微生物發(fā)酵技術(shù)對(duì)粉葛化學(xué)成分的影響

楊金梅，李冠文，王輝敏，張娜郡，陳 超，孫 杰，秦 楠

（山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619）

粉葛為豆科植物甘葛藤Pueraria thomsoniiBenth.的干燥塊根，具有營(yíng)養(yǎng)獨(dú)特、藥食兼優(yōu)的特點(diǎn)，是國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)收納的藥食同源類(lèi)中藥[1-2]。粉葛具有抗心肌缺血、降血糖、降血脂、解熱、抗病毒等多種藥理作用，其發(fā)揮藥效的主要成分是異黃酮類(lèi)化合物，如葛根素[3-6]。粉葛早期因與野葛在功效、主治上皆相同，故統(tǒng)稱(chēng)作葛根。但隨著研究的不斷深入，粉葛被證明在植物形態(tài)、成分種類(lèi)及含量上均與野葛存在較大差異，如葛根素的含量是葛根的1/8[6-8]。因此，2005 版中華人民共和國(guó)藥典將粉葛與野葛以來(lái)源進(jìn)行區(qū)分，形成粉葛多食用、野葛多藥用的現(xiàn)狀[9]。

微生物發(fā)酵是一種傳統(tǒng)的中藥炮制方法，能夠?qū)χ兴幍男晕豆π?、化學(xué)成分及藥理作用產(chǎn)生影響，具有改變中藥原有性能、增強(qiáng)或產(chǎn)生新的功效、降低毒性等作用[10-11]。經(jīng)微生物發(fā)酵炮制的中藥種類(lèi)繁多，廣泛用于多種疾病的治療。Cao 等[12]通過(guò)發(fā)酵方法降低劇毒類(lèi)生物堿類(lèi)化合物的含量以生產(chǎn)華豐丹藥木；張紅艷等[13]將中藥復(fù)方經(jīng)微生物發(fā)酵后，其活性成分得到增加；Wang 等[14]利用鼠李糖乳桿菌217-1 發(fā)酵使得葛根中葛根素和異黃酮的含量均得到增加；陳艷艷[15]利用釀酒酵母固體粉末發(fā)酵葛根，使葛根黃酮的含量升高41.2%。

目前微生物發(fā)酵技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各研究領(lǐng)域中，但尚未見(jiàn)粉葛微生物發(fā)酵相關(guān)文章的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)選用碳水化合物代謝作用較強(qiáng)的嗜酸乳桿菌為發(fā)酵菌種，首次對(duì)淀粉含量頗高的藥食同源中藥粉葛進(jìn)行微生物發(fā)酵研究。借助響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法優(yōu)化粉葛的發(fā)酵工藝，并對(duì)其發(fā)酵前后主要成分進(jìn)行含量測(cè)定和比較，以探討微生物發(fā)酵技術(shù)對(duì)粉葛中活性成分的作用。進(jìn)一步分析微生物發(fā)酵技術(shù)用于增加粉葛活性成分的可行性，為粉葛資源的充分利用提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粉葛 購(gòu)自山西國(guó)泰中藥股份有限公司，粉碎，過(guò)40 目篩，備用；嗜酸乳桿菌 保藏于山西中醫(yī)藥大學(xué)食品工藝發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，總活菌數(shù)為3×107CFU/mL 的菌液，于4 ℃冰箱中保藏，備用；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品 成都格利普生物科技有限公司，批號(hào)18082401；大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)5160）、大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)5901） 購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品 北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院，批號(hào)20210910；支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)A01N11L129489）、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)S22J12 H137237） 購(gòu)自上海源葉生物有限公司；色譜級(jí)甲醇（批號(hào)204135）、乙腈（批號(hào)201343） 購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；牛肉膏、蛋白胨 購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其余試劑均國(guó)產(chǎn)分析純。

