用在體皮膚微透析法研究黃芩苷凝膠經大鼠皮膚吸收的局部藥動學

婁月芬，朱全剛，尤本明，李潔，顧小燕，張若曦(.上海市第一人民醫(yī)院分院藥劑科，上海 0008;.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院藥學部，上海 0047;.第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院藥學部，上海 004)

·論著·

用在體皮膚微透析法研究黃芩苷凝膠經大鼠皮膚吸收的局部藥動學

婁月芬1，朱全剛2，3，尤本明3，李潔3，顧小燕2，張若曦2(1.上海市第一人民醫(yī)院分院藥劑科，上海 200081;2.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院藥學部，上海 200437;3.第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院藥學部，上海 200433)

目的建立大鼠在體皮膚微透析技術，研究黃芩苷凝膠經皮吸收局部藥動學。方法采用HPLC-MS/MS聯用技術測定大鼠皮膚微透析液中黃芩苷的濃度。SD大鼠在麻醉狀態(tài)下做皮膚微透析預處理，然后將黃芩苷凝膠涂于探針所在皮膚表面，收集皮膚微透析液樣品進行黃芩苷濃度測定，繪制黃芩苷濃度-時間曲線，計算經皮吸收局部藥動學參數。結果用于定量分析的離子對為m/z447.3→271.2，黃芩苷在檢測濃度范圍內線性關系良好，色譜的專屬性、精密度等測定結果均符合生物樣品測定要求。體內皮下探針對黃芩苷的回收率為(24.40±0.91)%，240 min內各取樣點回收率保持穩(wěn)定;黃芩苷經皮給藥后8 h內微透析液中均可檢測到黃芩苷的存在，且藥物在皮膚組織內濃度持續(xù)升高，AUC0-t為(50.04±34.17)(mg·min)/L。結論

黃芩苷凝膠;微透析;經皮吸收局部藥動學;大鼠

三黃膏是目前臨床常用于瘡瘍初起、紅腫熱痛及輕度燙傷等癥的外用復方中藥制劑，由黃柏、黃芩、黃連及梔子與適宜基質組成，具有清熱解毒、消腫止痛之功效。其中，黃芩是一味非常重要的中藥，其主要成分黃芩苷具有良好的抗炎、抗菌、抗病毒、抗變態(tài)反應等藥理活性［1］。在體皮膚微透析技術可以對實驗動物或人體皮膚組織進行在體、連續(xù)的藥物濃度測定，現已廣泛用于外用制劑的在體經皮吸收動力學研究［2］。為進一步研究三黃膏經皮給藥的體內過程，本研究將其主要活性成分黃芩苷制成外用凝膠，用在體皮膚微透析法研究黃芩苷經大鼠皮膚吸收的局部藥動學。

1 材料

1.1 藥物和試劑黃芩苷對照品(純度98%，中國藥品生物制品檢定所，批號110715-201016);甲醇(色譜純，美國Merck公司);蒸餾水(第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院藥學部);Veet脫毛膏(法國Veet公司);其他試劑均為分析純。

1.2 儀器W201型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司);PHS-3TC精密酸度計(上海天達儀器有限公司);DSHZ300多用途恒溫水浴振蕩器(江蘇省太倉市實驗設備廠);FA-2004萬分之一電子天平(上海天平儀器廠);十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)。MD1001灌注器推進泵、MD-1020-K四聯流量控制器和容量為1 ml的灌注器(美國BAS公司);線性探針(膜長30 cm)。90-1型磁力攪拌器(上海振榮科學儀器有限公司)。G 6410A HPLCMS/MS聯用儀(配有三重四級桿LC-MS系統(tǒng)、G1311四元泵、G1322真空泵、G1329A自動進樣器和G1316A柱溫箱，美國安捷倫公司)。

1.3 實驗動物雄性SD大鼠，體重約200 g，由第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號: SCXK(滬)2007-0003。

2 方法和結果

2.1 色譜條件XTerraR MS C18色譜柱(2.1mm× 150 mm，5μm，美國Waters公司);流動相:甲醇∶水(含2 mmol/L甲酸銨，用甲酸調節(jié)pH至3.5)= 85∶15;流速:0.4 ml/min;柱溫:35℃;進樣量:1μl。

