鹽度對天津厚蟹Na+/K+-ATPase、GDH 酶活性及GDH 基因表達(dá)的影響

左迪，馬長安，吳東蕾，張?jiān)骑w

（1.上海城建職業(yè)學(xué)院健康與社會(huì)關(guān)懷學(xué)院，上海 201415；2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201403；3.上?？萍拣^，上海自然博物館自然史研究中心，上海 200041）

甲殼動(dòng)物是長江口大型底棲動(dòng)物的主要類群之一[1]。河口區(qū)域?yàn)榧讱?dòng)物提供棲息地，為一系列生命活動(dòng)提供環(huán)境場所，但河口區(qū)域的環(huán)境因子變化較大，尤其是鹽度，會(huì)隨著漲落潮和四季交替而明顯變化[2]。河口甲殼動(dòng)物通過滲透壓調(diào)節(jié)保障機(jī)體正常的生理活性，引人關(guān)注。天津厚蟹（Helice tientsinensis Rathbun）是長江口崇明東灘大型底棲動(dòng)物的獨(dú)特優(yōu)勢種和東灘保護(hù)區(qū)內(nèi)候鳥的主要食物來源。附近村民常用落缸、鉤蜞等方式捕捉天津厚蟹，進(jìn)行販賣或者制成醉蟹自用[3]。南匯東灘新圍墾大堤使堤壩內(nèi)被圍潮灘與自然潮灘間的生境聯(lián)系被切斷，導(dǎo)致使被圍潮灘內(nèi)鹽度淡化。而鹽度是蝦蟹類甲殼動(dòng)物生長發(fā)育的重要因子[4]，直接影響蝦蟹類的生長、攝食、滲透壓調(diào)節(jié)和成活等生理功能[5]。

鹽度影響滲透壓調(diào)節(jié)的研究多涉及擬穴青蟹（Scylla paramamosain）[6]、鋸緣青蟹（Scylla serrata）[7]、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）[8]、三疣梭子蟹（portunus trituberculatus）[9,10]、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[11,12]和南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）[13]等經(jīng)濟(jì)蝦蟹，灘涂鹽度變化對天津厚蟹滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)酶活力及谷氨酸脫氫酶（GDH）基因的表達(dá)尚未見報(bào)道。本文采用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬崇明東灘圍墾后的鹽度淡化，探究鹽度變化對天津厚蟹滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)酶及基因表達(dá)的影響，為蝦蟹類甲殼動(dòng)物滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，促進(jìn)對甲殼動(dòng)物生理生態(tài)的研究，也為后期長江口大型底棲動(dòng)物的生態(tài)修復(fù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用蟹采自上海市崇明島東灘基地，選取頭胸甲（長）（22.78±1.53）mm，頭胸甲（寬）（25.56±1.42）mm，濕體質(zhì)量（9.91±2.01）g，肢體完整的成蟹至于養(yǎng)殖箱（長×寬×高=1 m×0.5 m×0.5 m）中用于正式試驗(yàn)，養(yǎng)殖期間水溫25～26℃左右，溶氧量高于6 mg/L，光周期14 L∶10 D，每天定時(shí)投喂中華園田螺（Cipangopal udina chinensis）螺肉（投喂量為蟹體質(zhì)量的3%，根據(jù)天津厚蟹攝食量及飼料殘留情況及時(shí)調(diào)整投喂量，水體底部放置PVC 管及瓦片，防止個(gè)體間殘食，及時(shí)吸除剩余餌料及糞便等，隔天換水1/3 左右，持續(xù)充氧。鹽度調(diào)節(jié)所需海水晶購自上海市銅川路水產(chǎn)市場。

1.2 方法

試驗(yàn)設(shè)6 個(gè)鹽度梯度，低鹽脅迫組（0、2、4）、高鹽脅迫組（16、32）和對照組（8），每組三個(gè)平行，每平行試驗(yàn)選用健康的天津厚蟹14 只，共計(jì)用蟹252只。

1.2.1 樣品處理

分別于0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h，冰浴麻醉30 min 后取蟹肌肉和鰓組織，每試驗(yàn)組取6 只蟹。將組織置于1.5 mL 無RNA 酶離心管后，迅速放入液氮中，-80℃保存，用于相關(guān)酶活性的測定以及GDH 基因在鹽度脅迫下的定量表達(dá)。

