轉(zhuǎn)基因大豆用作水產(chǎn)動物飼料原料的安全性研究進(jìn)展

俞濤濤，張家國，張長峰，黃寶生，黃小霞

（1.山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運保鮮技術(shù)重點實驗室，山東 濟(jì)南 250103；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250103）

轉(zhuǎn)基因作物（Genetically modified crop，GMC），即利用基因工程技術(shù)將外源DNA 轉(zhuǎn)移并整合到植物的受體基因組，改變其遺傳性狀后產(chǎn)生的植株及后代，又被稱為遺傳修飾生物體（Genetically modified organisms，GMOS）[1]。轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化種植最早始于1996 年[2]，截至2018 年已有26 個國家和地區(qū)種植轉(zhuǎn)基因作物，種植面積超1.90×107km2，其中轉(zhuǎn)基因作物大豆的種植面積為9.59×106km2[3]，是種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物。近年來，中國畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，對大豆的需求缺口很大，2020 年全年大豆進(jìn)口量達(dá)創(chuàng)紀(jì)錄的1.00327×108t，比2019 年的0.88513×108t 增長13.3%，是本土產(chǎn)量的4 倍以上。同普通大豆蛋白質(zhì)品質(zhì)一樣，轉(zhuǎn)基因大豆是良好的蛋白質(zhì)來源，目前已普遍用于水產(chǎn)飼料，然而公眾對轉(zhuǎn)基因相關(guān)食品的爭議不斷，其對水產(chǎn)動物的影響及食用安全性問題一直是社會食品科學(xué)問題的焦點。本文通過綜述轉(zhuǎn)基因大豆在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用及其安全性研究進(jìn)展，可為其在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用和為后續(xù)研究提供參考。

1 轉(zhuǎn)基因大豆的研究歷程

轉(zhuǎn)基因大豆的研究開始于20 世紀(jì)80 年代。1986 年美國孟山都公司從細(xì)菌中提取抗除草劑的EPSPS（5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶）基因，1988 年Hinchee 等[4]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將nptⅡ基因和草甘膦抗性基因?qū)氪蠖?，首次獲得了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆植株，標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因大豆研究進(jìn)入新的階段。1994 年美國孟山都公司首次推出抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆，1996 年美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)在美國上市，開始商業(yè)化種植。1997 年，杜邦公司獲得美國食品藥物管理局FDA 批準(zhǔn)商業(yè)化種植高油酸轉(zhuǎn)基因大豆。1998 年AgrEvo 公司研制的抗草甘膦大豆被批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)[5]。經(jīng)過30 多年的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因大豆的研究進(jìn)展迅速，目前共有30 多種轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)入商業(yè)化種植，涉及的基因性狀包括耐除草劑、抗蟲、抗逆和品質(zhì)改良，其中還包括了只具有單一性狀的品種和具有多種性狀的復(fù)合品種，應(yīng)用最廣的耐除草劑轉(zhuǎn)基因大豆就有14 種[6]。

2 轉(zhuǎn)基因大豆的種類

依據(jù)用途不同，轉(zhuǎn)基因大豆大致分為：提高品質(zhì)、抗蟲、抗逆、抗病和抗除草劑等類型。在提高大豆?fàn)I養(yǎng)價值方面，常用Δ6-脂肪酸脫氫酶基因[7]、高油酸基因[8]和Core Gene Similarity（CGS）基因[9,10]來使得大豆中的γ-亞麻酸（Linolenic acid，LA）、油酸和游離甲硫氨酸水平升高。抗蟲病方面常用的基因有蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）殺蟲晶體蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、凝集素基因和豇豆胰蛋白酶抑制劑（CpTI）基因等來提高植株的抗蟲害作用[11-13]；常用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（hygromycin phosphotransferase II，hpt）基因與hrpZpsta 基因來對抗大豆生產(chǎn)中的主要病害大豆花葉病毒（Soybean Mosaic Virus，SMV）和大豆疫霉根腐病（Phytophthora megasperma）[14-16]。抗逆方面常用的基因有甜菜堿醛脫氫酶（BADH）基因、TaDREB3 基因和擬南芥AtMYB44 基因等，以增強大豆的抗鹽堿和抗干旱能力[17-19]。具有抗除草劑性質(zhì)的大豆是目前轉(zhuǎn)基因大豆中最主要的品系，其常用的抗草甘磷基因EPSPS 廣泛存在于原核生物、酵母、真菌、植物和藻類中，可有效抵御草甘膦的作用。在抗除草劑大豆中應(yīng)用面積最廣、使用率最高型號是Roundup Ready Soybean（RRS）。

