基于HS-SPME-GC-MS 技術(shù)的不同品種（系）橄欖香氣成分研究

鄭宗昊，張向爭(zhēng)，傅芳浩，孫 興，潘騰飛，郭志雄，佘文琴,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350022；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮研究所，福建 福州 350002）

橄欖作為福建省特色的經(jīng)濟(jì)水果之一[1]，主要分布于福州閩清、閩侯，莆田城廂、仙游，漳州漳浦、詔安、長泰、華安和寧德福安等地。其中，福州地區(qū)栽培的品種有‘檀香’、‘長營’、‘清欖1 號(hào)’、‘梅埔2 號(hào)’、‘靈峰’、‘惠圓’等；莆田地區(qū)栽培的品種有‘霞溪本’和‘劉族本’等。香氣是客觀反映果實(shí)風(fēng)味、成熟度和果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)，果品怡人的香氣也是吸引消費(fèi)者和增強(qiáng)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的重要因素。隨著國內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)果品品質(zhì)要求越來越高，以及食品工業(yè)對(duì)天然風(fēng)味物質(zhì)需求的增加，果品的香氣研究日益受到關(guān)注，已成為果品品質(zhì)的重要研究領(lǐng)域之一[2-3]。

果實(shí)香氣富集方法包括同時(shí)蒸餾萃取法（SED）[4]、固相微萃取法（SPME）[5]和頂空法（HS）[6]等。頂空固相微萃取作為一種氣相色譜的無溶劑萃取技術(shù)，具有操作簡單、富集率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，也可以更加準(zhǔn)確、真實(shí)地反映香氣成分的組成狀況[7-8]。鐘明等[9-10]采用固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對(duì)廣東的‘冬節(jié)圓’和‘三棱欖’果實(shí)揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行分析，趙麗娟等[11]采用同時(shí)蒸餾萃取裝置并用GC-MS 分別對(duì)橄欖中的橄欖肉和橄欖仁的揮發(fā)油進(jìn)行提取和鑒定，方麗娜等[12]同樣采用了SPME-GC-MS 對(duì)福建閩侯的‘長營’果實(shí)的香氣進(jìn)行檢測(cè)分析，賴聯(lián)瑞等[13]采用頂空固相微萃取對(duì)福州的‘清欖1 號(hào)’、‘閩清2 號(hào)’及‘靈峰’果實(shí)進(jìn)行檢測(cè)，前人的研究結(jié)果表明石竹烯是橄欖果實(shí)香氣物質(zhì)中含量最高且穩(wěn)定的物質(zhì)，烯烴類物質(zhì)占大多數(shù)，并且可以通過香氣活性值確定各組分對(duì)其整體香氣的貢獻(xiàn)度[14]，從而精確其有效香氣組成結(jié)構(gòu)。目前，關(guān)于橄欖果實(shí)香氣成分的研究主要集中于福建、廣東等地的橄欖品種香氣成分，然而，關(guān)于多個(gè)橄欖品種（系）研究與橄欖果實(shí)香氣物質(zhì)香氣活性值的相關(guān)報(bào)道較少。

本研究采用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)并在9 個(gè)不同品種（系）橄欖果肉中加入葵酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)，分析橄欖果實(shí)中香氣化合物的組成及含量，同時(shí)計(jì)算香氣活性值，利用熱圖分析與主成分分析探究不同橄欖品種（系）香氣成分組成特征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘惠圓’、‘揭西香欖’，‘檀香’、‘長營’、‘梅埔2 號(hào)’、‘靈峰’、‘清欖1 號(hào)’，‘劉族本’和‘霞溪本’ 分別于2020 年10 月至2020 年12 月采自福州市農(nóng)科所、閩清、莆田等地，每個(gè)品種選擇長勢(shì)一致，無病蟲害的果樹。采果時(shí)沿樹冠東西南北方位取大小適中、均勻一致，無病蟲、無損傷且成熟度為九成熟的果實(shí)，每個(gè)品種設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)品種一次共取30 個(gè)果實(shí)。取回實(shí)驗(yàn)室后清洗、削皮后果肉切塊混樣處理之后用錫箔紙包裹，液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；癸酸乙?98%色譜純，美國Sigma 公司；飽和氯化鈉 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

