烏鱧水泡病毒核蛋白和磷蛋白多克隆抗體的制備與應(yīng)用

張彥冰，郭夢雅，劉曉丹

（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000）

烏鱧水泡病毒（Snakehead Vesiculovirus,SHVV）屬彈狀病毒科（Rhabdoviridae）成員，其基因組為單股不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA[1]，是引起烏鱧（Channa argus）病毒病的主要病原[2]。感染烏鱧水泡病毒的魚體多體表發(fā)黑，鰓無血色蒼白，不攝食，游泳無力偶爾會狂躁不安，容易在水流速度慢的地方聚集；解剖可觀察到病魚的肝脾腎腫大，有腹水[3]。烏鱧水泡病毒的基因組中有編碼核蛋白（Nucleoprotein，N）、磷酸化蛋白（Phosphoprotein，P）、基質(zhì)蛋白（Matrix protein，M）、糖蛋白（Glycoprotein，G）以及RNA 依賴的RNA 聚合酶蛋白（RNA-dependent RNA polymerase，L）五個結(jié)構(gòu)蛋白[3,4]。其中，核蛋白N 是含量最豐富、結(jié)構(gòu)最保守的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，核蛋白與病毒基因組RNA 相結(jié)合，作為病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的模板，對轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程起著重要的調(diào)節(jié)作用[5]。與此同時核蛋白能夠激活魚體內(nèi)的T 淋巴細(xì)胞，對病毒粒子產(chǎn)生免疫應(yīng)答，也可以激活T 輔助淋巴細(xì)胞，一定程度上加強(qiáng)B 淋巴細(xì)胞生成抗體的能力[6]。磷酸化蛋白P 是促使基因組從轉(zhuǎn)錄狀態(tài)轉(zhuǎn)換到復(fù)制狀態(tài)的關(guān)鍵因子，通過高度磷酸化改變自身結(jié)構(gòu)，啟動核衣殼向病毒基因組RNA 結(jié)合，在RNA 與蛋白質(zhì)組成復(fù)合體的過程中發(fā)揮重要作用[7,8]。N 蛋白、P 蛋白與L 蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合體指導(dǎo)病毒RNA 的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。

大腸桿菌（Escherichia coli）表達(dá)系統(tǒng)遺傳學(xué)背景清晰、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究成熟，操作過程簡便，能夠快速誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，且表達(dá)產(chǎn)量高，最為成熟、應(yīng)用最普遍的原核表達(dá)系統(tǒng)，有多種適用不同蛋白的表達(dá)載體和宿主菌[9,10]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)缺乏磷酸化、糖基化等翻譯后蛋白修飾系統(tǒng)，適合翻譯后修飾作用不影響蛋白活性及特定結(jié)構(gòu)的外源蛋白表達(dá)[11]。

本研究通過克隆烏鱧水泡病毒SHVV 的N、P蛋白基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-5x-1-N和pGEX-5x-1-P，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對N、P蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，純化回收重組蛋白后免疫新西蘭大白兔和小鼠獲得N、P 蛋白的多克隆抗體，為該病毒免疫學(xué)檢測方法的建立及疫苗的研發(fā)提供基礎(chǔ)資料，并利用獲得的抗體檢測病毒蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的分布。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及細(xì)胞

大腸桿菌DH5α 與BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購于寶生物工程（大連）有限公司；實(shí)驗(yàn)中表達(dá)載體pGEX-5x-1 及SSN-1 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；SHVV由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 主要試劑

MEM細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素溶液購自Hylcone 公司；胎牛血清（FBS）、胰酶購自Gibco 公司；限制性內(nèi)切酶Sal I、EcoR I、Not I 和RNA提取與反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4 DNA ligase、2×Taq PCR Mix 購自寶生物工程（大連）有限公司；包被液、洗滌液、稀釋液、底物液、終止液等購于武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒等均購于北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒與蛋白微量回收試劑盒購自于生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計與合成

以SHVV N、P 序列為模板分別設(shè)計引物。N 基因上游引物命名NF-Sal I，序列為GGGTCGACTCATGGAAAACCAAATCATCAAG；下游引物命名NB-Not I，序列為GATGCGGCCGCTCACAAAGCTTG GTGCTTCAG。P 基因上游引物命名PF-EcoR I，序列為AGCGAATTCATGGCAAAACCAGTTTTCCA；下游引物命名為PB-Not I，序列為ACTGCGGCCGCTTAGAACAGCACCATTTGCT。

1.4 目的基因的擴(kuò)增與純化

用Trizol 法提取感染病毒細(xì)胞的總RNA，再根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，用1.3 中所設(shè)計的特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30 個循環(huán)；延伸反應(yīng)72℃5 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，純化回收目的片段。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

用對應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶將PCR 產(chǎn)物以及pGEX-5x-1 表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切處理后，利用T4 DNA 連接酶將酶切后的目的片段與克隆載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，挑取單菌落重新接種在LB 培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并分別用Sal I/Not I 和EcoR I/Not I 對所提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的克隆且測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒分別命名為pGEX-5x-1-N 和pGEX-5x-1-P。

1.6 重組蛋白的原核表達(dá)

