新化合物TG6對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的影響及機(jī)制研究

程晶晶，劉謀治，李洪嬌，閻瀾，姜遠(yuǎn)英，顏天華(.武警河南省總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，河南鄭州 50000;.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 0009;.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院，上海 00;.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 00)

·論著·

新化合物TG6對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的影響及機(jī)制研究

程晶晶1，劉謀治2，李洪嬌3，閻瀾4，姜遠(yuǎn)英4，顏天華2(1.武警河南省總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，河南鄭州 450000;2.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210009;3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院，上海 200433;4.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

目的研究TG6對(duì)心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法采用整體大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)實(shí)驗(yàn)，離體大鼠心臟低灌復(fù)灌實(shí)驗(yàn)和乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷(H/R)實(shí)驗(yàn)等模型，以血清CK、LDH、T-SOD、MDA等為指標(biāo)，研究TG6對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。結(jié)果在整體大鼠心肌缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中，TG6顯著減少I/R損傷后心肌梗死面積，減少血清中CK活力和MDA含量，減少LDH活力，增加T-SOD活力;在離體大鼠心臟低灌復(fù)灌實(shí)驗(yàn)中，TG6顯著增加低灌復(fù)灌后心肌冠脈流量，減少心肌組織中MDA含量和CK、LDH外漏，提高心肌組織中T-SOD活力;在乳鼠心肌細(xì)胞H/R損傷實(shí)驗(yàn)中，TG6對(duì)正常生長(zhǎng)條件下的細(xì)胞沒(méi)有明顯影響，提高Na2S2O4制備的心肌細(xì)胞H/R模型下細(xì)胞的存活率、降低細(xì)胞CK的釋放率及細(xì)胞［Ca2+］i的含量。結(jié)論 TG6對(duì)心肌I/R損傷有一定的保護(hù)作用。

鈉氫交換器抑制劑;心肌缺血/再灌注;冠脈結(jié)扎;離體心臟灌流;心肌細(xì)胞;缺氧/復(fù)氧

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指缺血期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞恢復(fù)血液供應(yīng)后產(chǎn)生更為嚴(yán)重的損傷，主要包括:炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血流障礙、心肌細(xì)胞壞死和凋亡所致的心肌梗死面積(MIS)擴(kuò)大等。隨著冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)(CABG)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)成形術(shù)(PTCA)、溶栓療法等血管再通術(shù)的迅速開(kāi)展，急性心肌梗死(AMI)再灌注治療出現(xiàn)了一個(gè)飛躍［1］。目前MIRI是阻礙缺血心肌從再灌注療法中獲得最佳療效的主要難題，如何減輕MIRI成為臨床上的新挑戰(zhàn)。

鈉氫交換器(Na+-H+exchanger，NHE)是一種在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均有表達(dá)的蛋白質(zhì)，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值，維持Na+和Ca2+穩(wěn)定方面起重要的調(diào)節(jié)作用［2］。目前，已經(jīng)有10種NHE亞型(NHE1～NHE10)被確認(rèn)［3］，其中NHE1在組織中普遍分布，尤其在心肌細(xì)胞中占絕大多數(shù)，因此NHE1在調(diào)節(jié)心肌功能方面起重要作用。在對(duì)心肌缺血再灌注損傷機(jī)制研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，心肌在缺血再灌注損傷時(shí)可激活NHE，進(jìn)而引起Na+-Ca2+交換，致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷，造成心肌細(xì)胞損傷。根據(jù)這種病理生理基礎(chǔ)研究提示，Na+-H+交換抑制劑(sodium hydrogen exchange inhibitor，NHEI)有可能為防止心肌細(xì)胞損傷提供新的治療方法［4］。

中國(guó)藥科大學(xué)新藥研究中心將卡立泊來(lái)德(cariporide)分子的有效基團(tuán)與曲美他嗪分子的有效基團(tuán)相結(jié)合，合成了一系列化合物。經(jīng)初步篩選，發(fā)現(xiàn)化合物TG6作用突出，經(jīng)查新證實(shí)為結(jié)構(gòu)新型的化合物(圖1)。

圖1 TG6化學(xué)結(jié)構(gòu)式

TG6分子可能兼具NHE1抑制劑和代謝類藥的特點(diǎn)，其作用機(jī)制可能與減輕氧自由基損傷、改善自由基清除系統(tǒng)平衡、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善心肌能量代謝、抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等有關(guān)，有望成為預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷的新藥。本研究旨在觀察TG6在缺血再灌注損傷保護(hù)方面的作用效果和機(jī)制，為其臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研發(fā)提供可靠的理論依據(jù)和思路。