BSP-250 生化培養(yǎng)箱、YXQ-LS-75SII 立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2F 雙人雙面凈化工作臺(tái) 上海書(shū)培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；L-3000 高效液相色譜儀、Ultra-3660 紫外分光光度計(jì) 北京普源精電科技有限公司；BSA-224S-CW 電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SZF-06C 脂肪測(cè)定儀 濟(jì)南精密科學(xué)儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粉葛發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

粉葛飲片→粉碎→過(guò)篩（40 目）→加超純水→高壓滅菌→接入嗜酸乳桿菌菌液→靜置發(fā)酵→干燥（70℃）→粉葛發(fā)酵品

操作要點(diǎn)：菌液制備：按牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，水1000 mL 配制液體培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻，無(wú)菌條件下接入已活化的嗜酸乳桿菌，37 ℃，150 r/min 培養(yǎng)24 h，即得嗜酸乳桿菌菌液，計(jì)數(shù)得總活菌數(shù)為3×107CFU/mL。

粉碎、過(guò)篩：將藥材全部粉碎過(guò)篩，40 目，以增加代表性。

接菌：在無(wú)菌條件下按比例接入嗜酸乳桿菌菌液，搖勻。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 接種量對(duì)葛根素含量的影響 固定料（粉葛粉末）液（蒸餾水）比1:4 g/mL，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時(shí)間36 h，以葛根素含量為指標(biāo)，考察不同接種量（4%、6%、8%、10%、12%）對(duì)發(fā)酵的影響。

1.2.2.2 料液比對(duì)葛根素含量的影響 固定接種量8%，溫度31 ℃，時(shí)間36 h，以葛根素含量為指標(biāo)，考察不同料液比（1:2、1:3、1:4、1:5、1:6 g/mL）對(duì)發(fā)酵的影響。

1.2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)葛根素含量的影響 固定接種量8%，料液比1:4 g/mL，時(shí)間36 h，以葛根素含量為指標(biāo)，考察不同發(fā)酵溫度（27、29、31、33、35 ℃）對(duì)發(fā)酵的影響。

1.2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)葛根素含量的影響 固定接種量8%，料液比1:4 g/mL，溫度31 ℃，以葛根素含量為指標(biāo)，考察不同發(fā)酵時(shí)間（12、24、36、48、60 h）對(duì)發(fā)酵的影響。

1.2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以Box-Behnken 為原理，葛根素含量為響應(yīng)值，接種量、料液比、發(fā)酵時(shí)間為影響因素，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素和水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface factor and level design

1.2.4 粉葛發(fā)酵前后水分、灰分測(cè)定 水分含量測(cè)定參照GB 5009.3-2016 食品中水分的測(cè)定；灰分含量測(cè)定參照GB 5009.4-2016 食品中灰分的測(cè)定。

1.2.5 粉葛發(fā)酵前后葛根素、大豆苷元、大豆苷含量測(cè)定

1.2.5.1 色譜條件 Compass C18（2）（250×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～30 min，24% A；30～60 min，60% A）。檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)時(shí)間60 min[16]。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱(chēng)取葛根素、大豆苷、大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品適量，50%乙醇溶解，得0.2 mg/mL 大豆苷、大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.4 mg/mL 葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取各標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋制得系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，0.45 μm 微孔濾器過(guò)濾，參照1.2.5.1 色譜條件。分別以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得葛根素線性回歸方程：y=31848x-129.83（R2=0.9992），大豆苷元線性回歸方程：y=49.71x-49.798（R2=0.9994），大豆苷線性回歸方程：y=32.096x-149.36（R2=0.9993），表明葛根素在0.1～0.22 mg/mL、大豆苷元在4～64 μg/mL、大豆苷在8～80 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好。

1.2.5.3 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取樣品粉末0.5 g（40 目），加20 mL 50%乙醇，稱(chēng)重，70 ℃加熱提取50 min，冷卻，稱(chēng)重，補(bǔ)足減失重量，搖勻，過(guò)濾，0.45 μm微孔濾器過(guò)濾，即得供試品溶液。