3 轉(zhuǎn)基因大豆的實質(zhì)等同性研究

生物技術(shù)的應(yīng)用提高了轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量和商業(yè)應(yīng)用性，轉(zhuǎn)基因大豆作為第一個被批準(zhǔn)用于食品生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因作物，在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用潛力十分巨大[20]。不過外源基因在轉(zhuǎn)入作物的過程中具有隨機性，外源基因的整合可能會影響作物內(nèi)源基因的表達(dá)[21]，從而引起營養(yǎng)物質(zhì)水平的變化，產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)因子，甚至植物內(nèi)毒素等[22]。但是，大多數(shù)研究表明，抗草甘膦大豆與普通大豆之間的多種營養(yǎng)物質(zhì)水平基本相同，可以部分替代水產(chǎn)飼料中的普通大豆。

3.1 營養(yǎng)組分的實質(zhì)等同性研究

最早在1993 年，經(jīng)濟(jì)合作發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）提出了實質(zhì)等同性的概念，即比較轉(zhuǎn)基因作物與傳統(tǒng)作物的營養(yǎng)組成成分等指標(biāo)是否一致，若無差異則認(rèn)為該轉(zhuǎn)基因作物與傳統(tǒng)作物具有實質(zhì)等同性[23]。實質(zhì)等同性原則有助于確定傳統(tǒng)作物與新作物之間的相似性和潛在差異性，是評價轉(zhuǎn)基因作物安全性的前提和基礎(chǔ)。但這一原則僅是初步對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行安全性評價，為了客觀反映轉(zhuǎn)基因食物與傳統(tǒng)食物之間的差異還須全面分析以判斷其安全性[24]。

有關(guān)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的實質(zhì)等同性研究存在爭議。一些研究者認(rèn)為，抗草甘膦大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆間的營養(yǎng)組分上不存在顯著性差異，具有實質(zhì)等同性；然而，另一部分研究者觀點正好相反，認(rèn)為抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆間的營養(yǎng)成分存在差異，甚至有些差異顯著，即不具有實質(zhì)等同性。不可否認(rèn)，轉(zhuǎn)基因大豆的種植和應(yīng)用在世界范圍內(nèi)均得到了很大程度的推廣，但是對其安全性一直飽受質(zhì)疑。評價抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆是否具有實質(zhì)等同性，不止是營養(yǎng)成分，更需要關(guān)注其對環(huán)境、對動物影響是否相同，而這還需長期的研究。有關(guān)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆的營養(yǎng)組分（包括蛋白質(zhì)及氨基酸、脂肪及脂肪酸、維生素和礦物元素）的實質(zhì)等同性研究結(jié)果見表1。

表1 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆（RRS）的實質(zhì)等同性研究Tab.1 Research on the substantial equivalence of glyphosate-resistant transgenic soybeans（RRS）