萃取纖維頭50/30 μmDVB/CAR/PDMS 美國Supelco 公司；手持SPME 進(jìn)樣器 上海洽姆分析技術(shù)有限公司；GC680+SQ8T+HS40 GC-MS 氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Perkin Elme 公司；MM400 型磨樣機(jī) 德國萊馳公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 取出樣品放入液氮盒中，以磨樣機(jī)（28 Hz，45 s）磨成粉末。取1 g 磨好的樣品放入頂空萃取瓶中，以濃度為100 μg/mL 癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，加入1 mL 飽和氯化鈉進(jìn)行混合并加入6 μL 癸酸乙酯，再將瓶口密閉，隨后插入萃取針并將萃取瓶放置30 ℃水浴鍋中萃取90 min。隨后上機(jī)進(jìn)樣熱脫附4 min。

1.2.2 GC-MS 分析條件 參照方麗娜等[12]的GC-MS方法并加以優(yōu)化，對(duì)不同品種（系）橄欖進(jìn)行香氣測(cè)定。

1.2.2.1 色譜條件 FFAP-5MS；載氣為99.99%氦氣，壓力100 kPa；分流比10:1；柱箱溫度50 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，柱流量1 mL/min；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持2 min；以5 ℃/min 升至150 ℃，保持5 min；以10 ℃/min 升至230 ℃，保持5 min。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源；接口溫度250 ℃；開始時(shí)間1.1 min，結(jié)束時(shí)間48 min；質(zhì)量掃描范圍50～620 m/z。

1.2.3 定性與定量分析

1.2.3.1 定性分析 在GC-MS 條件下，測(cè)得橄欖香氣成分GC-MS 總離子流色譜圖。將質(zhì)譜圖NIST 11.L 與質(zhì)譜庫Wiley 7 相匹配，以匹配度前五的物質(zhì)為鑒定依據(jù), 并參照每種香氣成分的CAS 編號(hào)，再根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行定性。

1.2.3.2 定量分析 通過與內(nèi)標(biāo)物（癸酸乙酯）的峰面積比較，得到香氣成分的含量，單位為μg/g，即：香氣成分含量=（香氣成分物質(zhì)峰面積×內(nèi)標(biāo)物含量）與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比。

1.2.4 OAV 值分析 通過查閱文獻(xiàn)報(bào)道的香氣組分在水介質(zhì)中的氣味閾值[15]，再通過香氣組分在橄欖中的含量，計(jì)算得到部分香氣組分在橄欖果實(shí)中的OAV（即香氣成分的含量與香氣成分閾值之比）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行單因素分析；使用TBtools[16]軟件繪制熱圖；使用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行PCA[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣成分的定性定量分析

如表1 所示，本研究參試的‘檀香’、‘長營’、‘梅埔2 號(hào)’等9 種橄欖中共檢測(cè)出56 個(gè)香氣組分，包括烯烴類33 種、苯環(huán)類5 種、醇類7 種、醛類3 種、萘類4 種、醚類1 種、酚類1 種、酮類1 種以及脂類1 種，其中烯烴類占總香氣成分的78.51%～89.34%，酚類占0.74%～10.65%，醛類占0.18%～0.89%，苯環(huán)占3.28%～8.06%，醇類占0.16%～4.89%，醚類占0.02%～0.24%，萘類占0.86%～7.39%。檢測(cè)出的烯烴類含量最高并且在每種橄欖中都能穩(wěn)定存在。其中石竹烯的含量最高，占總香氣成分的23.79%～57.01%，與前人對(duì)‘長營’、‘清欖1 號(hào)’、‘靈峰’、‘閩清2 號(hào)’等橄欖果實(shí)的研究結(jié)果相似[9-13]。

表1 不同品種（系）橄欖的香氣成分Table 1 The aroma components of Canarium album of different cultivars

9 種橄欖品種的共有香氣成分為15 種，相互結(jié)合形成了橄欖的基本香氣，其中含量較多的有α-蒎烯、石竹烯、β-蒎烯、α-石竹烯、α-古巴烯、（-）-α-蓽澄茄油烯、百里香酚、（1S,8aR）-1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,3,5,6,8a-六氫萘等。雖然9 種橄欖香氣組成成分差異不大，但香氣成分含量有較大的差異，以‘清欖1 號(hào)’總香氣成分含量為最高，‘劉族本’總香氣成分含量為最低。不同品種（系）橄欖香氣特征，與香氣組分及其含量上的差異具有密切聯(lián)系。

2.2 香氣成分的熱圖分析

從果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)在一定程度上受香氣組分含量和比例結(jié)構(gòu)的影響，特別是香氣組分構(gòu)成的轉(zhuǎn)變對(duì)香氣品質(zhì)的形成更為重要[18]。從圖1 可以看出，9 個(gè)不同品種（系）鮮食橄欖果實(shí)的香氣組分和含量豐富，無論在組成種類、含量、占有比例、特有成分等方面都存在較大差異。