1.2.6 總異黃酮含量測(cè)定

1.2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備同1.2.5.2，稀釋得系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。以50%乙醇為空白溶液，250 nm 處測(cè)定吸光度[17]。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程：y=0.0382x+0.1101（R2=0.9995），表明葛根素在2～20 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.6.2 供試品溶液制備 供試品溶液制備同1.2.5.3。

1.2.7 可溶性多糖含量測(cè)定

1.2.7.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱(chēng)取適量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，以水配制0.5 g/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋得系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。采用苯酚-濃硫酸法顯色[18]，于490 nm 處測(cè)定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程：y=0.0376x+0.0948（R2=0.9992），表明葡萄糖在2.5～15 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.7.2 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取樣品粉末各2.0 g，加80 mL 水，80 ℃超聲提取30 min，共兩次，過(guò)濾，合并濾液，濃縮，按體積1:3 加95%乙醇，低溫靜置24 h，離心，沉淀加水復(fù)溶，過(guò)濾，50 mL 容量瓶定容，即得供試品溶液。

1.2.8 總淀粉含量測(cè)定

1.2.8.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 分別精密稱(chēng)取直鏈、支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品適量，10 mL 1 mol/L 氫氧化鉀溶液沸水浴溶解，冷卻，超純水定容，得1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.8.2 選擇測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng) 精密移取2 mL直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液、5 mL 支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于50 mL 容量瓶中，參照崔晉和趙璇等[19-20]方法測(cè)定直鏈和支淀粉吸收曲線。根據(jù)等吸收點(diǎn)作圖法，確定直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)和參照波長(zhǎng)；支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)和參照波長(zhǎng)。

1.2.8.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參照1.2.8.2 稀釋各標(biāo)準(zhǔn)溶液得各系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，以超純水為空白溶液，于λ1和λ2測(cè)定直鏈淀粉吸光度值A(chǔ)1和A2；λ3和λ4測(cè)定支鏈淀粉吸光度值A(chǔ)3和A4。以直鏈淀粉濃度為橫坐標(biāo)，A1-A2為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程為：y=0.0061x-0.0779（R2=0.9992），表明直鏈淀粉在60～120 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以支鏈淀粉濃度為橫坐標(biāo)，A3-A4為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程為：y=0.0018x+0.0458（R2=0.999），表明支鏈淀粉在80～140 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.8.4 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取樣品粉末各3.0 g，干燥至恒重，計(jì)算含水量W1。干燥后的樣品，以80 mL 石油醚為溶劑，加熱回流4 h，以85%乙醇為溶劑，繼續(xù)回流4 h，干燥至恒重，計(jì)算糖脂比W2。精密稱(chēng)取脫脂脫糖樣品0.1 g，參照1.2.8.1 制備供試品溶液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26.0 分析數(shù)據(jù)，Graphpad prism v6.01作圖。Design-Expert.V8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)及繪圖。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 接種量對(duì)葛根素含量的影響 接種量與發(fā)酵基質(zhì)中菌種的繁殖速度密切相關(guān)，適宜接種量不僅可以縮短發(fā)酵時(shí)間，提高發(fā)酵速率，而且對(duì)于發(fā)酵基質(zhì)的狀態(tài)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量存在調(diào)控作用[21]。如圖1 所示，隨著接種量的增大，葛根素含量先上升后下降，于6%時(shí)達(dá)到最大值，為5.75 mg/g。當(dāng)其他因素固定時(shí)，菌種接入比例增大，會(huì)使發(fā)酵基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量減少。當(dāng)接種量大于6%時(shí)，發(fā)酵基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏，菌株之間接觸抑制增強(qiáng)，不利于葛根素生成[15]。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，與其他組相比，當(dāng)接種量為6%時(shí)，葛根素含量變化具有顯著性（P＜0.05）。因此，選擇最適接種量為6%。