3.2 抗?fàn)I養(yǎng)因子的實質(zhì)等同性研究

大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子是造成水產(chǎn)動物病理學(xué)變化的一個重要因素，是引發(fā)水產(chǎn)動物腸道炎癥、臟體變化的主要原因?？?fàn)I養(yǎng)因子普遍存在于植物中，由植物代謝產(chǎn)生，是具有對動物產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)作用的一類物質(zhì)。大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子包括蛋白酶抑制因子、脲酶、凝集素；植酸、寡糖、單寧、抗原蛋白、抗維生素因子、致甲狀腺腫因子和生氰糖甙等[29]。目前轉(zhuǎn)基因大豆與普通大豆的抗?fàn)I養(yǎng)因子差異性研究情況見表2。

表2 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆（RRS）的抗?fàn)I養(yǎng)因子研究Tab.2 Research on antinutritional factors of glyphosate-resistant transgenic soybeans（RRS）

4 轉(zhuǎn)基因大豆在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用

根據(jù)實質(zhì)等同性原則，可將抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆作為水產(chǎn)用蛋白質(zhì)原料。現(xiàn)已證明，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆可替代部分魚粉，并在鯉（Cyprinus carpio）[38]、大西洋鮭（Salmo salar L.）[39]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[40]等養(yǎng)殖魚類的配合飼料中得到應(yīng)用，其不顯著影響?zhàn)B殖品種的生長與品質(zhì)。

4.1 轉(zhuǎn)基因大豆對魚類生長性能和飼料利用率的影響

魚類的生長性能和飼料利用率是評價飼料養(yǎng)殖效果最為重要的指標(biāo)。SUHARMAN 等用含有抗草甘膦大豆的飼料喂養(yǎng)平均體質(zhì)量為49.5 g 的尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）幼魚[41]和平均體質(zhì)量為22 g 的幼鯉[42]長達(dá)12 周后沒有死亡，轉(zhuǎn)基因大豆組與普通大豆組相比，增重率與特定生長率（Specific growth rate，SGR）、飼料效率（Feed efficiency，F(xiàn)E）、蛋白質(zhì)效率以及蛋白質(zhì)保留率都未見改變。LIU 等[38]用轉(zhuǎn)基因大豆飼料飼養(yǎng)三種不同食性的鯉科魚類，草魚（Ctenopharyngodon idella）、異育銀鯽（Carassius auratus auratus）和青魚（Mylopharyngodon piceus），8 周的飼養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆與普通大豆組同種魚類的SGR 與FE 沒有明顯差別。對斑點叉尾（Ictalurus punctatus）[43]、大西洋鮭[39]和虹鱒[40]等肉食性魚類的類似研究也沒有發(fā)現(xiàn)生長和飼料利用上的顯著差異，說明抗草甘膦大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆對上述魚類的飼喂效果一樣。

4.2 抗草甘膦大豆對魚體成分的影響

魚體成分變化是評判轉(zhuǎn)基因飼料對魚類影響的重要指標(biāo)之一。SUHARMAN 等[41]用抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆配制的飼料飼養(yǎng)尼羅羅非魚12 周后發(fā)現(xiàn)，盡管飼喂轉(zhuǎn)基因飼料實驗組全魚的粗脂肪含量略高于飼喂非轉(zhuǎn)基因飼料的對照組，但全魚的水分和粗蛋白含量沒有顯著性差異。LIU 等[38]比較了魚粉、抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因大豆飼料對草魚、異育銀鯽和青魚的飼喂效果，發(fā)現(xiàn)無論哪種魚類，不同飼料處理不影響全魚的粗蛋白、粗脂肪、灰分和水分含量。同樣，飼喂抗草甘膦大豆飼料對鯉[42]、大西洋鮭[44]的魚體成分的影響與飼喂普通大豆飼料的效果相同。