1 材料和方法

1.1 藥品與材料TG6、卡立泊來(lái)德、鹽酸曲美他嗪均由中國(guó)藥科大學(xué)新藥研究中心提供;連二亞硫酸鈉(Na2S2O4·2H2O，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn));二甲亞砜(DMSO)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);肌酸激酶(CK)測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒、丙二醛測(cè)定(MDA)試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒、超微量Na+，K+-ATP酶測(cè)定試劑盒均由南京建成生物試劑有限公司生產(chǎn)。

SD大鼠，雄性，220～250 g(第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證:SCXK(滬)2007-0003)。

1.2 方法

1.2.1 TG6對(duì)冠脈結(jié)扎造成SD大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的影響大鼠用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，肢體導(dǎo)聯(lián)監(jiān)測(cè)心電圖，記錄正常心電圖。氣管插管，接動(dòng)物人工呼吸機(jī)進(jìn)行人工呼吸，左側(cè)第4肋間開(kāi)胸，剪開(kāi)心包暴露心肌，并用圓形無(wú)創(chuàng)縫合針5-0絲線置于左冠狀動(dòng)脈前降支起始部下2 mm處備用。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，以ECGⅡ?qū)?lián)ST段抬高或T波高聳、心肌顏色變暗紅色為結(jié)扎成功的標(biāo)志［5］。結(jié)扎45min后松開(kāi)結(jié)扎線再灌注90min。56只清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為7組(每組8只):模型組;假手術(shù)組(冠狀動(dòng)脈下只穿線不結(jié)扎，其余操作同模型組);卡立泊來(lái)德(1 mg/kg)組;曲美他嗪(5 mg/kg)組;TG6高劑量組(1 mg/kg)、中劑量組(0.5 mg/kg)、低劑量組(0.25 mg/kg)?？⒉磥?lái)德，曲美他嗪，TG6高、中、低劑量均在再灌注前5 min于尾靜脈給予。

1.2.2 TG6對(duì)大鼠離體心臟低灌/復(fù)灌損傷的影響80只清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為8組(n= 10):正常對(duì)照組，用改良K-H液以正常流速灌注80 min;模型組，平衡20 min后用改良K-H液低灌30 min，再?gòu)?fù)灌30 min;溶媒組，低灌液為含0.001%DMSO的改良K-H液，其余同模型組;曲美他嗪組，低灌液為含50μmol/L曲美他嗪的改良K-H液，其余同模型組;卡立泊來(lái)德組，低灌液為含10μmol/L卡立泊來(lái)德的改良K-H液，其余同模型組;TG6高、中、低劑量組，低灌液分別為含50、10、2μmol/L TG6的改良K-H液，其余均同模型組。實(shí)驗(yàn)前將大鼠脫頸處死，迅速開(kāi)胸，快速取下心臟放入改良的K-H緩沖液冰浴中洗凈殘血，迅速主動(dòng)脈插管懸掛心臟于改良的Langendorff灌流裝置上［5］，用改良的K-H緩沖液(以95%O2和5%CO2飽和)行主動(dòng)脈逆行灌流(速度5～7 ml/min)，溫度穩(wěn)定在37℃，然后依據(jù)各組別進(jìn)行處理。

1.2.3 TG6對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧損傷的影響體外培養(yǎng)原代乳鼠心肌細(xì)胞［7］，采用連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)引起的心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型來(lái)考察TG6對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷的影響［8］。TG6在復(fù)氧前給予，MTT法測(cè)定心肌細(xì)胞存活率，并測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中肌酸激酶(CK)含量以及細(xì)胞中Ca2+的含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉx±s表示。采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，單因素方差分析進(jìn)行組間顯著性比較，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TG6對(duì)冠脈結(jié)扎造成SD大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的影響

2.1.1 TG6對(duì)大鼠心肌梗死范圍的影響假手術(shù)組的心肌梗死區(qū)不明顯，而缺血再灌注模型組的心肌梗死范圍明顯(P＜0.01)。給藥組各組不同程度地減少了心肌梗死范圍，與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果顯示，TG6對(duì)冠脈結(jié)扎所致缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 TG6對(duì)缺血45m in后再灌注90 m in的大鼠心肌梗死范圍的影響(n=8，ˉx±s)

