沙門氏菌快速檢測方法的研究進(jìn)展

◎ 袁京磊

（平邑縣檢驗(yàn)檢測中心，山東 平邑 273300）

沙門氏菌是一種人畜共患病的病原菌[1]。沙門氏菌傳統(tǒng)的檢測方法主要是國標(biāo)法《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016），該方法需要進(jìn)行預(yù)增菌、增菌、分離、生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定等步驟，其操作過程復(fù)雜、耗時(shí)太長，無法實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌的快速檢測。近年來，針對(duì)沙門氏菌的快速檢測方法研究比較多，本文總結(jié)了可視化檢測、生物傳感器、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、電化學(xué)和表面增強(qiáng)拉曼光譜等沙門氏菌快速檢測方法，以期為實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的快速檢測提供應(yīng)用實(shí)例。

1 可視化檢測方法

可視化檢測具有無需復(fù)雜的檢測設(shè)備、操作簡單、成本低廉、檢測時(shí)間短等優(yōu)勢，在食品安全檢測方面應(yīng)用較多。納米金由于具有獨(dú)特的光學(xué)、化學(xué)、電化學(xué)、催化性能及生物相容性，在可視化檢測方面的應(yīng)用較廣泛。適配體可吸附在納米金的表面，防止納米金在氯化鈉的作用下發(fā)生聚集；當(dāng)體系中出現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，適配體會(huì)特異性的與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合，使納米金與適配體分離，在氯化鈉的作用下，納米金發(fā)生聚集，溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，從而實(shí)現(xiàn)可視化檢測?；谶@一原理，孫博等[2]實(shí)現(xiàn)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的可視化檢測，檢測范圍為2.9×103～2.9×107CFU·mL-1，檢 測 限 為 2.9×102CFU·mL-1， 可 在 15 min 內(nèi) 完 成檢測，對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率為90.51%～109.97%。此外，CHEN等[3]基于雙適配體和納米金，實(shí)現(xiàn)了對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的可視化檢測；由擴(kuò)增子和納米金探針之間的雜交形成的高度穩(wěn)定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可保護(hù)納米金在鹽的作用下發(fā)生聚集和顏色的變化；在優(yōu)化條件下，檢測范圍為3.3×101～3.3×106CFU·mL-1，對(duì)加標(biāo)牛奶樣品的可視化檢測限達(dá)95 CFU·mL-1，該方法可用于牛奶樣品中活鼠傷寒沙門氏菌的即時(shí)檢測。

2 生物傳感器檢測方法

生物傳感器是一種對(duì)生物物質(zhì)敏感并將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號(hào)進(jìn)行檢測的儀器，具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低等優(yōu)勢，在臨床診斷、食品和藥物分析及生物技術(shù)、生物芯片等研究中有著廣泛應(yīng)用。QI等[4]開發(fā)了一種微流控生物傳感器，使用具有模擬過氧化物酶活性的金屬有機(jī)框架來放大生物信號(hào)，并通過自主開發(fā)的Raspberry Pi App來快速檢測沙門氏菌。①目標(biāo)菌用免疫磁性納米珠進(jìn)行分離和濃縮，并用免疫有機(jī)金屬框架標(biāo)記形成免疫磁性納米珠-沙門氏菌-有機(jī)金屬框架復(fù)合物。②該復(fù)合物用于催化無色鄰苯二胺和H2O2生成黃色的2，3-二氨基吩嗪。③收集催化劑的圖像，并使用Raspberry Pi App進(jìn)行分析，以確定細(xì)菌的濃度。該方法可在1 h內(nèi)完成檢測，檢測范圍為1.5×101～1.5×107CFU·mL-1，檢測限為 14 CFU·mL-1，在雞肉樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率約為112%，表明該方法可以用于實(shí)際樣品中沙門氏菌的檢測；該方法具有操作自動(dòng)化、反應(yīng)速度快、使用試劑少、設(shè)備體積小等優(yōu)點(diǎn)，有望用于食源性致病菌的現(xiàn)場快速檢測。

WANG等[5]開發(fā)了一種檢測沙門氏菌的壓力生物傳感器，利用磁性納米珠（MNBs）分離目標(biāo)菌、納米鉑顆粒修飾的二氧化錳納米花（Pt@MnO2 NFs）來放大檢測信號(hào)和壓力檢測器來監(jiān)測壓力變化，并通過藍(lán)牙傳輸?shù)街悄苁謾C(jī)應(yīng)用程序進(jìn)行沙門氏菌的分析和測定。①捕獲抗體（CAb）修飾的MNBs從樣品中分離沙門氏菌，形成MNBs-CAb-沙門氏菌復(fù)合物（磁性細(xì)菌）。②檢測抗體（DAbs）修飾的Pt@MnO2 NFs用于標(biāo)記磁性細(xì)菌，形成MNB-CAb-沙門氏菌-DAb-Pt@MnO2 NF復(fù)合物（納米花細(xì)菌）；納米花細(xì)菌在密封的離心管中用H2O2重新懸浮后，H2O2被Pt@MnO2 NFs催化產(chǎn)生O2，導(dǎo)致壓力增加。③壓力的增加由基于壓敏電阻的壓力檢測器進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，并通過藍(lán)牙傳輸?shù)街悄苁謾C(jī)應(yīng)用程序進(jìn)行沙門氏菌的分析和測定；該方法可在1.5 h內(nèi)完成定量檢測，檢測范圍為1.5×101～1.5×105CFU·mL-1，檢測限為 13 CFU·mL-1。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)檢測每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析。HUANG等[6]開發(fā)了一種快速、準(zhǔn)確檢測沙門氏菌的方法。首先，將沙門氏菌細(xì)胞通過磁分離從復(fù)雜的食品基質(zhì)中分離出來，再進(jìn)行基于SYBR GREEN的實(shí)時(shí)定量PCR檢測，整個(gè)檢測過程可在1.5 h內(nèi)完成，檢測限低于30 CFU·mL-1，并對(duì)胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基、牛奶和生菜進(jìn)行了檢測。謝雨龍等[7]建立了一種實(shí)時(shí)熒光PCR法快速檢測預(yù)包裝柳州螺螄粉中沙門氏菌的方法，根據(jù)沙門氏菌invA基因設(shè)計(jì)引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)體系中的探針濃度后，對(duì)人工添加沙門氏菌和干擾菌模擬受污染的預(yù)包裝柳州螺螄粉樣品進(jìn)行檢測，檢測靈敏度為100 CFU·mL-1，檢測限為4 CFU/25 g，該方法具有檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢，可以用于預(yù)包裝柳州螺螄粉中沙門氏菌的快速、高效檢測。