5 轉(zhuǎn)基因大豆作為水產(chǎn)動物飼料原料的安全性研究進(jìn)展

5.1 轉(zhuǎn)基因大豆對水產(chǎn)動物的病理學(xué)研究

轉(zhuǎn)基因大豆對魚類的病理生理學(xué)影響主要表現(xiàn)為引發(fā)腸道炎癥和臟器指數(shù)變化。BAKKE 等[45]以普通大豆與魚粉作為對照組，用含17%的抗草甘膦大豆飼喂大西洋鮭稚魚三個月，發(fā)現(xiàn)各組魚腸道炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因-α、白細(xì)胞介素1β、γ干擾素等基因表達(dá)量無差異。FROYSTAD[46]在研究抗草甘膦大豆對大西洋鮭組織學(xué)影響時發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆組中度炎癥的發(fā)生率高于非轉(zhuǎn)基因大豆組，但是，位于腸細(xì)胞刷狀邊緣的亮氨酸氨肽酶、麥芽糖酶和酸性磷酸酶活性以及主要組織相容性復(fù)合體II+細(xì)胞數(shù)量均未見顯著性差異。迄今的研究表明，食用轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆均可導(dǎo)致微絨毛缺失、受損、變形、變短和變厚。

臟器系數(shù)可以間接反映動物臟器的受損情況。HEMRE 等[47]發(fā)現(xiàn)，攝食含17%RRS 的飼料時，大西洋鮭的大西洋鮭脾臟系數(shù)稍高于普通大豆組，可能與白細(xì)胞活性有關(guān)，機體受外源刺激后激活并增殖白細(xì)胞。而SANDEN 等[39]用12.5%RRS 飼料喂養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，RRS 組與普通大豆組大西洋鮭的相對器官重量沒有顯著差異，這與SISSENER 等[48]的研究結(jié)果相同，還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆組的中腸系數(shù)顯著低于普通大豆組。

由此可見，大豆對大西洋鮭所造成的腸道炎癥與轉(zhuǎn)基因無關(guān)，轉(zhuǎn)基因大豆不會顯著影響大西洋鮭的臟器指數(shù)。目前轉(zhuǎn)基因作物對水產(chǎn)生物影響的研究較少，以上研究尚不能得知轉(zhuǎn)基因大豆是否對水產(chǎn)生物產(chǎn)生病理學(xué)影響。目前大部分報道轉(zhuǎn)基因作物對其他動物的器官發(fā)育沒有影響。劉莎莎等[49]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因大豆對飼養(yǎng)21 d 的肉仔雞3 個免疫器官指數(shù)和42 d 的肉仔雞胸腺和脾臟器官指數(shù)沒有影響。Hammond 等[50]用轉(zhuǎn)基因玉米飼喂小鼠90 d發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)基因玉米含量為11%和33%組與普通對照組的小鼠臟體指數(shù)不存在顯著性差異。Momma[51]等研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)大豆球蛋白基因大米對轉(zhuǎn)基因組小鼠與商品飼料組、常規(guī)飼料組小鼠的免疫器官指數(shù)、病理學(xué)癥狀、組織病理學(xué)等都不存在顯著差異。

5.2 轉(zhuǎn)基因大豆對水產(chǎn)動物血清免疫能力的影響

目前有關(guān)轉(zhuǎn)基因大豆對魚類的免疫性能研究主要集中于常規(guī)非特異性免疫分析，如全血與血清生化指標(biāo)、溶菌酶；特異性體液免疫分析，如免疫球蛋白M。受到外界影響或環(huán)境變化使魚體發(fā)生生理或病理變化時，魚體液各項指標(biāo)必定會出現(xiàn)相應(yīng)變化，引起多種激素、血清底物濃度、血細(xì)胞參數(shù)或各種血清和臟體中酶活性的變化[52]。LIU 等[38]研究了普通大豆與抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對草魚、異育銀鯽和青魚的影響，發(fā)現(xiàn)這三種鯉科魚類的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性和肝胰腺總抗氧化能力不受大豆的種類和熱處理的影響。攝食含轉(zhuǎn)基因大豆或非轉(zhuǎn)基因大豆日糧的異育銀鯽肝胰臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性明顯高于攝食魚粉日糧的異育銀鯽，這可能是大豆對異育銀鯽的肝臟損害較大，而與大豆是否為轉(zhuǎn)基因無關(guān)。HEMRE 等[47]實驗發(fā)現(xiàn)，添加17%RRS 組大西洋鮭的血液參數(shù)、血漿營養(yǎng)濃度和血漿中特異性酶的水平與非轉(zhuǎn)基因大豆組顯著相比不差異。同樣的，SANDEN 等[39]發(fā)現(xiàn)，添加12.5%RRS 組大西洋鮭稚魚的甘油三酯水平低于普通大豆組，血漿營養(yǎng)物濃度和酶活性沒有變化，可能是抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆增強了大西洋鮭的能量代謝或是兩種大豆的皂甙水平略有不同所致?？共莞熟⒋蠖箤Υ笪餮篚q的溶菌酶活性或遠(yuǎn)端腸的總免疫球蛋白M 含量未見顯著性差異[46]。