圖1 不同品種（系）橄欖果實(shí)香氣成分含量的熱度圖Fig.1 Heat map of the contents of aroma components in Canarium album of different cultivars

從‘清欖1 號(hào)’中共檢測(cè)出38 種香氣成分，包括25 種烯烴類、3 種芳香類、3 種醛類、1 種酚類、4 種醇類、1 種萘類和1 種酮類。該品種香氣種類和總香氣成分含量明顯高于其他品種（系），且烯烴類占總香氣成分的86.19%。該品種（系）中α-蒎烯、γ-欖香烯、大根香葉烯B、月桂烯、氧化石竹烯、龍腦烯醛、二氫-β-紫羅蘭酮、δ-欖香烯等成分的含量明顯高于其他品種（系）。本研究檢測(cè)的9 品種（系）大多是以石竹烯為主，總香氣成分含量0.817～4.650 μg/g 之間，占總香氣成分的23.79%～57.01%之間，但‘清欖1 號(hào)’中香氣含量最高的是α-蒎烯，含量達(dá)6.133 μg/g，占該品種總香氣含量的32.37%，而石竹烯為4.650 μg/g，占該品種（系）總香氣含量的24.54%。

從‘檀香’中檢測(cè)出共33 種香氣成分，包括21 種烯烴類、3 種苯環(huán)類、1 種醛類、1 種酚類、6 種醇類和1 種萘類，該品種（系）中烯烴類物質(zhì)占總香氣成分的78.13%，其中石竹烯含量為4.498 μg/g，占總香氣成分的43.31%?！聪恪械拇碱惡渴潜狙芯恐袡z測(cè)出最多的品種（系），含量為0.470 μg/g，占該品種（系）總香氣成分的4.89%。其中4-萜烯醇、桉樹醇等醇類物質(zhì)含量顯著高于其他品種（系）。

‘長營’中檢測(cè)出共26 種香氣成分包括18 種烯烴類、2 種苯環(huán)類、2 種醛類、1 種酚類、2 種醇類和1 種萘類，該品種（系）中烯烴類物質(zhì)占總香氣成分的89.34%，其中石竹烯含量為4.056 μg/g，占總香氣成分的37.08%，與前人的研究結(jié)果相近[12]。

‘梅埔2 號(hào)’中檢測(cè)出共25 種香氣成分包括16 種烯烴類、2 種苯環(huán)類、2 種醛類、1 種酚類、3 種醇類和1 種萘類?！菲? 號(hào)’中烯烴類物質(zhì)占總香氣成分的88.25%，其中石竹烯含量為3.621 μg/g，占總香氣成分的57.01%，是本研究中石竹烯含量占比最高的品種（系）。

‘揭西香榔’中檢測(cè)出共31 種香氣成分包括22 種烯烴類、2 種苯環(huán)類、2 種醛類、1 種酚類、3 種醇類、1 種萘類。該品種（系）中烯烴類物質(zhì)占總香氣成分的83.32%，其中石竹烯含量為3.456 μg/g，占總香氣成分的25.47%。‘揭西香欖’中的γ-沐蘿烯和姜烯含量顯著高于其他品種（系）。

‘靈峰’中檢測(cè)出共31 種香氣成分包括20 種烯烴類、2 種苯環(huán)類、1 種醛類、1 種酚類、3 種醇類、3 種萘類化合物以及1 種醚類化合物。該品種（系）中烯烴類物質(zhì)占總香氣成分的84.67%，其中石竹烯含量為3.159 μg/g，占總香氣成分的26.98%?！`峰’中的檜烯含量為2.713 μg/g，占總香氣成分的23.17%，且該品種中依蘭烯、β-古巴烯、水芹烯、α-松油烯等香氣物質(zhì)的含量顯著高于（P＜0.05）其他品種（系）。

‘霞溪本’中檢測(cè)出共33 種香氣成分包，括20 種烯烴類、2 種苯環(huán)類、2 種醛類、1 種酚類、3 種醇類、4 種萘類和1 種脂類化合物。該品種（系）中烯烴類物質(zhì)占總香氣成分的78.51%，其中石竹烯含量為4.156 μg/g，占總香氣成分的23.79%。本研究中‘霞溪本’香氣物質(zhì)的總含量僅次于清欖1 號(hào)，其中α-古巴烯、1,2,4a,5,6,8a-六氫-4,7-二甲基-1-（1-甲基乙基）萘、（+）-環(huán)苜蓿烯等香氣物質(zhì)的含量顯著高于（P＜0.05）其他品種（系）。