4 電化學(xué)檢測方法

電化學(xué)分析法是根據(jù)溶液中物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及其變化規(guī)律，建立在以電位、電導(dǎo)、電流和電量等電學(xué)量與被測物質(zhì)之間的計(jì)量關(guān)系的基礎(chǔ)之上，對(duì)組分進(jìn)行定性和定量的儀器分析方法，具有靈敏度和準(zhǔn)確度高、檢測范圍寬等特點(diǎn)。WANG等[8]基于交叉微電極開發(fā)了一種新型阻抗生物傳感器，通過阻抗變化實(shí)現(xiàn)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的快速和超靈敏檢測。①將捕獲的鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體1組裝在磁珠外層，用于富集和分離復(fù)雜樣品中的鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞。②將已識(shí)別的鼠傷寒沙門氏菌單克隆抗體2固定在SiO2@MnO2納米復(fù)合材料的表面，與磁珠-鼠傷寒沙門氏菌偶聯(lián)物反應(yīng)形成磁珠-鼠傷寒沙門氏菌-SiO2@MnO2夾心復(fù)合物。通過H2O2將夾心復(fù)合物表面的MnO2還原為Mn2+，實(shí)現(xiàn)阻抗的明顯變化；在牛奶樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，濃度在2.0×101～2.0×105CFU·mL-1的回收率為83.1%～97.0%，檢測限為21 CFU·mL-1。SOARES等[9]制備了一種高度敏感且無標(biāo)記的激光誘導(dǎo)石墨烯電極，并用抗體進(jìn)行功能化，實(shí)現(xiàn)對(duì)腸炎沙門氏菌的檢測，檢測范圍為25～105CFU·mL-1，檢測限為（13±7） CFU·mL-1，檢測時(shí)間為22 min，且無需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)濃縮或氧化還原標(biāo)記。

5 表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測方法

表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）分析包括定性和定量分析，在食品安全檢測中有廣泛的應(yīng)用。CHUESIANG等[10]基于適配體開發(fā)了一種快速、特異性檢測腸炎沙門氏菌的SERS方法；在這項(xiàng)研究中，將一個(gè)短鏈腺嘌呤和一個(gè)熒光分子修飾到適配體上，并在1 184 cm-1和730 cm-1處出現(xiàn)特征峰，證明該方法可以特異性的檢測腸炎沙門氏菌，可用于碎牛肉中腸炎沙門氏菌的檢測，總的檢測時(shí)間為4 h。邵琳等[11]應(yīng)用適配體結(jié)合SERS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)腸炎沙門氏菌的特異性檢測，檢測限為102CFU·mL-1；在豬肉樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率為93.37%～100.18%，可用于食品加工過程中腸炎沙門氏菌的檢測，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低、快速簡便的優(yōu)勢。ZHOU等[12]建立了一種磁輔助SERS標(biāo)記免疫測定法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛奶樣本中大腸桿菌O157∶H7、單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測，這3種致病菌的檢測限分別達(dá)到了10 CFU·mL-1、10 CFU·mL-1和25 CFU·mL-1；該方法通過應(yīng)用基于游離抗體標(biāo)記和葡萄球菌蛋白A（PA）-SERS標(biāo)記識(shí)別的方法來實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)菌的高靈敏檢測；該SERS生物傳感器由兩種功能納米材料組成：適配體修飾的Fe3O4@Au磁性納米粒子作為磁性SERS平臺(tái)用于病原菌的富集和PA修飾的SERS標(biāo)簽作為目標(biāo)菌定量檢測的通用探針；目標(biāo)細(xì)菌富集后，游離抗體用于特異性標(biāo)記目標(biāo)細(xì)菌并提供大量Fc片段，引導(dǎo)PA-SERS特異性結(jié)合；該方法表現(xiàn)出快速、穩(wěn)定和易于操作的優(yōu)點(diǎn)，在食品安全檢測和傳染病診斷方面將有巨大的應(yīng)用潛力。

6 展望

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和人們對(duì)食品安全重視程度的提高，沙門氏菌快速檢測方法將會(huì)越來越多的應(yīng)用到食品安全檢測中，尤其是以適配體和可視化檢測為基礎(chǔ)的現(xiàn)場快速檢測方法，將在保障食品安全中有越來越廣闊的市場和應(yīng)用前景。