擠壓膨化協(xié)同酶解工藝制備蛋殼膜多肽及其抗氧化活性和組成分析

顧璐萍，張 鈺，李俊華，常翠華，楊嚴(yán)俊，蘇宇杰,*

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（江南大學(xué)），江蘇 無(wú)錫 214122；2.國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心（江南大學(xué)），江蘇 無(wú)錫 214122；3.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

中國(guó)每年產(chǎn)生約400 萬(wàn)噸蛋殼，目前主要作為廢棄物處理，造成環(huán)境污染及巨大的資源浪費(fèi)。蛋殼膜是緊貼蛋殼內(nèi)壁的一層薄膜，含有豐富的蛋白質(zhì)、黏多糖等成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1-2]。其中蛋白質(zhì)以角蛋白為主，還含有膠原蛋白、溶菌酶、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白等，種類豐富[3]；黏多糖主要為透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素兩種[4]，透明質(zhì)酸被譽(yù)為最理想的天然保濕因子，具有極好的保濕作用，可抗皮膚衰老和皺紋的生成[5]；硫酸軟骨素具有調(diào)節(jié)代謝、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等生理功能，如今已被用于風(fēng)濕病、腎炎、消化性潰瘍等疾病的臨床醫(yī)治[6-8]。

盡管蛋殼膜具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但由于其主要成分為角蛋白，其分子中含有大量的二硫鍵，導(dǎo)致蛋殼膜的水溶性極差，僅為5%左右，限制其在食品中的應(yīng)用[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，可采用酶解工藝來(lái)提高蛋殼膜的水溶性，在酶的作用下蛋殼膜蛋白分子鏈被切成分子量較小的肽段，與環(huán)境溶液中的水分子間作用力增強(qiáng)，水溶性增加[10]。與蛋白質(zhì)大分子相比，低分子量的生物活性肽在進(jìn)入人體后更容易被吸收，且具有許多重要的生理活性，如抗氧化性、抗炎性、抗菌活性等[11-12]。但由于蛋殼膜水溶性差，與酶作用的活性位點(diǎn)少，導(dǎo)致酶解反應(yīng)耗時(shí)長(zhǎng)、效率低。許多研究者有研究報(bào)道，可對(duì)蛋殼膜進(jìn)行預(yù)處理以提高酶解效率，如使用強(qiáng)堿、有機(jī)試劑等，但這些預(yù)處理方法會(huì)給產(chǎn)品分離純化及廢水處理帶來(lái)負(fù)擔(dān)且存在安全隱患[13-14]。目前蛋殼膜多肽產(chǎn)品主要采用強(qiáng)堿結(jié)合酶解工藝制備，但該產(chǎn)品風(fēng)味不好，消費(fèi)者接受度低。

擠壓膨化是在短時(shí)高溫高壓和強(qiáng)剪切力的條件下作用于物料，使其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變[15]，可用于各種蛋白質(zhì)、多糖提取及酶法制備大豆多肽的前處理步驟[16]。但擠壓膨化工藝用于殼膜多肽的制備尚未見報(bào)道。

鑒于此，本文以蛋殼膜粉為原料，采用擠壓膨化協(xié)同酶解工藝制備殼膜多肽，考察工藝條件對(duì)D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率的影響，并對(duì)蛋殼膜多肽的體外和細(xì)胞抗氧化性、分子量分布情況及氨基酸組成進(jìn)行分析，以期為蛋殼膜多肽的開發(fā)與應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋殼膜粉 黑龍江興和生物科技有限公司；堿性蛋白酶（酶活力2×105U/g） 安琪酵母生物科技有限公司；還原性谷胱甘肽 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ABTS 標(biāo)準(zhǔn)品、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）、2,2’-偶氮（2-甲基丙基脒）（AAPH）、菲咯嗪 SIGMA 公司；其他試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

FMHE 36-24 雙螺桿擠壓機(jī) 湖南富馬科食品工程技術(shù)有限公司；K 9840 凱氏定氮分析儀 海能儀器公司；Scientz-10 ND 冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；UH 5300 紫外-可見分光光度計(jì) 天美科學(xué)儀器有限公司；Waters 600 高效液相色譜 美國(guó)Waters 公司；Lapscale 研發(fā)型切向流超濾系統(tǒng) 美國(guó)Millipore 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋殼膜多肽的制備