由此可見，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對草魚、異育銀鯽、青魚和大西洋鮭的免疫毒性沒有顯著性差異，即使存在差異也與大豆是否為轉(zhuǎn)基因無關(guān)。這與劉莎莎等對肉仔雞及初歡歡等[53]對生長豬的研究結(jié)果相近：轉(zhuǎn)基因大豆飼養(yǎng)21 d 組與42 d 組的肉仔雞，與普通大豆對照組相比，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶活性和葡萄糖和甲狀腺素含量不存在顯著性差異；用含26.5%轉(zhuǎn)基因飼料飼養(yǎng)生長豬35 d 后，其血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇、總蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素氮含量與普通大豆添加組無顯著差異，堿性磷酸酶活性明顯高于普通大豆組。

5.3 草甘膦殘留對水產(chǎn)動物的環(huán)境毒性研究

目前使用最為廣泛的RRS 大豆具有抗草甘膦特性，種植時直接噴灑大量草甘膦以達(dá)到除草的目的。雖然早在1997 年，美國環(huán)保部對轉(zhuǎn)基因大豆、大豆飼料、大豆干草中的草甘膦殘留限制分別放寬為20 mg·kg-1、100 mg·kg-1和200 mg·kg-1[54]，但這并不代表草甘膦的毒性較低。廖藝鈺等[55]的急性毒性研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦對斑馬魚的96 h LC50（96 h 半數(shù)致死濃度）為0.879 mg·L-1；41%草甘膦異丙銨鹽水劑對草魚、鰱和鯽的96 h LC50為0.2518 mg·L-1、0.2588 mg·L-1、0.2599 mg·L-1[56]。

肖永紅等[57]研究發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量0.79 ml·L-1的草甘膦溶液對中華大蟾蜍（Bufo gargarizans）的蝌蚪生長、發(fā)育不利，降低蟾蜍在蝌蚪期的生理功能和環(huán)境適應(yīng)度，最終影響蟾蜍的生長。張彬彬[58]為了探究轉(zhuǎn)基因大豆中殘留的草甘膦對鯽的影響，用上限值為2.56 mg·L-1的5 個不同梯度的草甘膦溶液研究了鯽肝臟內(nèi)膜系統(tǒng)和超氧化物歧化酶（SOD）活性。結(jié)果表明，隨著草甘膦濃度的增加，鯽肝細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中線粒體腫脹及空泡化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化。這種核結(jié)構(gòu)的改變預(yù)示著機體內(nèi)細(xì)胞死亡或壞死；不同質(zhì)量濃度的草甘膦處理均使鯽肝臟中SOD 活性增強，且隨著草甘膦濃度的升高而升高，在96 h時體內(nèi)SOD 不足以清除多余的氧自由基，出現(xiàn)抑制效應(yīng)，這與范瑾煜[59]對鯽暴露于草甘膦中的影響結(jié)果相似。