圖1 接種量對(duì)葛根素含量的影響Fig.1 Effect of inoculation amount on puerarin content

2.1.2 料液比對(duì)葛根素含量的影響 料液比會(huì)對(duì)發(fā)酵底物濃度產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響發(fā)酵效率[22]。如圖2 所示，隨著料液比的增大，葛根素的含量先上升后下降，于1:3 g/mL 時(shí)達(dá)到最大值，為5.38 mg/g。水量增加能促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶出，有助于菌種生長(zhǎng)繁殖。但水量持續(xù)增加會(huì)稀釋營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不利于菌種吸收利用，減慢代謝產(chǎn)物積累。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，與其他組相比，當(dāng)料液比為1:3 g/mL 時(shí)，葛根素含量變化具有顯著性（P＜0.05）。因此，選擇最適料液比為1:3 g/mL。

圖2 料液比對(duì)葛根素含量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on puerarin content

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)葛根素含量的影響 發(fā)酵溫度對(duì)菌種的活性具有不同程度的影響作用。溫度偏高或偏低均不利于菌種生長(zhǎng)[23]。如圖3 所示，隨著溫度的升高，葛根素含量先上升后下降，29 ℃時(shí)達(dá)到最大值（為5.51 mg/g），與宋艷秋等[24]微生物轉(zhuǎn)化葛根素的溫度（28 ℃）相接近。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，與31 ℃、33 ℃發(fā)酵條件相比，當(dāng)發(fā)酵溫度為29 ℃時(shí)，葛根素含量變化不具有顯著性（P＞0.05）。因此，固定發(fā)酵粉葛的最適溫度為29 ℃，響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)中不做考察。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)葛根素含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on puerarin content

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)葛根素含量的影響 發(fā)酵時(shí)間對(duì)葛根素含量的影響如圖4 所示。在12～36 h 發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，葛根素含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且于36 h 時(shí)達(dá)到最大值，為5.78 mg/g。之后隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵基質(zhì)中有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能限制菌種生長(zhǎng)和代謝，不利于葛根素生成，使葛根素含量下降。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，與其他組相比，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為36 h 時(shí)，葛根素含量變化具有顯著性（P＜0.05）。因此，選擇最適發(fā)酵時(shí)間為36 h，與倪以宇等[25]利用混合乳酸菌發(fā)酵葛根-枳椇子藥對(duì)的時(shí)間相一致。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)葛根素含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on puerarin content

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型及方差分析 通過(guò)對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果（表2）進(jìn)行方差分析及回歸模型預(yù)測(cè)，得葛根素的含量（y）與接菌量（A）、料液比（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）的二次回歸模型：

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and result

如表3 所示，模型P=0.0250，＜0.05，差異顯著，失擬項(xiàng)P=0.0528，＞0.05，差異不顯著性，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.8612，均表明模型可靠，與實(shí)際情況擬合度良好，可以用來(lái)描述各因素與葛根素含量之間的關(guān)系。各因素對(duì)葛根素含量的影響順序：A＞B＞C，即接種量＞料液比＞發(fā)酵時(shí)間，其中接種量對(duì)葛根素含量的影響作用具有顯著性（P＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Regression model variance analysis table

2.2.2 響應(yīng)曲面圖和等高線圖 為進(jìn)一步確定接種量、料液比、發(fā)酵時(shí)間對(duì)葛根素含量的影響，固定其中任一因素的水平為零，通過(guò)回歸方程分析，得另外兩因素交互作用的響應(yīng)曲面圖及等高線圖[26]。響應(yīng)曲面坡度越陡，等高線越趨于橢圓形、密度越大，說(shuō)明兩個(gè)因素的交互作用越明顯[20]。如圖5 所示，接種量與料液比、發(fā)酵時(shí)間與接種量、料液比與發(fā)酵時(shí)間之間對(duì)葛根素含量均存在一定交互作用，且葛根素含量在各因素的水平范圍內(nèi)均存在最大值。但等高線圖密度均不大，影響不具顯著性（P＜0.05）[27]。