1.2.1.1 擠壓膨化工藝優(yōu)化 取適量蛋殼膜粉進(jìn)行擠壓膨化預(yù)處理，具體工藝參數(shù)為螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min，水分含量20%，溫度140 ℃。擠壓膨化處理后，樣品粉碎過(guò)100 目篩，取3 g 樣品與碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH10）混合，固液比為1:10 g/mL，振蕩3 h 后離心（6500 r/min，20 min，4 ℃），取上清，經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后，測(cè)定濾液中D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率。在此條件基礎(chǔ)上，依次改變溫度、螺桿轉(zhuǎn)速和水分含量，對(duì)預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化。所選具體參數(shù)為溫度：120、140、160 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速：80、100、120 r/min，水分含量：10%、20%、30%。以未經(jīng)過(guò)擠壓膨化處理的蛋殼膜粉作為對(duì)照組。

1.2.1.2 酶解工藝優(yōu)化 預(yù)處理結(jié)束后，用3 mol/L HCl 將pH 調(diào)節(jié)至10.0，加入10000 U/g 堿性蛋白酶在55 ℃下反應(yīng)6 h。酶解后，90 ℃下加熱2 min 滅酶，6000 r/min 離心20 min，硅藻土過(guò)濾后再經(jīng)0.45 μm濾膜微濾后，測(cè)定D-葡萄糖醛酸提取量、總氮回收率和抗氧化活性，最后進(jìn)行冷凍干燥（-50 ℃，12 h）得到蛋殼膜多肽。在此條件基礎(chǔ)上，依次改變時(shí)間、加酶量和溫度，對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。所選具體參數(shù)為時(shí)間：2、4、6、8、10 h，加酶量：6000、8000、10000、12000、14000、16000 U/g，溫度：45、50、55、60、65、70 ℃。

1.2.2 D-葡萄糖醛酸提取量的測(cè)定 蛋殼膜水解液中D-葡萄糖醛酸提取量可用于衡量蛋殼膜中活性多糖的提取能力。透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素均由固定比例的D-葡萄糖醛酸組成，D-葡萄糖醛酸分子質(zhì)量在透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素中分別占51%和42%，因此可用D-葡萄糖醛酸含量間接表示透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素的含量[17]。D-葡萄糖醛酸提取量的測(cè)定參照QB/T 4576-2013 透明質(zhì)酸鈉 咔唑-硫酸法。

1.2.3 總氮回收率的測(cè)定 總氮回收率是指蛋殼膜水解液中總氮含量占蛋殼膜粉總氮含量的比例，可用于衡量蛋殼膜中可溶性蛋白及多肽提取能力。蛋殼膜粉的蛋白質(zhì)含量高達(dá)78.86%，占干重的88.88%?？偟康臏y(cè)定參照GB 5009.5-2016 食品中蛋白質(zhì)測(cè)定凱氏定氮法。

1.2.4 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.2.4.1 ABTS 自由基清除率的測(cè)定 參照J(rèn)un 等[18]的方法并加以修改。ABTS 工作液是由88 μL 過(guò)硫酸鉀（2.6 mmol/L）和5 mL ABTS 儲(chǔ)備液（7.4 mmol/L）混合，避光靜置12～16 h，在使用前用5 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）稀釋至0.70±0.02。將樣品分散在去離子水中至濃度為（0.1 mg/mL），取0.5 mL樣品溶液與3 mL ABTS 稀釋液混合，混勻10 s 后室溫避光靜置6 min 于734 nm 處測(cè)吸光度。ABTS 自由基清除率的計(jì)算公式如式（1）所示，以去離子水作為對(duì)照組。

式中：A對(duì)照為對(duì)照組的吸光值；A樣品為樣品組的吸光度值。

1.2.4.2 OH 自由基清除率 參照Li 等[19]的方法并加以修改。樣品組試管中依次加入1 mL PBS 緩沖液（pH7.4，0.2 mol/L）、1 mL 2.5 mmol/L 鄰菲咯啉溶液、1 mL 樣品溶液（5 mg/mL）、1 mL 2.5 mmol/L FeSO4充分混合后，加入0.5 mL 20 mmol/L H2O2溶液混勻，37 ℃保溫60 min 后于536 nm 處測(cè)吸光度?？瞻捉M中用去離子水代替樣品溶液，對(duì)照組中用去離子水代替樣品及H2O2溶液。OH 自由基清除率的計(jì)算公式如式（2）所示：

式中：A樣品為樣品組的吸光度值；A空白為空白組的吸光度值；A對(duì)照為對(duì)照組的吸光度值。

1.2.4.3 Fe2+螯合能力 參照Z(yǔ)hu 等[20]的方法并加以修改。樣品組為1 mL 樣品（0.4 mg/mL）與0.05 mL 2 mmol/L FeCl2、1.85 mL 去離子水、0.1 mL 5 mmol/L菲咯嗪溶液混勻，室溫靜置10 min 后于562 nm 處測(cè)吸光度，對(duì)照組為用去離子水代替樣品。Fe2+螯合能力的計(jì)算公式如式（3）所示：