圖1 黃芩苷的的總離子流色譜圖

2.2 質譜條件離子源為電噴霧電離源(ESI)，正離子掃描方式及多離子反應方式(MRM)檢測;干燥氣(N2)溫度為350℃，流速為10 L/min;毛細管電壓為4 000 V;霧化壓力為40 psi，裂解電壓為122 V;檢測時間3 min。在一級全掃描質譜圖中獲得黃芩苷的準分子離子峰為m/z447.3，選擇性對其進行二級質譜分析，得到主要碎片離子為m/z 271.2，儀器自動優(yōu)化相對碰撞能量為21 eV。將上述離子對用于定量分析。

2.3 微透析介質的配制分別稱取無水枸櫞酸0.73 g，二水枸櫞酸鈉2.2 g，無水葡萄糖2.45 g，依地酸二鈉0.4 g，半胱氨酸0.2 g，溶解于蒸餾水中，定容至1 000 ml，用0.45μm的水系微孔濾膜過濾，即得微透析介質(pH 3.95)。

圖2 黃芩苷的質譜圖

2.4 系列濃度對照品溶液的配制精密稱取適量黃芩苷對照品置于100 ml容量瓶中，用微透析介質溶解并稀釋至刻度，配制成10μg/ml的黃芩苷儲備液。依次精密量取該儲備液適量，置于10 ml容量瓶中，用微透析介質稀釋至刻度，搖勻，配制成2、5、10、20、50、100、200 ng/ml的系列濃度對照品溶液。

2.5 標準曲線的制備及方法學考察

2.5.1 標準曲線的制備精密量取系列濃度對照品溶液各1μl，分別進樣測定，以黃芩苷對照品的峰面積Y對相應的濃度X(ng/ml)進行線性回歸，得微透析樣品標準曲線，回歸方程為Y=14.11X-8.85(r =0.999 7)，線性范圍為2～200 ng/ml。

2.5.2 方法專屬性分別取大鼠腹部皮膚給予空白凝膠2 h、黃芩苷凝膠2 h后的皮下微透析樣品進行HPLC-MS/MS分析，結果表明，空白凝膠給藥后皮下微透析樣品未見待測物本底以及其他干擾物質影響黃芩苷的測定。

2.5.3 精密度試驗分別量取低(2ng/ml)、中(20 ng/ml)、高(200 ng/ml)3種濃度的對照品溶液，在1 d內測定黃芩苷濃度5次，得日內RSD分別為2.22%、0.26%、0.28%(n=5);連續(xù)進樣3 d，得日間RSD分別為3.17%、1.20%、2.08%(n=5)，表明精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗采用微透析介質分別配制低(1μg/ml)、中(4μg/ml)、高(10μg/ml)3種濃度的對照品溶液，置于37℃水浴中加熱24 h，適當稀釋后進樣測定，結果分別相當于配制濃度的103.88%、97.39%、97.98%，表明黃芩苷在透析及樣品測定過程中穩(wěn)定性好。

2.6 黃芩苷凝膠處方及制作方法

2.6.1 處方黃芩苷2 g，羥丙甲纖維素(HPMC E3-2V)10 g，聚乙二醇400(PEG 400)5 g，甘油20g，氮酮5 g，無水枸櫞酸0.073 g，二水枸櫞酸鈉0.22 g，蒸餾水加至總量100 g。

2.6.2 制作方法取無水枸櫞酸、二水枸櫞酸鈉溶于適量蒸餾水中，加入羥丙甲纖維素溶脹，備用;另取聚乙二醇、甘油、氮酮，加入黃芩苷，充分攪拌混勻得黃芩苷溶液，將此加入前述羥丙甲纖維素溶液，用蒸餾水補足至100 g，攪勻，即得凝膠。