綜上，斑馬魚、草魚、鰱和鯽的半數(shù)致死濃度均遠(yuǎn)低于美國農(nóng)業(yè)局的標(biāo)準(zhǔn)，說明草甘膦殘留就算在標(biāo)準(zhǔn)之下也不一定安全；高濃度的草甘膦殘留會引起某些水產(chǎn)生物的毒理學(xué)變化，但目前的研究都是直接添加高濃度草甘膦溶液進(jìn)行研究，普通大豆或轉(zhuǎn)基因大豆中草甘膦殘留對水產(chǎn)動物的影響卻鮮有報道，因此在實際應(yīng)用中轉(zhuǎn)基因大豆是否會因為草甘膦殘留而對養(yǎng)殖物種產(chǎn)生額外影響還不得而知，所以，探究轉(zhuǎn)基因大豆飼料中草甘膦殘留必須作為一個飼用安全性考慮的范疇，因此需結(jié)合先進(jìn)的檢測技術(shù)去研究草甘膦在魚體內(nèi)的殘留量、長期投喂積累量的變化及對魚類是否產(chǎn)生不利影響等。

6 轉(zhuǎn)基因大豆在水產(chǎn)動物體內(nèi)殘留的安全性問題

中國目前只允許進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆用于飼料加工，這些作物生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品還面臨著各種爭議，公眾質(zhì)疑轉(zhuǎn)基因食品是否具有潛在的毒性、過敏反應(yīng)以及抗生素風(fēng)險等[60]。美國是世界上轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)用最廣的國家，雖然在過去的二十多年里美國沒有出現(xiàn)過嚴(yán)格意義上的有關(guān)轉(zhuǎn)基因食品有害研究的報道[61]，但很多人還是十分抵觸直接接觸轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。因此作為飼料原料的轉(zhuǎn)基因大豆在養(yǎng)殖動物體內(nèi)的殘留就成了研究內(nèi)容。菌株CP4 EPSPS賦予對除草劑草甘膦的耐受性[62]，因此這些大豆含有由花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus,CaMV）啟動子組成的重組基因。該啟動子調(diào)控CP4 EPSPS 和胭脂堿合酶（Nopaline synthase,NS）基因的終止子，使得CaMV35S 啟動子片段僅能在轉(zhuǎn)基因大豆中檢測到。

SUHARMAN 等[41]分別給體質(zhì)量49.5 g 的尼羅羅非魚頭欸添加了34%和48%的轉(zhuǎn)基因大豆等量的普通大豆飼養(yǎng)12 周，用PCR 測定魚體肌肉中CaMV35S 啟動子片段的存在。結(jié)果表明，在非轉(zhuǎn)基因飼料組的魚體肌肉樣品中未檢測到CaMV35S 啟動子片段；而在第8 周結(jié)束時，從喂食48%轉(zhuǎn)基因飼料組的20 尾魚的2 個魚肉樣品中檢測到了該碎片，在第12 周結(jié)束時，飼喂34%轉(zhuǎn)基因飼料魚體肌肉樣本中，1/10 為陽性。序列分析驗證了魚肌肉樣品中CaMV35S PCR 產(chǎn)物的身份，表明其與CaMV35S啟動子參考序列（GenBank 登錄號V00141）相同。改用非轉(zhuǎn)基因飼料后，在原先飼喂兩組轉(zhuǎn)基因飼料的魚體肌肉樣品中均未檢測到CaMV35S 啟動子片段。SUHARMAN 等[63]為了研究抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的轉(zhuǎn)基因片段在血液和器官中轉(zhuǎn)移的可能性，又用含48%轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因大豆的飼料喂養(yǎng)體質(zhì)量為78.0 g 的尼羅羅非魚21 d。在此期間，先用轉(zhuǎn)基因大豆蛋白飼料喂養(yǎng)12 d，再用非轉(zhuǎn)基因大豆蛋白飼料喂養(yǎng)9 d，以確定轉(zhuǎn)移的CaMV35S 啟動子片段的剩余壽命。在喂食期間，每3 d 取一次血、脾、肝、腸、腎和肌肉組織樣品，提取總DNA，進(jìn)行PCR分析，以確定CaMV35S 啟動子的108 bp 片段的存在。結(jié)果顯示，在除肌肉外的所有器官樣品中都檢測到少量和信號微弱的CaMV35S 啟動子片段，而在改喂非轉(zhuǎn)基因生物基質(zhì)飼料3 d 后沒有檢測到，證實了CaMV35S 啟動子片段在魚的肌肉和器官透射率非常低。同樣，CHAINARK 等[64]用轉(zhuǎn)基因大豆配制的飼料飼養(yǎng)虹鱒12 周PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，魚肌肉中含轉(zhuǎn)基因大豆蛋白的CaMV35S 啟動子片段，但在改喂非轉(zhuǎn)基因飼料后第5 d 啟動子片段消失。隨后，測量了轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因植物中含有外來DNA 片段的降解情況，評估其對魚類的安全性，發(fā)現(xiàn)這些外源基因片段在胃和腸中沒有完全降解，可能通過胃腸道進(jìn)入器官。說明投喂含有轉(zhuǎn)基因大豆配制的飼料會在尼羅羅非魚和虹鱒體內(nèi)殘留，但轉(zhuǎn)基因大豆的基因殘留是暫時的，會隨著機體的代謝排出體外。