式中：A對(duì)照為對(duì)照組的吸光度值；A樣品為樣品組的吸光度值。

1.2.5 細(xì)胞抗氧化活性的測(cè)定 參照張晶等[21]的方法，采用CAA 方法評(píng)估殼膜多肽的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性。具體操作如下：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞按照104個(gè)/孔的密度接種至96 孔板中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，移除培養(yǎng)基，加入100 μL 樣品溶液（含25 μmol/L DCFH-DA），樣品濃度為1、2.5、5、10 μg/mL，每組6 個(gè)平行。培養(yǎng)1 h 后，吸棄溶液，每孔加入100 μL AAPH 溶液（600 μmol/L），立即置于酶標(biāo)儀中讀數(shù)，每5 min 測(cè)定一次。激發(fā)波長(zhǎng)為538 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為485 nm，僅加入培養(yǎng)基作為對(duì)照組。CAA 計(jì)算公式如式（4）所示：

式中：∫ CA為 對(duì)照組的曲線下積分面積；∫ SA為樣品組的曲線下積分面積。

1.2.6 分子量分布分析 色譜條件如下：Waters 600高效液相色譜儀（配2487 紫外檢測(cè)器和M32 工作站）；色譜柱：TSKgelG 2000 SW×L300 mm×7.8 mm。流動(dòng)相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1（V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：UV 220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃。樣品制備：吸取樣品0.02 g 于100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，用微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。相對(duì)分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C（12500）、抑菌肽（6500）、桿菌肽（1450）、Gly-Gly-Arg-Tyr（451）、Gly-Gly-Gly（189）。

1.2.7 氨基酸組成分析 將0.1 g 樣品加入水解管中，加入8 mL 6 mol/L HCl 溶液，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下酒精噴燈上封口。110 ℃下反應(yīng)24 h 后，將冷卻的水解液過(guò)濾，再用0.02 mol/L HCl 溶液溶解，然后用去離子水定容至50 mL，收集上清液0.22 μm 過(guò)濾，采用氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)至少采用3 個(gè)平行，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Prism 8 和SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖，多重比較之間的差異采用單因素方差分析和Duncan 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 擠壓膨化工藝的確定

本文采用擠壓膨化作為制備殼膜多肽的前處理步驟，目的是促進(jìn)更多的蛋白質(zhì)溶出，以利于后續(xù)的酶解工藝，從而獲得殼膜多肽。由于黏多糖不是以游離狀態(tài)存在于蛋殼膜中，而是與蛋白質(zhì)相結(jié)合形成糖蛋白，在蛋白質(zhì)溶出時(shí)，黏多糖也同時(shí)釋放出來(lái)。因此，本文以總氮回收率和D-葡萄糖醛酸提取量為指標(biāo)，確定擠壓膨化的最佳工藝。如圖1a 所示，擠壓膨化處理可以顯著提高總氮回收率和D-葡萄糖醛酸提取量（P＜0.05）。且總氮回收率隨溫度提高逐漸增加，超過(guò)140 ℃后增加不顯著（P＞0.05），D-葡萄糖醛酸提取量先逐漸提高，140 ℃時(shí)達(dá)到峰值，隨后又迅速降低。主要原因是高溫可以使蛋殼膜中的角蛋白分子間或分子內(nèi)二硫鍵斷裂，從而提高蛋白的溶解性，并且釋放出更多的黏多糖。但溫度過(guò)高會(huì)破壞組織結(jié)構(gòu)，使物料在套筒內(nèi)焦糊并硬化，造成黏多糖提取量降低[22]。

由圖1b 可知，螺桿轉(zhuǎn)速提高使D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率逐漸增加并趨于平穩(wěn)。隨著螺桿轉(zhuǎn)速的增加，物料在套筒內(nèi)受到更大的擠壓和剪切作用，加速角蛋白中二硫鍵的斷裂，使蛋白和黏多糖溶出。當(dāng)轉(zhuǎn)速持續(xù)增加時(shí)，物料在套筒中滯留時(shí)間短，反應(yīng)不充分，造成提取量提高不顯著（P＞0.05）[23]，故選擇螺桿轉(zhuǎn)速為100 r/min。

圖1 擠壓膨化對(duì)蛋殼膜中D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率的影響Fig.1 Effects of extruding expansion on D-glucuronic acid extraction amount and total nitrogen recovery