將上述獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）涂布LB 平板，挑取單克隆，37℃震蕩培養(yǎng)。在OD 值達(dá)到0.6 左右時加入IPTG，28℃誘導(dǎo)6 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，取2 mL 誘導(dǎo)菌液及對照菌液4℃5 000 r/min 離心5 min，收集菌體。用100 μL PBS 重懸菌體，加入等量的SDS-PAGE 上樣緩沖液，沸水中處理10 min，取10 μL 樣品進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

1.7 動物的免疫

利用蛋白凝膠回收試劑盒回收經(jīng)SDS-PAGE分離的目的蛋白后，選取新西蘭大白兔，初次免疫時加等量完全弗氏佐劑乳化，后兩次加等量不完全弗氏佐劑，皮下多點(diǎn)注射500 μg 的pGEX-5x-1-N乳化后的蛋白，每隔兩周免疫一次，共進(jìn)行三次免疫；同樣，選取4～6 周齡小鼠，每次免疫100μg 的pGEX-5x-1-P 乳化后的蛋白，免疫三次；設(shè)置未免疫的兔子和小鼠作為對照。

1.8 效價測定及Western-blot 檢測

免疫結(jié)束后采血，裝入離心管中，置于4℃過夜，取出析出的血清，分裝備用，在獲得抗血清之后用ELISA 測定血清效價。具體操作方法如下：用包被液（pH9.6，0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液）稀釋純化的SHVV 病毒懸液抗原后,按照0.625 μg/孔的濃度包被聚丙乙烯酶標(biāo)板，4℃過夜；棄去包被液，然后每孔加入200 μL 洗滌液（含0.05%Tween20 的0.01 mol/L、pH7.4 的PBS，PBST）洗滌4 次，每次5 min，在干毛巾上拍干；每孔加入100 μL 封閉液（含1%BSA 的PBS），37℃溫育1 h，拍干，洗板同前；加入100 μL 適當(dāng)稀釋的多克隆抗血清（按1∶200～1∶25 600 倍比稀釋），對照組加入正常兔子血清（按1∶200～1∶25 600 倍比稀釋作為陰性對照），37℃溫育30 min，洗滌同前；每孔加入100 μL 適當(dāng)稀釋倍數(shù)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 抗體，37℃溫育30 min，同上洗滌；加底物液100 μL（底物液A 50 μL，底物液B 50 μL）顯色10 min，每孔加終止液50 μL，于酶標(biāo)儀630 nm 下測定光密度。再用0.1 MOI SHVV 感染SSN-1 細(xì)胞24 h 后收集細(xì)胞樣品，Western blot 分析多克隆抗體的特異性。

1.9 間接免疫熒光檢測

將SSN-1 細(xì)胞接種在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長滿單層后感染0.1 MOI（Multiplicity of infection，MOI）SHVV，同時設(shè)立未感染病毒的細(xì)胞作為對照組。接毒的細(xì)胞在28℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用預(yù)冷的丙酮-甲醇（1∶1）固定液固定10 min，PBS 清洗3 次后，1%BSA 封閉30 min，制備的N、P 蛋白的多克隆抗體（1∶5 000）為一抗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的商品化抗體（1∶200）為二抗，DAPI 細(xì)胞核染色3～5 min，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增

以感染病毒的SSN-1 細(xì)胞cDNA 為模板，采取RT-PCR 方法通過特異性引物擴(kuò)增出SHVV 相應(yīng)的P、N 基因片段。瓊脂糖凝膠電泳檢測可見，對應(yīng)片段大小分別為864 bp 和1 290 bp 的片段（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 SHVV P、N 基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The amplification products of P,N genes by PCR

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將目的基因酶切后的片段純化回收后，與酶切后的pGEX-5x-1 載體連接，構(gòu)建融合GST 標(biāo)簽的原核表達(dá)重組質(zhì)粒。經(jīng)過測序和鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pGEX-5x-1-N，pGEX-5x-1-P 分別經(jīng)Sal I/Not I、EcoR I/Not I 雙酶切后，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定（圖2）。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion

2.3 重組蛋白的原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒pGEX-5x-1-N、pGEX-5x-1-P 分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21（DE3）后，加入濃度1.0 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)6 h，收集菌液及蛋白樣品。利用SDS-PAGE 進(jìn)行蛋白電泳檢測，經(jīng)過IPTG 誘導(dǎo)的和未經(jīng)過誘導(dǎo)的空白載體pGEX-5x-1作為對照（圖3），重組N 蛋白大小約為73 kD，重組P 蛋白大小約為57 kD，與預(yù)期相符。

圖3 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的SDS-PAGE 檢測Fig.3 Identification of recombinant plasmids prokaryotic expression by SDS-PAGE

通過蛋白凝膠回收試劑盒回收后，N 蛋白濃度為700 μg/mL，免疫所需總蛋白量為1 500 μg；P 蛋白濃度為300 μg/mL，免疫所需總蛋白量為300 μg。分別用N 蛋白作為抗原免疫兔子，P 蛋白作為抗原免疫小鼠，用ELISA 方法測得血清中特異性抗體的效價。當(dāng)樣品吸光值/陰性吸光值＞2.1 時即認(rèn)為是陽性。不同稀釋倍數(shù)下實(shí)驗(yàn)組OD 值都在1 以上，且對照組OD 值很低，因此這兩個多克隆抗體的效價均不低于1∶25 600（圖4）。