7 展望

7.1 建立健全轉(zhuǎn)基因大豆作為水產(chǎn)飼料的安全性評價體系

目前,國際上公認(rèn)的轉(zhuǎn)基因植物安全性評價主要包括環(huán)境和食品安全性兩方面，而評價體系中的實質(zhì)等同性原則存在著一定的缺陷。該原則可以作為評估轉(zhuǎn)基因食物安全性的參考，但不能作為評估安全性的準(zhǔn)則。評估轉(zhuǎn)基因作物對水產(chǎn)動物的安全性，需考慮對水產(chǎn)動物生長、肉質(zhì)和免疫安全性，轉(zhuǎn)基因作物作為原料飼喂水產(chǎn)動物來的營養(yǎng)品質(zhì)等效性。免疫安全性評價是食品安全性評價中最為有效的評價手段，是轉(zhuǎn)基因食品安全評價體系中重要的組成部分。目前的研究大部分集中在對全血和血液生化指標(biāo)的分析或者腸道組織病變與其他免疫器官的臟體指數(shù)分析，而鮮見其他免疫指標(biāo)的研究報道。免疫安全性評價方面的欠缺需要從組織病理學(xué)觀察、免疫器官指數(shù)分析、常規(guī)非特異性免疫分析、特異性體液免疫分析、細(xì)胞免疫分析、腸道黏膜免疫分析等6 個方面著手[65]，目前在動物，特別是水產(chǎn)動物中，對相關(guān)毒理與病理學(xué)的研究很少且不深入，這需要大量的實驗去分析與驗證；評估轉(zhuǎn)基因飼料飼喂的水產(chǎn)動物對人體的安全性即為食品安全，由轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)的消化率和其在水產(chǎn)動物體內(nèi)的摻入量決定，轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)消化的不完全以及其在機體內(nèi)的高滲入量會給食用這些水產(chǎn)動物的人們帶來安全性上的擔(dān)憂，即基因殘留的安全隱患，而養(yǎng)殖體體內(nèi)的殘留可能會進(jìn)入人體，產(chǎn)生未知的生理影響。不過轉(zhuǎn)基因或含有外源基因片段殘留的食品是否對人體有害目前尚無定論[66]。因此，建立完善的轉(zhuǎn)基因大豆的安全性評價體系尤為迫切。