從圖1c 可以看出，隨著物料含水量的增加，葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率在含水量為20%時(shí)達(dá)到最大值；水分含量增加至30%時(shí)，葡萄糖醛酸提取量無(wú)顯著變化（P＞0.05），而總氮回收率反而下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)含水量過(guò)低時(shí)，物料在機(jī)器中易發(fā)生堵塞而無(wú)法順利通過(guò)膜孔[24]。適當(dāng)?shù)暮靠梢允刮锪鲜杷刹⑿纬闪黧w狀態(tài)，順利通過(guò)膜孔。而含水量過(guò)高時(shí)，物料在套筒內(nèi)流動(dòng)性加快，造成剪切力降低，擠壓不充分，總氮回收率下降[25]。

綜上所述，擠壓膨化的最佳工藝為溫度140 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min，水分含量20%，此時(shí)D-葡萄糖醛酸提取量為3.34 mg/g，總氮回收率為6.25%。

2.2 酶解工藝的確定

2.2.1 不同酶解時(shí)間對(duì)蛋殼膜酶解效果的影響 如圖2 所示，在酶解初期，D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率逐漸增加，直到6 h 后達(dá)到平衡，總氮回收率無(wú)顯著變化（P＞0.05），D-葡萄糖醛酸提取量緩慢下降。此變化趨勢(shì)與朱文婷等[26]的研究結(jié)果一致，當(dāng)超過(guò)某個(gè)酶解時(shí)間后，透明質(zhì)酸被破壞降解，得率降低。這可能是因?yàn)橥该髻|(zhì)酸長(zhǎng)時(shí)間處于堿性環(huán)境下容易被分解[4]。因此，酶解時(shí)間為6～8 h 時(shí)，蛋殼膜的酶解效果較好。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率的影響Fig.2 Effects of hydrolysis time on D-glucuronic acid extraction amount and total nitrogen recovery

一般來(lái)說(shuō)，多肽的生物活性取決于多肽的氨基酸組成和序列[27]。從圖3 可以看出，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋殼膜多肽的OH 自由基清除率逐漸增強(qiáng)，在6 h 時(shí)達(dá)到最大值。這歸因于蛋白質(zhì)在酶解過(guò)程中會(huì)釋放出具有抗氧化活性的序列及氨基酸殘基[28]。而ABTS 自由基清除率和鐵螯合率能力呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)，在酶解2～6 h 時(shí)無(wú)明顯變化，但隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化能力反而下降，這可能是因?yàn)槊糠N體外抗氧化性的反應(yīng)機(jī)制不一樣，呈現(xiàn)出不同的結(jié)果[29]。綜合考慮，選擇酶解時(shí)間為6 h。

2.2.2 不同加酶量對(duì)蛋殼膜酶解效果的影響 如圖4 所示，當(dāng)加酶量從6000 到14000 U/g 時(shí)，D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率均迅速增加，到14000 U/g后不再增加。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，提高加酶量可以增加酶與底物的碰撞幾率，加快酶解速率。但當(dāng)?shù)孜镆淹耆幌?，過(guò)量的酶并不能持續(xù)加速催化反應(yīng)[30]。

圖4 加酶量對(duì)D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率的影響Fig.4 Effects of the amount of enzyme on D-glucuronic acid extraction amount and total nitrogen recovery

如圖5 所示，蛋殼膜多肽的抗氧化活性隨著加酶量提高逐漸增加，當(dāng)超過(guò)12000 U/g 時(shí)，顯著下降（P＜0.05）。這是因?yàn)檩^高的加酶量使蛋殼膜過(guò)度酶解成活性不高的小肽或氨基酸[31]。因此，選擇加酶量為12000 U/g。

圖5 加酶量對(duì)抗氧化活性的影響Fig.5 Effects of enzyme amount on antioxidant activity

2.2.3 不同溫度對(duì)蛋殼膜酶解效果的影響 溫度會(huì)影響酶分子的催化效率，由圖6 可知，45～55 ℃時(shí)，D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率呈上升趨勢(shì)，在55～60 ℃時(shí)達(dá)到最高值，隨后顯著降低（P＜0.05）。這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)纳郎赜兄谔岣呙傅拇呋?；而進(jìn)一步升高溫度反而會(huì)導(dǎo)致酶發(fā)生變性，造成催化效率下降[32]。

圖6 溫度對(duì)D-葡萄糖醛酸提取量和總氮回收率的影響Fig.6 Effects of temperature on D-glucuronic acid extraction amount and total nitrogen recovery

