響應面法優(yōu)化蒲桃籽中三萜類化合物的提取工藝及其抗氧化活性分析

劉嘉鑫，陳小梅，曾 慧，王淑美,3,4,*，向麗敏,3,4,*

（1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006；3.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質量評價技術重點研究室，廣東 廣州 510006；4.廣東中藥質量工程技術研究中心，廣東 廣州 510006）

由于不健康的飲食及生活習慣，糖尿病已成為全球主要的公共衛(wèi)生問題[1]，患病人數(shù)逐年上升[2]。糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展與氧化應激密切相關[3-5]，應用抗氧化治療可逆轉氧化應激對組織的損傷，從而阻止或延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展，從天然產(chǎn)物中尋找有效的抗氧化劑將成為預防和治療糖尿病及其并發(fā)癥藥物開發(fā)的有效策略[6]。

蒲桃（Syzygium jambosL. Alston），又稱香果、響鼓等，為桃金娘科（Myrtaceae）蒲桃屬植物，在我國福建、廣東等地有栽培[7]。除了可作為熱帶水果食用外，蒲桃藥用歷史也較為悠久。據(jù)《中華本草》記載，蒲桃種子可健脾止瀉，多用于脾虛泄瀉及糖尿病的治療；現(xiàn)代藥理學研究表明蒲桃不同部位均有降血糖作用，尤以種子的降糖作用最強[8-9]。三萜類化合物是許多具有降血糖中藥的有效成分[10-11]，具有顯著的抗氧化活性，在糖尿病防治方面具有巨大的潛力。三萜類化合物是蒲桃的主要化學成分之一[12]，也是其發(fā)揮降糖活性的有效成分之一[13]。蒲桃不同藥用部位均含有烏蘇烷型三萜[12,14-15]。但目前國內外對蒲桃屬植物三萜成分的研究主要集中在果實和莖葉部位[12-15]，對蒲桃籽三萜的研究罕見報道。

一般來說，三萜類化合物常用的提取方法有堿水提取法、超臨界CO2提取法、超聲輔助提取法、有機溶劑提取法等[16-17]。某些皂苷含有羧基，可溶于堿水，可以采用堿水提取法提取，但是該法提取效率低[16]。超臨界CO2提取法及超聲輔助提取法提取效率高，能耗低，但對設備要求較高，提取成本高，不適合規(guī)?；a(chǎn)[17-18]。與其他提取方法相比，有機溶劑提取法具有提取周期短、操作簡便，適應性廣的優(yōu)點[16]，因此本文選擇有機溶劑提取法來研究蒲桃籽三萜的提取工藝，在單因素實驗考察甲醇體積分數(shù)、料液比、提取時間對蒲桃籽三萜得率影響的基礎上，采用響應面試驗優(yōu)化其提取工藝，并采用DPPH 和ABTS 法評價了其體外抗氧化活性，為后續(xù)蒲桃資源的開發(fā)利用、糖尿病的防治及天然食品抗氧化劑的開發(fā)奠定了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒲桃籽 2019 年6 月在廣東藥科大學大學城校區(qū)的校園內采摘，經(jīng)廣東藥科大學中藥學院向麗敏博士鑒定為蒲桃（Syzygium jambosL. Alston）；烏蘇酸對照品 純度95%，實驗室自制；石油醚 分析純，天津市百世化工有限公司；甲醇、冰乙酸 分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；高氯酸 分析純，廣州市安捷匯貿(mào)易有限公司；香草醛（香蘭素） 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；2, 2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基、2, 2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽、抗壞血酸、過硫酸鉀 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；5%的香蘭素-冰乙酸溶液 精密稱取香蘭素2.5 g，于50 mL 的棕量瓶，加冰乙酸定容至刻度線，搖勻即得。

DFY-200C 搖擺式高速粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；JM-B2002 電子天平 余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司；ME104 萬分之一天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；SB-1300 旋轉蒸發(fā)儀 廣州騰朗科技儀器有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵鞏義市予華有限責任公司；DLSB-5110 低溫冷卻液循環(huán)泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ-500DE 數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計 島津儀器蘇州有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒲桃籽前處理 取適量干燥的蒲桃籽藥材粉粹，過1 號篩，得到蒲桃籽粗粉。取100 g 蒲桃籽粗粉與5 倍量石油醚于65 ℃的水浴鍋中加熱回流脫脂1 h，重復操作2 次。過濾，將脫脂后的蒲桃籽粗粉平鋪于法蘭盤中，在通風櫥放置過夜，期間時常翻動，待其徹底揮去石油醚后過2 號篩，所得蒲桃籽粉末保存?zhèn)溆肹19-20]。

