化中起著核心作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在激活的HSCs中檢測(cè)到146個(gè)上調(diào)基因和18個(gè)下調(diào)基因，這些基因也與肝纖維化有關(guān)，在這些重疊基因中，7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因（其中包括GATA6）被上調(diào)，1個(gè)類視黃醇X受體α（retinoid X receptorsα，RXRA）被下調(diào)，而GATA6是HSCs失活和肝纖維化消退所必需的，在肝損傷后調(diào)節(jié)HSCs發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［31］。推測(cè)GATA6在BA肝纖維化進(jìn)程中與JAG1、HNF1β和HNF6有相同或相近的作用，并在肝損傷肝再生過程中發(fā)揮作用，但具體是通過何種信號(hào)通路參與的BA肝纖維化進(jìn)程仍需要進(jìn)一步探索。

3.2 GATA6與HSCs衰老

3.2.1 GATA6促進(jìn)HSCs衰老 HSCs的活化是肝纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制HSCs增殖、促進(jìn)活化的HSCs衰老可能成為肝纖維化防治的新策略［32］。細(xì)胞衰老是細(xì)胞受到某些特定的刺激，如氧化應(yīng)激、DNA損傷、端粒侵蝕、染色質(zhì)破壞等而被激活的一種終末應(yīng)激激活程序，主要受p53和p16INK4a腫瘤抑制蛋白的調(diào)控［33］。在肝纖維化的發(fā)展過程中存在衰老細(xì)胞，這些細(xì)胞主要來自活化的肝星狀細(xì)胞，最初因肝損傷而增殖并沉積在纖維化肝臟的ECM中，衰老激活的HSCs可減少ECM成分的分泌，增強(qiáng)免疫監(jiān)視，促進(jìn)纖維化的逆轉(zhuǎn)［32］。Zhang等［34］研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）可以誘導(dǎo)HSCs衰老，并確認(rèn)轉(zhuǎn)錄因子GATA6是促進(jìn)DHA誘導(dǎo)的HSCs衰老的上游分子，該研究發(fā)現(xiàn)DHA在體外和體內(nèi)都需要GATA6的積聚才能誘導(dǎo)衰老標(biāo)志物p53、p16、p21和高遷移率族蛋白組A1（high mobility group protein A1，HMGA1）基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)HSCs衰老。

3.2.2 GATA6促進(jìn)HSCs衰老的途徑 用GATA6siRNA預(yù)處理細(xì)胞后，DHA對(duì)活化的HSCs中p53和p16表達(dá)的促進(jìn)作用明顯減弱，有證據(jù)表明絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPKs）在p53和p16的激活中起著重要作用［35-36］。MAPKs在真核細(xì)胞中有4條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）p42∕p44通路、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和（或）應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated MAP kinases，SAPK）通路、p38通路和ERK5∕大絲裂原活化蛋白激酶1（big MAP kinase1，BMK1）通路，它們通過轉(zhuǎn)錄因子磷酸化而改變基因的表達(dá)水平，可介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、死亡及細(xì)胞間的功能同步等多種生理病理過程；研究顯示GATA6過表達(dá)可顯著提高磷酸化JNK1∕2（p-JNK1∕2）的表達(dá)水平，激活JNK1∕2信號(hào)，調(diào)節(jié)自噬活性，但對(duì)磷酸化ERK1∕2（p-ERK1∕2）和磷酸化p38（p-p38）的表達(dá)無明顯影響；JNK1∕2抑制劑抑制了JNK1∕2的活性，阻斷了GATA6或DHA誘導(dǎo)的p53和p16表達(dá)上調(diào)，證明JNK1∕2參與并介導(dǎo)GATA6誘導(dǎo)的p53和p16表達(dá)上調(diào)；上述結(jié)果提示GATA6過表達(dá)可能通過MAPKs依賴的機(jī)制參與DHA誘導(dǎo)的HSCs衰老［34］。