如圖7 所示，蛋殼膜多肽的抗氧化活性隨著溫度升高不斷提高，但55～60 ℃變化不顯著（P＞0.05），超過(guò)60 ℃后顯著下降（P＜0.05）。這可能是由于隨著溫度升高，一方面酶的催化能力提高，另一方面反應(yīng)體系能量增加，從而增加單位時(shí)間內(nèi)有效碰撞次數(shù)，促使酶反應(yīng)加速進(jìn)行。但溫度繼續(xù)升高，超過(guò)一定限度時(shí)，蛋白酶則會(huì)變性失去催化活性，造成酶反應(yīng)速度降低[33]。綜合考慮，選擇酶解溫度為55 ℃。

圖7 溫度對(duì)抗氧化活性的影響Fig.7 Effects of temperature on antioxidant activity

綜上所述，酶解的最佳工藝為時(shí)間6 h，加酶量12000 U/g，溫度55 ℃，此時(shí)D-葡萄糖醛酸提取量達(dá)12.4±0.2 mg/g，總氮回收率達(dá)60.8%±0.7%，殼膜多肽的ABTS 自由基清除率為29.46%±0.27%，OH自由基清除率為26.58%±2.56%，F(xiàn)e2+螯合能力為50.25%±0.43%。

2.3 細(xì)胞抗氧化活性分析

采用最佳擠壓膨化協(xié)同酶解工藝制備殼膜多肽，并進(jìn)一步對(duì)其細(xì)胞抗氧化活性進(jìn)行分析。谷胱甘肽是公認(rèn)的具有較強(qiáng)抗氧化性的物質(zhì)，因此常作為抗氧化性評(píng)價(jià)對(duì)照組[21]。由圖8 可知，殼膜多肽的細(xì)胞抗氧化性隨著濃度增加而增強(qiáng)，與對(duì)照組谷胱甘肽相比，殼膜多肽的抗氧化性略低。當(dāng)殼膜多肽的濃度為10 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞抗氧化性達(dá)65%，說(shuō)明產(chǎn)物具有良好的細(xì)胞抗氧化性。

圖8 殼膜多肽的細(xì)胞抗氧化活性Fig.8 Cellular antioxidant activity of eggshell membrane peptides

2.4 分子量分布情況分析

本文采用高效液相色譜對(duì)殼膜多肽進(jìn)行分析，通過(guò)出峰面積積分計(jì)算可獲得其分子量分布情況（圖9）。結(jié)果顯示，蛋殼膜多肽分子量主要分布在252～2435 Da，占總量81.8%，252 Da 以下的游離氨基酸占7.0%，在2435 Da 以上的肽鏈占11.2%。結(jié)果表明，殼膜多肽以低聚肽為主。

圖9 蛋殼膜多肽分子量分布的高效液相色譜圖Fig.9 High performance liquid chromatography of molecular weight distribution of eggshell membrane peptides

2.5 氨基酸組成分析

表1 顯示了蛋殼膜多肽的氨基酸組成，Asp 和Glu 的總含量占27.93 g/100 g 蛋白。大量研究表明，某些氨基酸殘基與抗氧化活性具有良好的相關(guān)性，如Chen 等[34]研究發(fā)現(xiàn)具有疏水性氨基酸的肽可以提高抗氧化活性。本文制備的蛋殼膜多肽中含有較多的疏水性氨基酸，含量為44.70 g/100 g 蛋白，這可能與其具有良好的抗氧化活性有關(guān)。

表1 蛋殼膜多肽的氨基酸分析Table 1 Amino acid analysis of eggshell membrane polypeptide

3 結(jié)論

本文探究了擠壓膨化協(xié)同酶解工藝制備殼膜多肽的最佳參數(shù)為：擠壓膨化溫度140 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min，水分含量20%，酶解時(shí)間6 h，加酶量12000 U/g，溫度55 ℃。在該工藝條件下，D-葡萄糖醛酸提取量為12.4 mg/g，總氮回收率為60.8%，產(chǎn)物具有較高的體外和細(xì)胞抗氧化活性。相對(duì)分子質(zhì)量分布結(jié)果表明殼膜多肽中主要成分為低聚肽（252～2435 Da），占總量81.8%。氨基酸組成分析結(jié)果表明殼膜肽富含Asp 和Glu，且與抗氧化活性有關(guān)的氨基酸含量為44.70 g/100 g 蛋白。因此，本文制備的殼膜多肽有潛力作為天然抗氧化劑應(yīng)用到食品、化妝品、保健品等領(lǐng)域。