2.7 實驗動物處理取SD大鼠，體重約200 g，實驗前1 d用脫毛膏去除腹部毛。實驗前用25%烏拉坦溶液3 ml/kg腹腔注射麻醉動物，將大鼠腹部朝上固定于保溫墊上，使其體溫維持在37.5℃左右。將2根線性微透析探針(膜長30mm，截留相對分子質量5 000)用18G穿刺針引導平行植入皮下后(間隔2 cm)，引導針抽回而微透析探針膜管留于大鼠皮下組織中，將探針連接于微透析裝置。

2.8 大鼠體內黃芩苷回收率測定以微透析介質配制濃度為4μg/ml(Cperf)的黃芩苷灌流液，2只SD大鼠分別植入2根探針，灌注速度3μl/min，平衡90 min后，每20 min收集一次透析液，各收集12個樣品，用HPLC-MS/MS測定藥物濃度(Cdial)。根據公式［2］Rdial=(Cperf-Cdial)/Cperf計算黃芩苷的體內回收率為(24.40±0.91)%(n=4)，240 min內各取樣點回收率保持穩(wěn)定。

2.9 黃芩苷凝膠經皮吸收局部的藥動學過程采用4只SD大鼠建立微透析系統(tǒng)，每只大鼠植入2根探針，用不含藥物的微透析介質灌注探針90 min后，在透析窗正上方局部皮膚用2%黃芩苷凝膠1 g包封，平衡40min后，每隔20min收集1次透析液，收集8 h，用HPLC-MS/MS測定藥物濃度(Cdial)，所測濃度經回收率校正后即為皮下組織中藥物濃度(Ctiss=Cdial/Rdial)。該凝膠經皮給藥后40 min至8 h內微透析液中均可檢測到黃芩苷的存在，且藥物在皮膚組織內濃度持續(xù)升高，AUC0-t為(50.04±34.17)(mg·min)/L。

圖3 黃芩苷凝膠給藥的大鼠皮膚藥物濃度-時間曲線(n=8)

3 討論

在體皮膚微透析樣品體積小，所含藥物濃度低，因此對分析方法的靈敏度要求很高。HPLC-MS/MS法具有高效、快速、靈敏度高、特異性強等特點，因而廣泛應用于在體皮膚微透析樣品的分析。探針植入皮下所造成的創(chuàng)傷十分輕微，但亦可產生紅斑、引起組織中小分子物質濃度和組織血液灌流量的改變，從而影響研究結果。因此在探針植入后到局部給藥前需有一段平衡時間，通常為60～90 min［2］。

在微透析取樣方法中，探針回收率的準確校正是獲得組織液內真實藥物濃度的關鍵。李潔等［3］在前期研究中已采用微透析聯用HPLC法測定透析液中黃芩苷的濃度，結果表明，隨著流速增加，回收率降低，并且增量法和減量法測得的回收率隨流速的變化趨勢相對一致。用不同濃度的灌流液，黃芩苷回收率差異很小，表明灌流液濃度對黃芩苷的回收率幾乎沒有影響。在灌流液速度相同的實驗條件下，增量法和減量法測定結果比較一致，即黃芩苷通過微透析膜不存在擴散方向依賴性。因此，本研究將微透析技術應用到黃芩苷的皮膚藥動學研究時，采用減量法測定黃芩苷的體內探針回收率。

黃芩苷的穩(wěn)定性受溫度、pH值等多種因素影響，其穩(wěn)定pH值范圍為3～4［4］。本研究未采用李潔等研究中選擇的PBS(pH 5.5)作為體內微透析的灌流介質。究其原因，在體內探針回收率研究過程中發(fā)現，在pH 5.5條件下，由于SD大鼠皮下生理條件的影響，微透析液中黃芩苷濃度很低，難以準確檢測。在參考有關文獻［5］的基礎上，采用改良的枸櫞酸葡萄糖抗凝溶液(anticoagulant citrate dextrose)作為微透析介質，內含有3.5 mmol/L枸櫞酸、7.5 mmol/L枸櫞酸鈉、136.0 mmol/L葡萄糖及抗氧化劑0.02%半胱氨酸和0.04%依地酸二鈉，此溶液中黃芩苷的穩(wěn)定性滿足分析要求，且在大鼠體內的探針回收率亦穩(wěn)定。