7.2 加強外源基因殘留的安全性研究

測定外源基因的殘留必須是評估轉(zhuǎn)基因大豆對水產(chǎn)動物安全性的重要一環(huán)。含有基因殘留的水產(chǎn)動物可能與野生及非轉(zhuǎn)基因同屬動物雜交而產(chǎn)生“基因漂移”，可能影響野生動物種群的遺傳多樣性[67]。然而，目前已有的研究僅局限于魚體本身。在使用轉(zhuǎn)基因飼料養(yǎng)殖水產(chǎn)動物的過程中，剩余飼料和水產(chǎn)動物產(chǎn)生的糞便都有可能含有轉(zhuǎn)基因片段，其對環(huán)境水體是否造成污染以及是否對周圍生態(tài)物種產(chǎn)生影響尚未見報道。應(yīng)當(dāng)加強對用轉(zhuǎn)基因飼料養(yǎng)殖水產(chǎn)動物水環(huán)境的檢測與分析，了解轉(zhuǎn)基因片段在水環(huán)境中的轉(zhuǎn)移途徑與有效存在時間，分析其在水環(huán)境的含量，評估基因漂移對養(yǎng)殖對象與周圍生態(tài)環(huán)境的影響程度?；蚱扑斐傻暮蠊赡苓h(yuǎn)比對養(yǎng)殖物種所造成影響的后果可怕，它可能會影響生態(tài)環(huán)境、破壞生態(tài)圈的完整性，造成長遠(yuǎn)的不良影響。

7.3 填補轉(zhuǎn)基因大豆對親本及子代的安全性研究空白

轉(zhuǎn)基因作物是否會通過親本進(jìn)行代際遺傳是個根本性的問題，相關(guān)研究對養(yǎng)殖動物和人類的影響意義重大。水產(chǎn)的相關(guān)研究尚屬空白，但對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展意義重要，亟須未來的研究者去填補。目前僅見SISSENER 等[68]給斑馬魚（Danio rerio）親本與子一代投喂添加轉(zhuǎn)基因大豆飼料中，發(fā)現(xiàn)其肝對生長和應(yīng)激影響的報道，肝臟中RNA 總量和SOD-1 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平偏低。BRAKE 和EVENSON[69]研究了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對三代小鼠睪丸發(fā)育的影響，連續(xù)三代小鼠一生中六個定期的生殖細(xì)胞數(shù)量，確定飲食在生命的任何階段都不會對睪丸發(fā)育產(chǎn)生可檢測的影響。DALEPRANE 等[70]測量兩代大鼠的凈蛋白質(zhì)比率和蛋白質(zhì)功效比率，研究了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆和有機大豆的使用情況。雖然兩組大豆大鼠的體質(zhì)量比、蛋白質(zhì)攝入量和品質(zhì)等存在一定差異，但從親本到子代，在同一組中沒有觀察到顯著的體質(zhì)量差異。TUDISCO 等[71]研究了用草甘膦耐受大豆喂養(yǎng)兩代山羊（20 只懷孕奶山羊在宰殺前的60 d、30 d 和15 d）15 d、30 d 和60 d 血液和乳汁中轉(zhuǎn)基因DNA片段的存在。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸脫氫酶（LDH）活性和乳酸脫氫酶同工酶之間的替換有顯著差異。普通大豆組山羊的肝臟（LDH1）和腎臟（LDH1）、肌肉（LDH1 和LDH2）中的LDH 活性增加，而在飲用轉(zhuǎn)基因組山羊羊奶的幼體中，心臟（LDH2 和LDH3）和肌肉（LDH5）中的LDH 活性減少。組織中LDH 水平升高表明細(xì)胞代謝增加，但血清中相應(yīng)的酶活性保持不變，因此這種影響尚不清楚，作者不認(rèn)為這是一個健康問題。簡而言之，TUDISCO 等表明了轉(zhuǎn)基因大豆可能會對新陳代謝產(chǎn)生一些影響，盡管尚不清楚這是否表明存在健康風(fēng)險問題。