冰浴麻醉30 min 后，取對照組天津厚蟹各組織用于GDH 基因的克隆和Real-Time 中組織的特異性表達(dá)。

1.2.2 樣品測定

用超微量Na+/K+-ATPase 試劑盒測定該酶的活性。ATPase 活力定義為：每h 每mg 組織蛋白的組織中ATP 酶分解ATP 產(chǎn)生1 μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)ATP 酶活力單位。GDH 活性的測定采用南京建成生物工程研究所GDH 試劑盒，使用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。GDH 中免疫復(fù)合物顏色的深淺與樣品中GDH 的濃度呈正相關(guān)。

1.3 GDH 基因全長的克隆和表達(dá)分析

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank 中其他蝦蟹類GDH 基因序列：中華絨螯蟹（JN628041）、擬穴青蟹（KM189809）、中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis，KF781120）、凡納濱對蝦（AM076955）、家蠶（Bombyx mori，DQ311359）等序列設(shè)計(jì)簡并引物GDH-F 和GDH-R；根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)RACE 特異性引物G-3'F 和G-5'R；根據(jù)天津厚蟹GDH 基因全長cDNA 序列設(shè)計(jì)Real-Time PCR 引物RT-GF 和RT-GR（表1）。

表1 GDH 基因所用引物序列Tab.1 Primers used in GDH gene

1.3.2 GDH 基因的克隆

根據(jù)已獲得的天津厚蟹GDH 基因片段設(shè)計(jì)特異性引物G-3' 和G-5'，用于3' RACE 和5' RACE的擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃3 min（預(yù)變性）；94℃30 s（變性）；64℃30 s（退火），72℃1 min（延伸），30 個(gè)循環(huán)后；72℃10 min（延伸）；4℃保存。采用SMARTTMRACE cDNA 試劑盒（Clontech）克隆cDNA的全長。

1.3.3 GHD 基因的表達(dá)

根據(jù)已知GDH 全長cDNA 設(shè)計(jì)特異性引物，以天津厚蟹β-actin 為內(nèi)參基因，采用熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）進(jìn)行Real-Time PCR 反應(yīng)，反應(yīng)采用qRT-PCR 循環(huán)（兩步法），條件為：95℃2 min（預(yù)變性）；95℃15 s（變性），58℃30 s（退火），40 個(gè)循環(huán)，每樣品設(shè)3 次重復(fù)。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用BlastX（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行同源性比對和相似性搜索；ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）分析開放閱讀框并預(yù)測氨基酸序列；SMART 4.0（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白結(jié)構(gòu)域；N-J 法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用One-Way ANOVA 法進(jìn)行分析，若存在顯著差異，再采用Duncan 檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)以平均值（Mean,M）±標(biāo)準(zhǔn)差（Standard deviation,SD）表示，采用2-△△Ct法分析qRT-PCR 結(jié)果[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 天津厚蟹GDH 全基因序列分析

2.1.1 天津厚蟹GDH 序列特征分析

天津厚蟹cDNA 全長為2 105 bp（GenBank 登錄號(hào)：KJ649743），含有1 641 bp 的完整開放閱讀框（ORF），編碼546 個(gè)氨基酸。蛋白相對分子量（Mw）為60.54 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）6.48。該蛋白氨基酸組成中，甘氨酸（Gly,G）含量最高，占比9.5%，其次為丙氨酸（Ala,A）、谷氨酸（Glu,E）和異亮氨酸（Ile,I），占比分別為7.9%、7.1%和6.8%，除吡咯賴氨酸（Pyl,O）和硒半胱氨酸（Sec,U）占比為0 外，色氨酸（Trp,W）和半胱氨酸（Cys,C）占比最低，為1.1%和1.5%。該蛋白包含一個(gè)信號(hào)肽，成熟肽527 個(gè)氨基酸，包含一個(gè)活性部位、兩個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)、兩個(gè)ATP 結(jié)合位點(diǎn)、三個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、四個(gè)GDP 結(jié)合位點(diǎn)和四個(gè)NAD（P）結(jié)合位點(diǎn)（圖1）。