‘劉族本’中檢測(cè)出25 種香氣成分包括15 種烯烴類、3 種苯環(huán)類、2 種醛類、1 種酚類、2 種醇類、1 種萘類以及1 種醚類化合物。該品種（系）中烯烴類物質(zhì)占總香氣成分的85.33%，其中石竹烯含量為0.817 μg/g，占總香氣成分的30.52%?！畡⒆灞尽潜狙芯恐袦y(cè)檢出香氣的總香氣成分含量最低的品種（系），僅為2.767 μg/g。

‘惠圓’中檢測(cè)出共種香氣成分包括共24 種香氣成分包括15 種烯烴類、2 種苯環(huán)類、2 種醛類、1 種酚類、2 種醇類以及2 種萘類化合物，該品種（系）中烯烴類物質(zhì)占總香氣成分的89.11%，其中石竹烯含量為2.082 μg/g，占總香氣成分的48.03%。‘惠圓’中的D-檸檬烯含量為0.495 μg/g，是本研究中含量最高的品種（系）。

上述品種共檢測(cè)出56 種香氣化合物，均以烯烴類物質(zhì)為主要的香氣物質(zhì)，其中石竹烯是這些品種中含量最高且穩(wěn)定存在的香氣物質(zhì)。結(jié)果可為后續(xù)橄欖果實(shí)香氣物質(zhì)代謝物相關(guān)基因的挖掘與功能分析提供參考。

2.3 不同品種橄欖香氣成分的OAV 分析

根據(jù)定性定量結(jié)果對(duì)橄欖進(jìn)行OAV 分析。通過計(jì)算OAV 值來評(píng)價(jià)單個(gè)香氣組分對(duì)果實(shí)及其他物種上整體香氣的貢獻(xiàn)度[19]，通常認(rèn)為，大部分具有揮發(fā)性的物質(zhì)并無氣味，不能構(gòu)成果實(shí)的特征香氣，只有香氣活性組分才對(duì)香氣具有顯著貢獻(xiàn)[20]，香氣活性值常用于確定特征香氣組分[21]，OAV＞1 時(shí)認(rèn)為該香氣組分對(duì)果實(shí)香氣具有一定影響性，OAV＞10 時(shí)認(rèn)為該香氣組分對(duì)香氣整體貢獻(xiàn)極大[22-24]。如表2所示，共篩選出20 個(gè)物質(zhì)的OAV 值，其中OAV＞1的共有13 個(gè)，且不同品種橄欖香氣成分在OAV 值存在明顯差異。

表2 不同品種（系）橄欖香氣成分的OAV 值Table 2 OAV values of aroma components in Canarium album of different cultivars

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)及前人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石竹烯在所有橄欖品種（系）和資源果實(shí)中均作為主要香氣組分存在，并且在各個(gè)品種中石竹烯的香氣貢獻(xiàn)程度較大，但均不是貢獻(xiàn)度最高的揮發(fā)性物質(zhì)，因此認(rèn)為石竹烯是橄欖果實(shí)主要的香氣特征之一。

‘清欖1 號(hào)’中OAV＞1 的香氣成分有8 種，認(rèn)為它們構(gòu)成清欖1 號(hào)的基本香氣特征。OAV＞10 的香氣成分有5 種，其中α-蒎烯香氣強(qiáng)度高（OAV＞1000），β-蒎烯也有較高的香氣強(qiáng)度（OAV＞100）與其他品種相比差異明顯，因此認(rèn)為蒎烯是‘清欖1 號(hào)’中香氣的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)，前人對(duì)蒎烯化合物在其他物種上香氣描述為木香、甜香及松油香型[25-26]；‘檀香’中OAV＞1 的香氣成分有6 種，認(rèn)為它們構(gòu)成‘檀香’的基本香氣特征。其中OAV＞10 的香氣成分有3 種。除了烯烴類物質(zhì)還有一種醇類化合物4-萜烯醇OAV＞1，并且是9 個(gè)品種中最高的，前人對(duì)4-萜烯醇的香氣描述為胡椒氣息[27]。相較于大多數(shù)品種檀香中蒎烯化合物的OAV 值小，因此這些差異可能是形成‘檀香’果實(shí)風(fēng)味特殊的原因；‘劉族本’和‘惠圓’中OAV＞1 的香氣成分有5 和6 種，這兩個(gè)品種（系）主要香氣物質(zhì)（OAV＞10）的OAV 值差異不大。在兩個(gè)品種（系）中D-檸檬烯的OAV 值明顯高于其他品種（系），因此認(rèn)為D-檸檬烯是這兩個(gè)品種（系）主要香氣物質(zhì)，前人對(duì)檸檬烯的香味描述為檸檬香[27-28]。值得注意的是這兩個(gè)品種（系）中蒎烯的貢獻(xiàn)程度較其他品種（系）不高。