將未脫脂蒲桃籽粗粉、脫脂蒲桃籽粗粉在50 ℃下加熱回流30 min，得到醇提物過濾，在550 nm 下測其吸光度值A。由于A脫脂樣品＞A未脫脂樣品，所以選擇脫脂粉末作為本實驗的研究對象。

1.2.2 蒲桃籽三萜提取工藝 稱取0.5 g 蒲桃籽脫脂粉末，根據(jù)后續(xù)不同實驗參數(shù)條件，加入不同體積分數(shù)的甲醇溶液，在不同的提取溫度、時間、料液比下進行回流提取。提取結束后室溫冷卻10 min 定容，移取上清液，過濾，即為蒲桃籽三萜類化合物提取液。

1.2.3 單因素實驗 精密稱取0.5 g 蒲桃籽粗粉，按照設定條件進行提取，分別考察甲醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間以及料液比對蒲桃籽三萜得率的影響：固定料液比1:10 g/mL，提取溫度50 ℃，提取時間30 min 下，考察甲醇體積分數(shù)（10%、30%、50%、70%、80%、95%）對蒲桃籽三萜得率的影響；固定料液比1:10 g/mL，甲醇體積分數(shù)50%，提取時間30 min下，考察提取溫度（40、50、60、70、80、90 ℃）對蒲桃籽三萜得率的影響；固定料液比1:10 g/mL，甲醇體積分數(shù)50%，提取溫度50 ℃下，考察提取時間（20、40、60、90、120 min）對蒲桃籽三萜得率的影響；固定甲醇體積分數(shù)50%，提取溫度50 ℃，提取時間30 min 下，考察料液比（1:10、1:40、1:50、1:70、1:80 g/mL）對蒲桃籽三萜得率的影響。

1.2.4 響應面法優(yōu)化提取工藝 上述實驗結果顯示蒲桃籽中三萜類化合物的得率隨著溫度的升高而逐漸上升，但是由于甲醇的沸點為64.7 ℃，而且溫度過高會引起部分三萜類化合物結構發(fā)生變化，本實驗將60 ℃作為最佳提取溫度（固定溫度）。

選取甲醇體積分數(shù)（A）、提取時間（B）、料液比（C）三個因素為自變量，以蒲桃籽中三萜類化合物得率（D）為響應值，運用Design-Expert 12 軟件進行三因素三水平的Box-Behnken 響應面設計，試驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗設計因素和水平Table 1 Test factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 三萜類化合物含量測定 取1 mg/mL 烏蘇酸對照品溶液0.2 mL 于80 ℃下蒸干。依次加入0.3 mL 5%的香蘭素-冰乙酸溶液和1 mL 高氯酸，混勻。60 ℃恒溫加熱20 min，取出后立即置于冷水中冷卻5 min，最后加入5 mL 冰乙酸稀釋搖勻，以空白試劑（0.3 mL 5%的香蘭素-冰乙酸溶液+1 mL 高氯酸+5 mL 冰乙酸，混勻）為參比，在400～800 nm 下掃描吸收圖譜，選擇其最大吸收峰550 nm 為檢測波長[21]。將對照品分別配制成100、200、400、600、800、1000 μg/mL，根據(jù)上述方法測得吸光度值A，并得到回歸方程Y=0.0011x+0.0239，R2=0.9995。

根據(jù)上述方法測得樣品吸光度值，并結合回歸方程及以下公式計算得到蒲桃籽中三萜類化合物得率W：

式中：W 表示蒲桃籽中三萜類化合物的得率，mg/g；V 表示吸取的蒲桃籽樣品溶液的體積，mL；c 表示提取液中三萜的濃度，mg/mL；D 表示稀釋倍數(shù)；m 表示粉末的重量，g。