圖1 天津厚蟹GDH 基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 GDH gene sequence and deduced amino acid sequence in mudflat crab mudflat crab Helice tientsinensis

2.1.2 天津厚蟹GDH 基因進(jìn)化樹構(gòu)建

氨基酸序列的BLAST 比對（圖2）結(jié)果顯示，其與多個(gè)物種的GDH 蛋白序列有較高的相似性，相似率在65%以上，同源性最高的為中華絨螯蟹，其次為擬穴青蟹和中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）。

圖2 天津厚蟹GDH 氨基酸序列與其他物種GDH氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of GDH amino acid sequence of mudflat crab Helice tientsinensis with that of other species

利用MEGA4.0 軟件分析選取的17 條相似度較高的序列進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，天津厚蟹首先與中華絨螯蟹聚為一支；其次與擬穴青蟹，凡納濱對蝦、中國明對蝦聚為一支，旋毛蟲（Trichinella spiralis）和環(huán)紋背帶線蟲（Teladorsagia circumcincta）與天津厚蟹的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而單獨(dú)聚成一支。

圖3 NJ 法構(gòu)建GDH 基因進(jìn)化樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree of GDH gene

2.2 天津厚蟹各組織中GDH 基因的表達(dá)

天津厚蟹GDH 基因在各組織中的表達(dá)結(jié)果：肌肉中GDH 基因表達(dá)量最高，其次為鰓，與其他組織差異顯著（P＜0.05）；GDH 基因在肝胰腺中表達(dá)量降低，極顯著低于肌肉組織（P＜0.01）（圖4）。

圖4 GDH 基因在天津厚蟹不同組織中的表達(dá)量Fig.4 Expression level of GDH gene in different tissues of mudflat crab Helice tientsinensis

2.3 鹽度脅迫對天津厚蟹GDH 基因表達(dá)量的影響

天津厚蟹GDH 基因在不同鹽度下的相對表達(dá)量差異表明，低鹽的0、2 和4 鹽度組24 h 內(nèi)，鹽度越低表達(dá)量越高，至96 h 鹽度越低表達(dá)量越低，0和2 鹽度組GDH 基因表達(dá)量極顯著低于對照組（P＜0.01）（圖5）。

圖5 鹽度對天津厚蟹肌肉組織GDH 基因表達(dá)量的影響Fig.5 Effect of salinity on GDH gene expression level in muscle tissue of mudflat crab Helice tientsinensis

高鹽組中，基本鹽度越高天津厚蟹GDH 基因表達(dá)量越低，至96 h，16 鹽度組基因表達(dá)量顯著高于0、2、8、32 鹽度組（P＜0.05），隨著鹽度脅迫時(shí)間的增加，32 鹽度組基因表達(dá)量降低，至96 h GDH 基因表達(dá)量顯著低于對照組（P＜0.05）。

2.4 鹽度對天津厚蟹滲透壓相關(guān)酶活性的影響

2.4.1 鹽度對天津厚蟹GDH 活性的影響

天津厚蟹鰓GDH 活性變化如圖6 所示。低鹽組，鹽度越低GDH 活性越高，顯著高于對照組（P＜0.05），至96 h，0、2 鹽度組酶活性顯著低于對照組（P＜0.05），4 鹽度組GDH 活性與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

圖6 鹽度脅迫對天津厚蟹鰓GDH 活性的影響Fig.6 Effects of salinity stress on GDH activity in gill of mudflat crab Helice tientsinensis

試驗(yàn)中，48 h 內(nèi)，對照組及高鹽脅迫組酶活性保持在較穩(wěn)定水平，各組之間差異不顯著，至96 h，16 鹽度組GDH 活性升高，顯著高于對照組和其他鹽度組（P＜0.05）；32 鹽度組GDH 活性降低，酶活性高于0 鹽度組，但低于對照組，差異顯著（P＜0.05）。