3.3 GATA6協(xié)同上調(diào)鐵調(diào)素表達(dá)抑制HSCs活化

3.3.1 鐵調(diào)素（hepcidin，Hepc）表達(dá)減少與肝纖維化鐵代謝紊亂相關(guān) 近年來研究表明，多種導(dǎo)致肝纖維化的慢性肝病均與肝臟鐵代謝紊亂有關(guān)，肝臟過多的鐵沉積可引起活性氧增加，促進(jìn)HSCs活化，造成肝纖維化；而HSCs活化使腸道內(nèi)鐵的吸收和巨噬細(xì)胞對(duì)鐵的釋放相對(duì)不平衡，進(jìn)一步加重肝纖維化；Hepc是鐵的負(fù)性調(diào)節(jié)激素，其表達(dá)的減少與各種慢性肝纖維化疾病鐵代謝紊亂的發(fā)生密切相關(guān)［37］。Hepc是由人類抗菌肽編碼基因（human antimicrobial peptide，HAMP）編碼的25個(gè)氨基酸殘基組成的抗菌肽激素，是主要由肝細(xì)胞在鐵含量失衡、炎癥或缺氧狀態(tài)下分泌的一種鐵調(diào)節(jié)肽，在鐵代謝中起著核心作用［38］。

3.3.2 Hepc在肝臟中的表達(dá)途徑 Hepc在肝臟中的表達(dá)可通過兩個(gè)主要途徑誘導(dǎo)：TGF-β信號(hào)通路中骨形態(tài)生成蛋白-6（bone morphogenetic protein 6，BMP-6）介 導(dǎo) 的HJV∕BMP∕Smad途 徑 和JAK-STAT信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥途徑（主要通過IL-6）［39］。研究表明，BA膽汁淤積過程中可通過抑制IL-6信號(hào)通路、阻斷磷酸化細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，pSTAT3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而下調(diào)Hepc的表達(dá)，說明在膽汁淤積過程中增加Hepc的表達(dá)可能有助于減輕BA引起的膽汁淤積性肝損傷［40］。

3.3.3 GATA6協(xié)同上調(diào)Hepc抑制HSCs活化 在慢性肝病肝細(xì)胞中GATA4和GATA6與GATA蛋白輔因子共同調(diào)節(jié)HAMP的轉(zhuǎn)錄。Bagu等［39］研究了GATA及其輔因子蛋白與IL-6和BMP-6處理后Hepc表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)無論用IL-6還是BMP-6處理Huh-7人肝癌細(xì)胞，都能提高HAMP啟動(dòng)子的活性；將HAMP啟動(dòng)子與GATA4和GATA6共轉(zhuǎn)染后，IL-6或BMP-6處理后的HAMP啟動(dòng)子活性進(jìn)一步增強(qiáng)；但將HAMP啟動(dòng)子與GATA的輔因子蛋白1或輔因子蛋白2共轉(zhuǎn)染則抑制了HAMP啟動(dòng)子對(duì)IL-6或BMP-6處理的反應(yīng)；GATA和其輔因子蛋白對(duì)IL-6或BMP6誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性的影響可被HAMP啟動(dòng)子區(qū)-103∕-98的GATA反應(yīng)元件TTATCT突變消除；在體內(nèi)，脂多糖處理導(dǎo)致肝損傷的小鼠肝臟中GATA-6 mRNA的表達(dá)增加，而GATA-4 mRNA表達(dá)出現(xiàn)一過性下降，且與Hepc的表達(dá)呈正相關(guān)。該項(xiàng)研究結(jié)果表明，GATA6可能介導(dǎo)了出生后炎癥期間肝細(xì)胞中Hepc的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，且在炎癥過程中與Hepc的表達(dá)呈正相關(guān)，與Hepc協(xié)同上調(diào)，進(jìn)而明顯抑制HSCs活化，減輕炎癥反應(yīng)，在一定程度上減輕肝纖維化［39］。

4 小結(jié)

綜上所述，膽管上皮損傷是BA肝纖維化的重要啟動(dòng)因素，HSCs的活化是肝纖維化形成和發(fā)展的核心，GATA6參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化，與炎癥反應(yīng)、HSCs活化、肝纖維化分期及肝損傷后肝修復(fù)等密切相關(guān)，可減輕肝細(xì)胞凋亡和纖維化損傷，是HSCs失活和肝纖維化消退所必需的，在肝損傷后調(diào)節(jié)HSCs發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在炎癥反應(yīng)、鐵含量失衡或缺氧狀態(tài)下，GATA6可協(xié)同上調(diào)抗菌肽激素Hepc的表達(dá)，通過MAPKs依賴的機(jī)制誘導(dǎo)p53和p16表達(dá)上調(diào)，抑制HSCs活化，促進(jìn)HSCs衰老，減輕肝纖維化。GATA6是否還通過其他信號(hào)通路共同參與BA肝纖維化發(fā)展過程尚有待于進(jìn)一步探究。