1.2.6 抗氧化活性試驗

1.2.6.1 DPPH 自由基清除能力的測定 取14 g 脫脂粉末，按上述試驗所得最優(yōu)工藝提取，蒸干后得1.5 g 浸膏。配制為15、20、25、30、35、40、45 μg/mL的樣品溶液，各取20 μL，加入20 μL 0.2 mmoL/L DPPH 溶液，搖勻后避光30 min 后，以甲醇為空白對照，VC為陽性對照，在517 nm 下測定其吸光度，進行3 次平行實驗[18,22]。按照以下公式計算其DPPH·清除能力。

式中：D1表示樣品或陽性對照吸光度；D2表示空白對照吸光度。

1.2.6.2 ABTS+·清除能力的測定 7 mmoL/L 的ABTS溶液和2.45 mmoL/L 的過硫酸鉀溶液等體積（5 mL）混合，室溫避光條件下反應14～16 h 制得ABTS 儲備液。將儲備液用pH 為7.4 的磷酸鹽緩沖液稀釋（約40～45 倍），直至測得其在734 nm 下吸光度為0.700±0.020。各取0.5 mL 濃度為1、5、10、15、20、25 μg/mL 的樣品溶液，加3 mL ABTS 工作液振蕩搖勻，黑暗反應8 min，檢測其在波長734 nm 處的吸光度值A1，純水代替ABTS 工作液測得吸光度值A2，同樣用純水代替樣品溶液測得其吸光度值A0。以VC為陽性對照，進行3 次平行實驗[21,23]，按照以下公式計算其ABTS+·清除能力。

式中：A1表示樣品/陽性對照+ABTS 工作液的吸光度值；A2表示樣品/陽性對照+純水的吸光度值；A0表示純水/陽性對照+ABTS 工作液的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗平行測定3 次，取平均值。數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 8 進行統(tǒng)計整理和繪圖。采用Design-Expert 12 軟件進行響應面優(yōu)化及方差分析；P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 甲醇體積分數(shù)對三萜得率的影響 由圖1 可知，三萜類化合物得率隨甲醇體積分數(shù)的增加，呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。甲醇體積分數(shù)為50%時，其得率達到最大值9.90 mg/g，說明蒲桃籽三萜類成分在甲醇體積分數(shù)為50%時溶解度最大。而甲醇體積分數(shù)超過50%后，三萜的得率逐漸降低。一方面可能與三萜的極性有關[24]，隨著甲醇體積分數(shù)的增加，部分三萜類化合物的溶解度下降而導致總三萜類化合物的得率降低；另一方面則是因為一些醇溶性雜質、脂溶性雜質等隨之溶出[25]，與三萜類成分產(chǎn)生了競爭[26]，從而導致了蒲桃籽中三萜類成分的得率下降。綜上，應選擇甲醇體積分數(shù)為30%、50%、70%的溶劑進行響應面優(yōu)化。

圖1 甲醇體積分數(shù)對三萜類化合物得率的影響Fig.1 Effect of methanol volume fraction on the yield of triterpenoids

2.1.2 提取溫度對三萜得率的影響 由圖2 可知，隨著溫度的升高，其得率逐漸上升?？赡苁怯捎陔S著溫度的升高，高分子的熱運動加劇，使得甲醇溶液更容易滲透、擴散進入藥粉組織細胞內，而有利于三萜類化合物的提取[25]，但是超過80 ℃可能會引起部分三萜類化合物結構的變化。且考慮到甲醇的沸點為64.7 ℃[27]，將60 ℃作為最佳提取條件。

圖2 提取溫度對三萜類化合物得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of triterpenoids

2.1.3 提取時間對三萜得率的影響 由圖3 可知，在本試驗條件范圍內，提取時間對蒲桃籽中三萜類化合物的得率影響較小，總體來看得率隨時間的變化呈現(xiàn)出平緩-上升-再下降的趨勢。提取時間為90 min 時，得率達到最大值10.22 mg/g。說明在提取90 min時，蒲桃籽粉末與甲醇溶液可以充分接觸，其組織細胞基本破裂，三萜類化合物的溶出已經(jīng)達到最大的限度。而繼續(xù)延長加熱提取時間，不僅不會提高三萜類化合物的得率，反而會使某些三萜成分的穩(wěn)定性降低[25]。甚至隨著時間的延長，會有更多的雜質產(chǎn)生，這些雜質可能與三萜類化合物產(chǎn)生反應，形成吸附作用或者與三萜類化合物競爭溶劑，使得三萜類化合物的得率降低[28]。綜上，應選擇60、90、120 min 的提取時間進行響應面優(yōu)化。