2.1.2 TG6對(duì)大鼠血清中CK、LDH、T-SOD活力及MDA含量的影響模型組血清中CK、LDH活力、MDA的含量明顯高于假手術(shù)組，T-SOD活力明顯低于假手術(shù)組，兩者相比有顯著性差異(P＜0.01)。TG6高劑量組血清中CK、LDH、T-SOD活力、MDA含量分別與卡立泊來(lái)德組、曲美他嗪組比較，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。TG6投給劑量越大，血清中CK、LDH活力和MDA含量越低，T-SOD活力越高。結(jié)果顯示，TG6具有抗氧化損傷、減少過(guò)氧化產(chǎn)物的作用，可減少缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞膜損傷。結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 TG6對(duì)缺血45m in后再灌注90 m in的大鼠血清中LDH、CK和SOD含量的影響(n=8，ˉx±s)

2.2 TG6對(duì)離體大鼠心臟低灌復(fù)灌的影響模型組復(fù)灌初和復(fù)灌末的冠脈流量明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。溶媒組與模型組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。各給藥組的復(fù)灌初和復(fù)灌末的冠脈流量都明顯高于模型組(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果顯示，TG6有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈的作用，見(jiàn)圖5。模型組心肌組織中的

圖4 TG6對(duì)缺血45m in后再灌注90 m in的大鼠血清中MDA含量的影響(n=8，ˉx±s)

圖5 TG 6對(duì)30 m in低灌后再?gòu)?fù)灌30 m in的離體大鼠心臟冠脈血流量的影響(n=8，ˉx±s)

CK、LDH、T-SOD活力明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，而MDA含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。溶媒組與模型組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。各給藥組心肌組織中的CK、LDH、T-SOD活力都明顯高于模型組(P＜0.05，P＜0.01)，而MDA含量低于模型組(P＜0.05，P＜0.01)。TG6高劑量組心肌組織中的CK、LDH、TSOD活力和MDA含量分別與曲美他嗪組和卡立泊來(lái)德組相比均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。結(jié)果進(jìn)一步提示，TG6對(duì)離體心臟的缺血再灌注損傷也有保護(hù)作用，見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 TG6對(duì)30 m in低灌后再?gòu)?fù)灌30m in的離體大鼠心臟中CK、LDH和T-SOD活性的影響(n=8，ˉx±s)

圖7 TG6對(duì)30 m in低灌后再?gòu)?fù)灌30m in的離體大鼠心臟中MDA含量的影響(n=8，ˉx±s)

2.3 TG6對(duì)Na2S2O4引起乳鼠心肌細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧損傷的影響與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞的存活率明顯下降(P＜0.01);同時(shí)細(xì)胞內(nèi)CK釋放率和Ca2+含量也顯著升高(P＜0.01)，均表明心肌細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷、活性下降。復(fù)氧前給予藥物孵育1 h后，與模型組比較，卡立泊來(lái)德組(10-4mol/L)和TG6高、中劑量組(10-4、10-5mol/L)均不同程度地改善了心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷，顯著提高了乳鼠心肌細(xì)胞的存活率，明顯降低了細(xì)胞內(nèi)CK的釋放率和Ca2+含量(P＜0.01，P＜0.05)。說(shuō)明TG6對(duì)Na2S2O4引起的缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1 再灌注前給予TG6對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響(n=6，ˉx±s)

表2 再灌注前給予TG6對(duì)Na2 S2O4損傷的乳鼠心肌細(xì)胞中Ca2+含量及CK釋放率的影響(n=6，ˉx±s)

3 結(jié)論

綜上所述，筆者通過(guò)整體大鼠冠脈結(jié)扎缺血及再灌注實(shí)驗(yàn)，首次發(fā)現(xiàn)TG6能減輕心肌缺血再灌注損傷，具有減少自由基損傷的作用;通過(guò)離體大鼠心臟低灌復(fù)灌實(shí)驗(yàn)，首次發(fā)現(xiàn)TG6改善心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制還與擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善心肌組織能量代謝有關(guān);通過(guò)乳鼠心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，首次發(fā)現(xiàn)TG6對(duì)心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷有保護(hù)作用，可以穩(wěn)定細(xì)胞膜、減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。結(jié)果顯示，TG6對(duì)心肌缺血再灌注具有顯著的保護(hù)作用。

［1］石燕燕，李樹(shù)青.心肌缺血再灌注損傷治療進(jìn)展［J］.中國(guó)心血管病研究，2007，5(10):777-779.