圖5 接種量、料液比、發(fā)酵時(shí)間對(duì)葛根素含量的響應(yīng)曲面圖及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of inoculation amount, solid-liquid ratio and fermentation time on puerarin content

2.2.3 優(yōu)化及驗(yàn)證 粉葛發(fā)酵的最優(yōu)工藝：接種量4.84%（V/V），料液比1:3.14 g/mL，發(fā)酵時(shí)間36.44 h，葛根素含量的預(yù)測(cè)值為8.2092 mg/g。為方便實(shí)驗(yàn)室操作，將發(fā)酵條件調(diào)整為：接種量5%，料液比1:3 g/mL，發(fā)酵時(shí)間為36 h。在此條件下進(jìn)行三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到葛根素含量為8.1854±0.02 mg/g，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為0.29%，表明優(yōu)化結(jié)果穩(wěn)定可靠，可行性高。如圖6 所示，同等條件下，發(fā)酵后粉葛顏色較發(fā)酵前深，顆粒感明顯。

圖6 發(fā)酵前、后粉葛粉末Fig.6 Puerariae thomsonii powder before and after fermentation

2.3 成品主要指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.3.1 水分、灰分 2020 版《中國(guó)藥典》中規(guī)定粉葛及其炮制品的水分含量不得超過(guò)12.0%，灰分含量不得超過(guò)5.0%。如表4 所示，發(fā)酵前、后粉葛中水分和灰分的含量均符合規(guī)定。

表4 發(fā)酵前、后粉葛中水分、灰分測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 4 Determination results of moisture and ash in Pueraria thomsonii before and after fermentation (n=3)

2.3.2 葛根素、大豆苷、大豆苷元 如圖7 色譜圖和表5 所示，與發(fā)酵前粉葛相比，發(fā)酵后粉葛中大豆苷元、大豆苷、葛根素含量均增加，且分別為發(fā)酵前粉葛的1.727 倍、1.726 倍、1.685 倍，差異均具有顯著性（P＜0.05）。葛根素的增加倍數(shù)與杜靜等[28]利用冠突散囊菌雙向發(fā)酵葛根之結(jié)果（1.6 倍）接近。其中大豆苷元的含量增加較多，可能是因?yàn)榇蠖管赵獙儆诋慄S酮苷元，在發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)先生成，異黃酮苷（大豆苷、葛根素）后生成。大豆苷的生成量大于葛根素，可能是因?yàn)槠咸烟桥c苯環(huán)上的羥基脫水縮合的作用大于苯環(huán)上的氫鍵[29-30]。

圖7 發(fā)酵前、后粉葛中異黃酮類(lèi)成分HPLC 圖Fig.7 HPLC diagrams of isoflavones in Puerariae thomsonii before and after fermentation

2.3.3 總異黃酮 如表5 所示，與發(fā)酵前粉葛相比，發(fā)酵后粉葛中總異黃酮含量增至33.26 mg/g，是發(fā)酵前粉葛的1.295 倍，差異具有顯著性（P＜0.01）。這與倪以宇等[25]利用植物乳桿菌和副干酪乳桿菌混合發(fā)酵葛根-枳椇子藥對(duì)時(shí)異黃酮含量顯著增多之結(jié)果相一致。

表5 發(fā)酵前、后粉葛中異黃酮類(lèi)成分含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 5 Determination results of isoflavone content in Puerariae thomsonii before and after fermentation (n=3)