從黃芩苷凝膠經皮給藥局部藥動學過程可以看出，黃芩苷能夠較迅速透過皮膚，在實驗的8 h內濃度持續(xù)增加，尚未達到最高濃度，下一步的研究中將延長實驗時間。在實驗過程中發(fā)現，黃芩苷凝膠的皮下濃度在各個探針和大鼠之間存在差異，其原因可能是各大鼠對藥物的皮膚屏障作用以及皮膚代謝作用不一致，而非微透析技術自身缺陷所造成的。本研究成功建立了HPLC-MS/MS法檢測大鼠皮下微透析樣品中黃芩苷的含量，并考察了黃芩苷凝膠給藥后皮膚局部組織的藥動學過程，表明在體皮膚微透析法可用于黃芩苷經皮吸收局部藥動學研究。

【參考文獻】

［1］王雷，王學艷，周雪琴，等.黃芩苷凝膠設計與體外透皮性能的研究［J］.中草藥，2008，39(10):1502-1504.

［2］陳芳，胡晉紅，朱全剛.用微透析法測定氫溴酸東茛菪堿凝膠經皮給藥大鼠體內藥動學研究［J］.藥學服務與研究，2012，12(4):270-273.

［3］李潔，朱全剛，尤本明，等.采用微透析聯用HPLC法測定透析液中黃芩苷的濃度［J］.藥學服務與研究，2012，12(1): 73-74.

［4］Xing J，Chen X，Zhong D.Stability of baicalin in biological fluids in vitro［J］.J Pharm Biomed Anal，2005，39(3-4):593-600.

［5］Huang H，Zhang Y，Yang R，et al.Determination of baicalin in rat cerebrospinal fluid and blood usingmicrodialysis coupled with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2008，874(1-2):77-83.

Study on local pharmacokinetics of baicalin gel after transdermal adm inistration in rats by skin m icrodialysis in vivo

LOU Yuefen1，ZHU Quangang2，3，YOU Benming3，LI Jie3，GU Xiaoyan2，ZHANG Ruoxi2(1.Department of Pharmacy，Branch of Shanghai First People＇s Hospital，Shanghai 200081，China;2.Department of Pharmacy，Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai200437，China;3.Department of Pharmacy，Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

Objective Todevelop a novel skin microdialysis technology in vivo，and to determine the pharmacokinetic of baicalin after transdermaladministration in rats.MethodsAn HPLC-MS/MSmethod used for the determination of baicalin in skinmicrodialysis sampleswas established，SD ratswere pretreated with skin microdialysis operation under anesthesia，and then the baicalin gel was applied to the skin surface of probe in vivo.The baicalin concentration of skin microdialysates was determined，the time curve of baicalin concentration was drawn and the topical pharmacokinetics parameters of percutaneous absorption was calculated.ResultsBaicalin was optimized at the transitions m/z447.3→271.2.The linearity correlation was good and the assay exhibited good precision and accuracy.The subcutaneous probe recovery of baicalin in vivo was(24.40±0.91)%and was stable over the 240 min study period.Baicalin could be detected in the microdialysis samples after transdermal administration，and its concentration continued to rise in 8 h. AUC0-t in skin tissue was(50.04±34.17)mg·min·L-1.Conclusion Themethod of skin microdialysis in vivo could be used in the local pharmacokinetic research of baicalin.

baicalin gel;microdialysis;dermatopharmacokinetics;rat

R932，R943.43 ［< class="emphasis_bold">文獻標志碼］A

A

1006-0111(2014)06-0444-04< class="emphasis_bold">［DOI］ 1

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.011

2014-01-02

2014-09-03［本文編輯］陳靜［收稿日期］2013-06-07［修回日期］2013-12-20［本文編輯］李睿旻

上海市衛(wèi)生局課題(20114061);上海市教委預算內項目(2013JW51);上海市藥理學會皮膚藥理學專業(yè)委員會基金(No. 201302).

婁月芬，碩士，副主任藥師.E-mail:louyuefen@sina.cn.

朱全剛，博士，副主任藥師.E-mail:qgzhu@126.com.

在體皮膚微透析法可用于黃芩苷經皮吸收局部藥動學研究。