圖3 提取時間對三萜類化合物得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of triterpenoids

2.1.4 料液比對三萜得率的影響 由圖4 可知，得率隨料液比的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。料液比達到1:40 時，蒲桃籽中三萜類化合物的得率達到了最大值11.97 mg/g?？赡苁遣煌牧弦罕葧ζ烟易逊勰┊a(chǎn)生不同的細胞外滲透壓[24]，從而導致其細胞破裂程度不同，進而使得三萜得率不同。當其料液比較小時，由于其粉末與溶劑之間的濃度梯度較小，使得甲醇溶液與蒲桃籽粉末的接觸面積較少，加熱回流受限，甲醇溶液不能完全滲透擴散進入藥粉的組織細胞內，從而使其三萜類化合物不能全部提出。而當其料液比增加時，甲醇溶液與蒲桃籽粉末的接觸面積增加，三萜的得率逐漸增加；直至料液比達到1:40時，其三萜的提取達到上限飽和。此后，溶劑繼續(xù)增加，反而會形成稀釋，其甲醇溶液與蒲桃籽粉末的有效碰撞面積減少，三萜得率下降[21,26]。同時，由于其甲醇溶液增加，雜質也隨之增加，雜質既可能影響三萜類化合物的提取，也能吸附三萜類化合物或者與其發(fā)生反應，使之得率降低。且料液比增大，不僅產(chǎn)生浪費，還會對之后的富集純化等實驗加大難度。綜上，應選擇1:10、1:40、1:70 g/mL 的料液比進行響應面優(yōu)化。

圖4 料液比對三萜類化合物得率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the yield of triterpenoids

2.2 響應面試驗優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計 運用Design-Expert 12 軟件對蒲桃籽中三萜類化合物的提取工藝進行優(yōu)化，共產(chǎn)生17 組實驗（包括5 組零點實驗進行誤差校正），其設計結果見表2。

2.2.2 建立回歸模型及方差分析 運用Design-Expert 12 軟件對表2 的數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，并進行方差分析，結果見表3。得到二次多項回歸方程為（A：甲醇體積分數(shù)；B：提取時間；C：料液比；D：得率；以下均同）：

表2 Box-Behnken 試驗設計和結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

其中，模型的決定系數(shù)R2=0.9717，表明模型擬合情況良好，試驗因素與得率之間的關系較為明顯，蒲桃籽中三萜類化合物的得率的變化中，97.17%來自于試驗因素[25]。因此，此模型可以很好地解釋得率與三個因素的關系。調整系數(shù)R2Adj=93.53%，表明此模型誤差較小，能很好地解釋93.53%的得率的變化，可以用模型來代替實際值，所以此模型可以進行蒲桃籽中三萜類化合物提取的工藝優(yōu)化[25-26]。變異系數(shù)CV（%）代表試驗結果的精度，其CV 值越小，實驗結果越可靠[26]。本模型的CV（%）=3.66%，重現(xiàn)性較好，可以用于蒲桃籽中三萜類化合物提取的工藝預測與優(yōu)化。

由表3 可知，模型P=0.0001，＜0.01，差異極顯著，說明實驗方法可靠。失擬項P=0.1351，＞0.05，差異不顯著，說明本數(shù)據(jù)模型擬合良好，預測值與真實值之間的偏差較小[26]，模型可以用來描述各因素與得率之間的關系。

因素C（料液比）P＜0.01，差異極顯著，說明料液比對蒲桃籽中三萜類化合物的得率有極顯著的影響；而A（甲醇體積分數(shù)）和B（提取時間）P＞0.05，無顯著性，說明二者對蒲桃籽三萜得率的影響不顯著。試驗因素的F值越大，說明其對響應值得率的影響越大[25]。因此，影響蒲桃籽中三萜類化合物得率的因素由大到小是：C＞A＞B，即料液比＞甲醇體積分數(shù)＞提取時間。交互項AB、AC、BC 均不顯著（P＞0.05），說明這些因素之間的內在聯(lián)系不大。A2、C2的P＜0.01，差異極顯著。