由圖7 可知，低鹽脅迫（0、2、4）組中天津厚蟹肌肉組織中GDH 活性變化明顯，72 h 內(nèi)，鹽度越低酶活性越高。0 和2 鹽度組酶活性至48 h 達(dá)最大值，極顯著高于對照組和其他鹽度組（P＜0.01），至96 h，低鹽脅迫組GDH 活性隨鹽度的降低而顯著降低，酶活性均小于對照組，各組之間差異顯著（P＜0.05）。6 h 后，高鹽組鹽度越高GDH 酶活性越低。96 h 內(nèi)，16 鹽度組酶活性呈現(xiàn)先升高在降低的趨勢，至96 h 酶活性極顯著高于對照組和其他鹽度組（P＜0.01）；32 鹽度組GDH 活性保持在較穩(wěn)定水平，至96 h，酶活性略低于對照組，差異不顯著（P＞0.05）。

圖7 鹽度脅迫對天津厚蟹肌肉GDH 活性的影響Fig.7 Effects of salinity stress on GDH activity in muscle of mudflat crab Helice tientsinensis

2.4.2 鹽度對天津厚蟹Na+/K+-ATPase 活性的影響

由圖8 可知，96 h 時(shí)，低鹽脅迫組（0、2、4）中，鹽度越低天津厚蟹鰓Na+/K+-ATPase 酶活性越高，48 h 0 和2 鹽度組Na+/K+-ATPase 酶活性達(dá)最大，與對照組差異極顯著（P＜0.01）；4 鹽度組Na+/K+-ATPase 酶活性24 h 達(dá)最大值，極顯著高于對照組（P＜0.01），隨后酶活性降低，至96 h Na+/K+-ATPase 酶活性略低于對照組，差異不顯著（P＞0.05）。

圖8 鹽度脅迫對天津厚蟹鰓Na+/K+-ATPase 酶活性的影響Fig.8 Effects of salinity stress on Na+/K+-ATPase activity in gill of mudflat crab Helice tientsinensis

高鹽組（16、32），鹽度越高酶活性越低，16 鹽度組酶活性高于32 鹽度組，6～72 h 高鹽組酶活性顯著低于低鹽度組，差異顯著（P＜0.05）；24 h 后16、32鹽度組組Na+/K+-ATPase 酶活性持續(xù)降低，至96 h酶活性均高于0、2 鹽度組，但顯著低于對照組（P＜0.05）。

鹽度對肌肉組織中Na+/K+-ATPase 活性的影響較小（圖9），僅12～48 h 內(nèi)，酶活性與對照組相比差異顯著（P＜0.05），但各組之間差異不顯著（P＞0.05）。在低鹽脅迫（0、2、4）中，0～48 h，鹽度越低Na+/K+-ATPase 酶活性越高，至96 h，低鹽組Na+/K+-ATPase 酶活性顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖9 鹽度脅迫對天津厚蟹肌肉Na+/K+-ATPase 酶活的影響Fig.9 Effects of salinity stress on Na+/K+-ATPase activity in muscle of mudflat crab Helice tientsinensis

高鹽脅迫組（16、32）中，鹽度越高Na+/K+-ATPase 活性越低，其中32 鹽度組酶活性變化范圍較小，基本呈持續(xù)降低趨勢，至96 h，16 鹽度組酶活性降低與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于0 和2 鹽度組，32 鹽度組酶活性降低，顯著低于對照組（P＜0.05）。

3 討論

水體鹽度是影響蝦蟹類甲殼動(dòng)物生理狀態(tài)的重要指標(biāo)，而鹽度的變化直接影響蝦蟹類機(jī)體的滲透壓調(diào)節(jié)[15,16]。

天津厚蟹生活于廣鹽性的潮間帶，當(dāng)外界鹽度發(fā)生變化時(shí)，機(jī)體通過主動(dòng)調(diào)節(jié)來維持滲透壓的穩(wěn)定，這也與其生活習(xí)性相一致[17]。水中鹽度的變化與Na+/K+-ATPase 酶活力變化密切相關(guān)[18]，同時(shí)GDH在甲殼動(dòng)物滲透壓調(diào)節(jié)中起重要作用[19]。