2.3.4 可溶性多糖 如表6 所示，與發(fā)酵前相比，發(fā)酵后粉葛中可溶性多糖含量增至12.6%，是發(fā)酵前粉葛的5.101 倍，差異具有顯著性（P＜0.01），與柴小濤[31]利用食藥性真菌-金耳雙向發(fā)酵葛根得葛根多糖含量下降之結(jié)果相反?？赡苁且?yàn)槿樗釛U菌是一類(lèi)碳水化合物代謝作用較強(qiáng)的益生菌，在發(fā)酵過(guò)程中以淀粉為碳源，代謝產(chǎn)生游離葡萄糖或小分子葡萄糖聚合物，增加了可溶性多糖的含量[32-33]。

表6 粉葛發(fā)酵前、后可溶性多糖及淀粉含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 6 Determination results of soluble polysaccharides and starch contents in Puerariae thomsonii before and after fermentation (n=3)

2.3.5 總淀粉 如圖8 所示，直鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)λ1=600 nm，參照波長(zhǎng)λ2=422 nm；支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)λ3=536 nm，參照波長(zhǎng)λ4=700 nm。測(cè)得結(jié)果如表6 所示，與發(fā)酵前相比發(fā)酵后粉葛中直鏈淀粉和總淀粉含量均減少，減至6.44%、7.42%，分別減少至0.778 倍、0.896 倍，差異具有顯著性（P＜0.01）。發(fā)酵前粉葛中支鏈淀粉的含量可能受到高含量直鏈淀粉影響而不利于檢出[34]，推測(cè)其含量可能未達(dá)到團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/GXAS 222-2021 中檢出限（0.1 g/100 g）。發(fā)酵后粉葛中支鏈淀粉的含量增至0.98%，可能是直鏈淀粉在嗜酸乳桿菌的作用下轉(zhuǎn)化為支鏈淀粉，使其含量增加。通過(guò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，總淀粉含量與可溶性多糖含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，此結(jié)論與岳世彥等[35]和張應(yīng)等[36]的研究結(jié)果相一致。

圖8 直鏈、支鏈淀粉紫外吸收光譜圖Fig.8 UV absorption spectra of amylose and amylopectin

3 結(jié)論

通過(guò)微生物發(fā)酵技術(shù)可提高粉葛中活性成分含量，發(fā)酵最優(yōu)工藝為：接種量5%，料液比1:3 g/mL，發(fā)酵時(shí)間36 h，發(fā)酵溫度29 ℃。在此發(fā)酵條件下所得粉葛中大豆苷元、大豆苷、葛根素、總異黃酮、可溶性多糖、總淀粉含量分別為0.38 mg/g、1.45 mg/g、8.17 mg/g、33.26 mg/g、12.6%、7.42%，是發(fā)酵前（0.22 mg/g、0.84 mg/g、4.85 mg/g、25.68 mg/g、2.47%、8.28% ）的1.727、1.726、1.685、1.295、5.101、0.896倍。借助微生物發(fā)酵技術(shù)可不同程度增加粉葛中活性成分含量，這與陳艷艷[15]、宋艷秋等[24]、倪以宇等[25]發(fā)酵葛根的結(jié)果趨于一致，表明利用微生物發(fā)酵粉葛提高活性成分含量具有一定可行性。粉葛中異黃酮等活性成分含量增加，可開(kāi)拓粉葛相關(guān)功能性產(chǎn)品及保健品市場(chǎng)，促進(jìn)粉葛產(chǎn)業(yè)發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)在粉葛發(fā)酵工藝研究過(guò)程中，僅選用一種益生菌（嗜酸乳桿菌），并未考慮菌種篩選及菌種間復(fù)配對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，可能沒(méi)有最大程度增加粉葛中活性成分含量。因此，實(shí)驗(yàn)后期將對(duì)粉葛發(fā)酵菌種進(jìn)行篩選，并進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌種復(fù)配實(shí)驗(yàn)，選擇最優(yōu)菌種、最佳復(fù)配比發(fā)酵粉葛，以期更大程度增加粉葛中活性成分含量。