各個(gè)品種（系）檢測(cè)出α-蒎烯和β-蒎烯的差異較明顯，但在各個(gè)品種中α-蒎烯的香氣貢獻(xiàn)程度極大，有5 個(gè)品種的OAV＞100，因此認(rèn)為α-蒎烯是大多數(shù)橄欖果實(shí)最主要的香氣特征物質(zhì)。β-蒎烯在各個(gè)品種中的貢獻(xiàn)程度差異較為顯著，在9 個(gè)品種中有6 個(gè)品種的OAV＞10，其中劉族本＜1。相較于α-蒎烯，β-蒎烯的在橄欖果實(shí)中的香氣貢獻(xiàn)程度較低。在特殊香氣分類方面，果實(shí)香氣類型通?？煞譃楣阈?、木香型和醛香型等幾種，周如雋[26]、張海朋[29]等對(duì)蒎烯類揮發(fā)性物質(zhì)香氣描述為清新清香、木香、甜香型，α-蒎烯是本研究中OAV 最高的，即香氣貢獻(xiàn)程度最高的揮發(fā)性物質(zhì)，因此橄欖果實(shí)烯烴類香氣主要成分所表現(xiàn)出來香氣風(fēng)味為木香、甜香型，可能是形成橄欖鮮食初苦澀后回甘清甜實(shí)際感官效果[30]的原因之一。

2.4 不同品種橄欖香氣的主成分分析

主成分分析是一種可直觀反映樣本成分構(gòu)成近似度的統(tǒng)計(jì)方法，樣本間的相似度越高則距離越近。如圖2 所示，9 個(gè)不同品種（系）橄欖的香氣成分在得分散點(diǎn)圖上實(shí)現(xiàn)了品種的區(qū)分，從圖中可以清晰地看到‘清欖1 號(hào)’和‘霞溪本’與其他品種存在較為明顯的差異，‘惠圓’與‘劉族本’兩個(gè)品種（系）間存在較高的相似度，其余品種（系）間的相似度并不高。主成分分析結(jié)果表明本次檢測(cè)出的香氣成分用于不同品種（系）橄欖的香氣特征的分析具有可行性。

圖2 不同橄欖品種（系）香氣成分主成分得分圖Fig.2 Principal component score of aroma components of Canarium album of different cultivars

結(jié)合香氣活性值和主成分分析的結(jié)果可以將這9 個(gè)品種橄欖香氣分為2 種類型，其中‘清欖1 號(hào)’、‘揭西香欖’、‘霞溪本’、‘長營’在香氣類型上表現(xiàn)出明顯的松油香及木香，主成分分析表明‘清欖1 號(hào)’明顯有別于其他品種（系），可能是‘清欖1 號(hào)’中含有貢獻(xiàn)度較高的α-蒎烯及β-蒎烯；‘檀香’、‘梅埔2 號(hào)’、‘靈峰’、‘劉族本’和‘惠圓’這些品種表現(xiàn)出的松油香及木香相對(duì)不明顯。值得注意的是‘劉族本’與‘惠圓’兩個(gè)品種（系）蒎烯的OAV 相較其他品種不高，D-檸檬烯的OAV 高于其他品種，因此這兩個(gè)品種（系）在風(fēng)味上與其他品種存在一定的差別，香氣類型上表現(xiàn)出更高的甜香及檸檬香。

3 結(jié)論

9 個(gè)品種（系）鮮食橄欖果實(shí)共檢測(cè)出56 種香氣化合物，均以烯烴類物質(zhì)為主要的香氣物質(zhì)，且占各個(gè)品種（系）總香氣成分含量的78.51%～89.34%，其中石竹烯是這9 個(gè)品種中含量最高且穩(wěn)定存在的香氣物質(zhì)。因此，烯烴類化合物是構(gòu)成橄欖果實(shí)香氣組分基本骨架的主要物質(zhì)，與前人的結(jié)論相同。9 個(gè)不同品種（系）橄欖果實(shí)的香氣組成成分和含量豐富，根據(jù)香氣活性值可得，蒎烯是構(gòu)成這9 個(gè)品種（系）橄欖果實(shí)香氣特征的重要成分，香氣類型上表現(xiàn)為木香、甜香型。不同橄欖品種（系）在香氣物質(zhì)、物質(zhì)含量間存在差異,結(jié)果可為后期橄欖香氣機(jī)理研究、育種、推廣及品質(zhì)創(chuàng)新等提供參考。