GDH 在甲殼動(dòng)物脯氨酸和丙氨酸等游離氨基酸合成代謝中具有十分重要的作用[20]，而脯氨酸和丙氨酸又是甲殼動(dòng)物滲透壓調(diào)節(jié)中的重要角色[21]。天津厚蟹GDH基因在肌肉組織中表達(dá)量最高，可能與肌肉組織的成分或肌肉組織是機(jī)體重要的氨基酸庫有關(guān)[22,23]。鹽度脅迫后天津厚蟹GDH 酶活性及GDH 基因表達(dá)量均有不同程度的上升，酶活性的增強(qiáng)促使游離氨基酸，如丙氨酸和脯氨酸的合成，刺激機(jī)體主動(dòng)調(diào)節(jié)滲透壓平衡，滿足了天津厚蟹滲透壓調(diào)節(jié)的需要。基因表達(dá)量的變化表明，GDH 可能參與天津厚蟹的滲透壓調(diào)節(jié)。至96 h，低鹽脅迫下天津厚蟹GDH 酶活性及GDH 基因表達(dá)量低于高鹽脅迫組，可能會(huì)影響游離氨基酸的合成，一定程度上影響天津厚蟹的滲透壓調(diào)節(jié)；高鹽組中16 鹽度組基因表達(dá)量高于對照組，32 鹽度組略低于對照組，酶活性的測定也表現(xiàn)出相似的結(jié)果，可能由于天津厚蟹對于高鹽滲透的調(diào)節(jié)能力更強(qiáng)，研究結(jié)果與羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergi）[24]、凡納濱對蝦[25,26]、中華絨螯蟹[27]研究結(jié)果相似。

低鹽脅迫組中，24 h 內(nèi)天津厚蟹Na+/K+-ATPase酶活性隨著鹽度的降低而增強(qiáng)，這可能是機(jī)體對水體中鹽度變化的響應(yīng)機(jī)制[28]，在低鹽狀態(tài)下，蟹類從外部水體中吸收Na+和Cl-，調(diào)節(jié)血淋巴中的離子濃度，補(bǔ)償鹽度降低對機(jī)體的影響[29]，通過Na+/K+-ATPase 酶活性的增強(qiáng)，促使天津厚蟹從水體中吸收更多的Na+，維持體內(nèi)高滲環(huán)境的平衡[30]。但隨著低鹽脅迫時(shí)間的延長，Na+/K+-ATPase 酶活性降低，而Na+/K+-ATPase 酶在離子轉(zhuǎn)運(yùn)上皮中起重要作用，酶活性的降低會(huì)進(jìn)一步減弱細(xì)胞膜的通透性，從而降低細(xì)胞內(nèi)攝入Na+的能力，最終影響機(jī)體內(nèi)的滲透壓平衡[31]高鹽脅迫（16、32）下，水體中Na+和滲透壓高于天津厚蟹體內(nèi)，機(jī)體不會(huì)通過擴(kuò)散和排泄損失Na+，故高鹽脅迫下天津厚蟹Na+/K+-ATPase 酶活性明顯低于低鹽脅迫組，但至96 h，高鹽脅迫組Na+/K+-ATPase 酶活性高于0、2 鹽度組，一定程度上表明低鹽度更能夠刺激天津厚蟹的滲透壓調(diào)節(jié)，這也與鹽度脅迫下鋸緣青蟹、中華絨螯蟹[32]、克氏原螯蝦[33]Na+/K+-ATPase 酶的變化結(jié)果相似，但與三疣梭子蟹的研究結(jié)果相反，原因可能為天津厚蟹為典型的滲透壓調(diào)節(jié)型物種，而三疣梭子蟹為滲透壓隨變型物種，自身滲透壓調(diào)節(jié)能力較弱[34]。

天津厚蟹滲透壓調(diào)節(jié)過程的研究有助于了解其在濕地圍墾導(dǎo)致鹽度變化時(shí)的響應(yīng)機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)，水體中鹽度變化影響天津厚蟹Na+/K+-ATPase、GDH 酶活性及GDH 基因表達(dá)量，而與高鹽脅迫相比，低鹽脅迫（2、4 鹽度組）對天津厚蟹的滲透壓影響更大，這也在一定程度上解釋了圍墾后（鹽度降低）天津厚蟹物種數(shù)量驟減或消失的原因[35]。