圖4 多克隆抗體效價的測定Fig.4 The titer of the anti-N,anti-P polyclonal antibody detected by ELISA

2.4 多克隆抗體的制備及Western-blot 檢測

用0.1 MOI SHVV 感染SSN-1 細(xì)胞24 h 后收集細(xì)胞樣品，對制備的多克隆抗體進(jìn)行Western blot分析。N 蛋白與P 蛋白的多克隆抗體能夠特異性地識別出SHVV N、P 蛋白的大小分別約為47 kD 和31 kD，且特異性良好，而對照組細(xì)胞沒有檢測到條帶（圖5）。

圖5 N、P 蛋白多克隆抗體的Western blotting 分析Fig.5 Western Blot Assay of PcAbs against SHVV N protein and P protein

2.5 間接免疫熒光檢測

將SSN-1 細(xì)胞接種在24 孔板中，長滿單層后感染0.1 MOI SHVV16 h 后，用制備的N、P 蛋白的多克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的商品化抗體為二抗，進(jìn)行間接免疫熒光檢測。結(jié)果：SHVV 病毒感染的SSN-1 細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的綠色熒光信號，而未感染組的SSN-1 細(xì)胞則沒有相應(yīng)的熒光信號，說明N、P 蛋白的多克隆抗體可以與SHVV 進(jìn)行特異性結(jié)合，且N、P 蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖6）。

圖6 SHVV 的N 蛋白（1）和P 蛋白（2）在細(xì)胞內(nèi)分布Fig.6 Intracellular distribution of SHVV N protein（1）and P protein（2）

3 討論

烏鱧水泡病毒SHVV 宿主廣泛，除了能感染鱧科魚類外還能感染鱸形目科的鱖（Siniperca chuatsi）等。魚類感染SHVV 后，體表發(fā)黑，鰓蒼白，胃腸道內(nèi)沒有食物，解剖觀察有腹水[3,12]，且感染病毒的魚死亡率極高，目前為止缺乏對該病毒的診斷與有效防控方法。

彈狀病毒科的病毒基因組RNA 主要編碼N、P、M、G、L 5 種結(jié)構(gòu)蛋白。核蛋白N 是含量最豐富、結(jié)構(gòu)最保守的病毒結(jié)構(gòu)蛋白[5]，磷酸化蛋白P 是促使基因組從轉(zhuǎn)錄狀態(tài)轉(zhuǎn)換到復(fù)制狀態(tài)的關(guān)鍵因子[13]。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增了N、P 蛋白的部分序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至原核表達(dá)載體pGEX-5x-1 中。pGEX 系列的原核表達(dá)載體帶有GST 標(biāo)簽，而GST 標(biāo)簽?zāi)軌虼龠M(jìn)目的蛋白正確折疊，有效提高蛋白表達(dá)可溶性[14]。因此分別構(gòu)建融合GST 標(biāo)簽的重組質(zhì)粒pGEX-5x-1-N 以及pGEX-5x-1-P，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）。

大腸桿菌為原核生物，傳代時間短，營養(yǎng)要求簡單，遺傳背景清晰，能夠高效、迅速地表達(dá)外源蛋白等[15]，但同時重組蛋白的原核表達(dá)常常形成包涵體，主要是在重組蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適無法形成正確的次級鍵等原因?qū)е?。相較于可溶性蛋白，包涵體表達(dá)有以下有利因素：首先，可溶性蛋白在細(xì)胞內(nèi)容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達(dá)可避免蛋白酶對外源蛋白的降解；其次包涵體表達(dá)降低了胞內(nèi)外源蛋白的濃度有利于提高表達(dá)量。盡管包涵體的形成是目的蛋白表達(dá)量較高的表現(xiàn)[16]，但大量包涵體的存在則對后續(xù)純化造成不便。有研究將切膠純化、過柱純化、包涵體復(fù)性純化等進(jìn)行對比[17-19]，結(jié)果證明包涵體復(fù)性純化法適用于純化低表達(dá)量蛋白，而相比于過柱純化，切膠純化的包涵體蛋白具有良好的抗原結(jié)合性，能夠獲得條帶單一的目的蛋白，純化效果較好。本實(shí)驗(yàn)選擇直接切膠純化。后續(xù)Western blotting 及間接免疫熒光檢測分析結(jié)果表明，N 蛋白與P 蛋白的多克隆抗體可以與SHVV 特異性結(jié)合，特異性良好且N，P 蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。

多克隆抗體成本低、周期短、制備過程簡單、可以識別更多的抗原、提高檢測的靈敏度[20]。目前，已有很多魚類病毒蛋白通過原核表達(dá)并成功構(gòu)建多克隆抗體[21-24]，均為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)資料。本研究制備了針對SHVV-N 及SHVV-P 的多克隆抗體，為建立該病毒免疫學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ)，也期待后續(xù)更深入的研究。