2.2.3 模型診斷 擬合得到的模型可以通過殘差分析來進行診斷。這種方法主要是建立在模型無法完全解釋的變異基礎上，通過圖形來診斷的。在診斷過程中，有兩個判斷極其重要，即殘差方差齊性與正態(tài)分布。首先判斷殘差方差齊性，若預測值的內部t化殘差呈隨機分布，則其殘差方差齊性符合要求。由圖5（a）可以看出，其呈散點分布，符合要求。其次判斷正態(tài)分布，若殘差呈正態(tài)分布，則其擬合的曲線呈線性。由圖5（b）可以看出，其殘差呈正態(tài)分布。因此，可以診斷得出本試驗實驗值與實際值偏差較小，擬合的模型有價值[29]。

圖5 模型診斷工具圖Fig.5 Diagnostic tool diagram of the model

2.2.4 工藝優(yōu)化 運用Design-Expert 12 軟件得到蒲桃籽中三萜類化合物的最佳提取工藝是：甲醇體積分數(shù)44.30%、料液比1:47.18、提取時間101.07 min（實驗時調整為101 min），此條件下的理論得率為12.28 mg/g。

根據(jù)以上條件進行三組平行實驗提取蒲桃籽中的三萜類化合物，得到的平均濃度為256.76 μg/mL，得率為12.11 mg/g，其RSD（%）為0.82%，實際的得率與理論得率之間的偏差僅為1.26%（＜5%），偏差較小，說明用此方法優(yōu)化后的蒲桃籽中三萜類化合物的提取工藝可行。

2.3 抗氧化活性試驗

2.3.1 DPPH 自由基清除能力的測定結果 由圖6可見，蒲桃籽中三萜類化合物對DPPH·的清除能力與三萜類化合物濃度有一定的量效關系，IC50值為24.93 μg/mL。在15～30 μg/mL 的濃度范圍內，隨著蒲桃籽中三萜類化合物濃度的增大，其對DPPH 自由基的清除能力增強，且各濃度間清除能力具有顯著差異（P＜0.05），當蒲桃籽中三萜類化合物濃度為30 μg/mL 時，DPPH·清除率為83.90%，清除能力顯著，與VC相近。

圖6 蒲桃籽總三萜、VC 的DPPH·清除能力測定結果Fig.6 Results of DPPH scavenging ability of total triterpenoids in the seeds of S. jambos L. Alston and VC

2.3.2 ABTS+·清除能力的測定結果 由圖7 可見，蒲桃籽中三萜類化合物對ABTS+·的清除率呈現(xiàn)一定的量效關系，IC50值為12.16 μg/mL。在1～25 μg/mL的濃度范圍內，隨著蒲桃籽中三萜類化合物濃度的增大，其對ABTS+·的清除能力增強，且各濃度間清除能力具有顯著差異（P＜0.05），當蒲桃籽中三萜類化合物濃度為25 μg/mL 時，清除能力達到91.29%，略低于VC，表現(xiàn)出很強的清除能力。與上述三萜類化合物對DPPH·清除能力相比，其對ABTS+·的清除能力更強，這可能是由于三萜類化合物具有較高的供氫能力，結果與靈芝三萜類化合物類似[30]。

圖7 蒲桃籽總三萜、VC 的ABTS+·清除能力測定結果Fig.7 Results of ABTS+· scavenging ability of total triterpenoids in the seeds of S. jambos L. Alston and VC

從上述結果可以看出蒲桃籽中三萜類化合物對不同的自由基（DPPH·、ABTS+·）均有較強的清除能力，與VC相近或略低，抗氧化活性強，可以作為潛在的抗氧化劑。

3 結論

本研究以蒲桃籽為原料，通過響應面優(yōu)化得到蒲桃籽中三萜類化合物的最優(yōu)提取工藝為：甲醇體積分數(shù)44.30%、料液比1:47.18 mg/L、提取時間101 min。在該工藝下，實際得率（12.11 mg/g）與理論得率（12.28 mg/g）之間的偏差僅為1.26%（＜5%）。且蒲桃籽中三萜類化合物具有較強的DPPH·、ABTS+·清除能力（與VC相近或略低），IC50值分別是為24.93、12.16 μg/mL，抗氧化活性較強。本研究為今后蒲桃資源的綜合開發(fā)利用奠定了基礎，也為其日后作為天然糖尿病防治資源或者食品天然抗氧化劑等提供了數(shù)據(jù)支撐。