［2］胡若愚.鈉氫通道抑制劑在心臟缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2006，22(24):2931-2933.

［3］Lee SH，Kim T，Park ES，etal.NHE10，a novel osteoclast-specific member of the Na+-H+exchanger family，regulates osteoclast differentiation and survival［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，369(2):320-326.

［4］Kim JC，Woo SH.Role of Na+-H+exchange in themodulation of L-type Ca2+current during fluid pressure in rat ventricularmyocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，431(2):239-245.

［5］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:1042-1052.

［6］戴小燕，方秋娟.Langendorff離體心臟灌注模型的制備及應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，(13):2036-2039.

［7］司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)［M］.2版，世界圖書出版公司，2008:200-201.

［8］許蜀閩，王培勇，馬紅英，等.連二亞硫酸鈉在建立培養(yǎng)細(xì)胞的無(wú)氧環(huán)境中的應(yīng)用［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27(4): 359-360.

［9］張新寧，呂琪，張永亮，等.大鼠心肌缺血再灌注模型建立方法的改進(jìn)［J］.武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，17(11):941-943.

［10］周燕.心肌損傷標(biāo)志物的研究進(jìn)展與心肌梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)［J］.臨床醫(yī)學(xué)，2009，22(12):2860-2862.

［11］Zhu X，Zuo L.Characterization of oxygen radical formation mechanism at early cardiac ischemia［J］.Cell Death Dis，2013，4:e787.

［12］趙芳，徐立，許立.參附注射液對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(1):17-19.

［13］王麗艷，劉艷，李丹露，等.膽堿對(duì)離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(5):600-603.

［14］許蜀閩，王培勇，馬紅英，等.連二亞硫酸鈉在建立培養(yǎng)細(xì)胞的無(wú)氧環(huán)境中的應(yīng)用［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27(4): 359-360.

［15］Shintani-Ishida K，Inui M，Yoshida K.Ischemia-reperfusion inducesmyocardial infarction through mitochondrial Ca2+overload［J］.JMol Cell Cardiol，2012，(53):233-239.

Effects and mechanism of TG6 on m yocardial ischem ia and reperfusion injury

CHENG Jingjing1，LIU Mouzhi2，LIHongjiao3，YAN Lan4，JIANG Yuanying4，YAN Tianhua2(1.Department of Pharmacy，Henan People＇s Armed Police Corps Hospital，Zhengzhou 450000，China;2.School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China;3.Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University，Shanghai 200433，China;4.School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai200433，China)

Objective Toinvestigate the protective effects and mechanism of TG6 onmyocardial ischemia/reperfusion injury.Methodsthe protective effects of TG6 on myocardial ischemia/reperfusion was investigated by setting up models of ischemia and reperfusion of rats induced by ligating the left coronary anterior descending artery in vivo，isolated rathearts through an improved Langendorff device，and hypoxia/reoxygenation injury of neonatal rat cardiomyocytes，and the serum CK，LDH，T-SOD，MDA were taken as research markers.ResultsTG6 significantly reduced themyocardial infarct size，decreased the activity of CK and the content of MDA in serum，reduced the activity of LDH，and increased the activity of T-SOD in vivo;TG6 obviously increased the coronary blood flow after low rate perfusion and reperfusion，decreased the contentofMDA and the leakage of CK，LDH inmyocardial tissue，elevated the activity of T-SOD in vitro of isolated rat hearts;TG6 had no effects on cells in normal growth condition，raised the viability of cardiomyocytes significantly，and reduced the rate of CK leakage and the content of［Ca2+］iobviously in Na2S2O4treated cells in vitro of neonatal rat cardiomyocytes.ConclusionTG6 could effectively protectmyocardial ischemia/reperfusion injury.

NHEI;myocardial ischemia/reperfusion;coronary artery ligation;isolated heart perfusion;cardiomyocyte;H/R

R541.6 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［文章編號(hào)］1006-0111(2014)06-0440-04

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.010

2013-10-09

2014-03-19［本文編輯］李睿旻

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09103101-069).［作者簡(jiǎn)介］程晶晶，藥師.Tel:18625598588，E-mail:jinganswer_890721 @126.com.

顏天華.E-mail:yth0001@126.com.