紅谷黃酒發(fā)酵過程中微生物多樣性與理化指標(biāo)、揮發(fā)性風(fēng)味的相關(guān)性分析

谷曉東，李素萍，楊柳青，劉怡琳，馬艷莉,,*，陳志周,3,*，王印壯，劉 旭

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，河南 南陽 473004；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，河北 保定 071001）

黃酒是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵酒精飲品之一[1]，其歷史悠久，與啤酒、葡萄酒并稱為世界三大古酒[2-3]。因其營(yíng)養(yǎng)豐富，富含氨基酸、有機(jī)酸、多種維生素、活性多肽、功能性低聚糖及微量元素[4-7]，素有“酒中之祖、液體蛋糕”美譽(yù)；具有降血壓、抗氧化、提高免疫力、降膽固醇和抗衰老等生理功效[8-10]。黃酒通常是以富含淀粉的糯米、小米、高粱等谷物為原料[11]，曲藥作為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)過浸米、蒸米、攤涼、落缸、拌曲、發(fā)酵、壓榨、澄清、過濾、殺菌等多道工藝[12]釀造而成。

具有養(yǎng)生及保健作用的小米黃酒已成為研究熱點(diǎn)之一，如石黎琳等[13]利用頂空固相微萃取技術(shù)，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)研究了不同品種小米對(duì)黃酒風(fēng)味的影響。紅酒谷（Panicum miliaceumL.）是河南省南陽盆地的特色農(nóng)作物，外殼呈紅色，脫殼后得到的小米也稱紅小米。其性溫，是藥食兩用食材，具有清熱止渴、滋陰補(bǔ)腎、健脾暖胃之功效[14]。其富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、比例協(xié)調(diào)，常被用于釀造南陽黃酒，使得南陽黃酒具有獨(dú)特的風(fēng)味[15]。南陽更因此入圍“世界美酒特色產(chǎn)區(qū)[16]”。極大促進(jìn)了黃酒生產(chǎn)原料紅谷產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收的新路徑，廣泛獲得當(dāng)?shù)卣头鲐毑块T認(rèn)可[15,17]。紅谷的發(fā)展大有前景。

微生物對(duì)于發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生有很大的影響，多樣的微生物結(jié)構(gòu)使發(fā)酵食品經(jīng)過復(fù)雜的微生物代謝作用產(chǎn)生了多樣性的風(fēng)味變化。洪家麗等[18]通過紅曲黃酒研究發(fā)現(xiàn)乳球菌屬、釀酒酵母和假單胞菌屬等與釀造過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)大多呈正相關(guān)。陳蒙恩等[19]研究陶融型大曲發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬和乳桿菌屬與吡嗪類、酯類和芳香族類等多數(shù)揮發(fā)性風(fēng)味成分呈顯著正相關(guān)，魏斯氏菌屬與吡嗪類、酮類、酸類和酯類均呈顯著正相關(guān)。嚴(yán)超[20]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌可以與同一風(fēng)味物質(zhì)具有相關(guān)性，某種微生物也能夠與多種風(fēng)味物質(zhì)具有相關(guān)性；乳酸桿菌屬和乳球菌屬等與脂肪酸類以及酯類物質(zhì)具有很強(qiáng)的相關(guān)性；伯克氏菌屬與高級(jí)醇具有較強(qiáng)的相關(guān)性，芽孢桿菌與氨基酸具有較強(qiáng)的相關(guān)性，腸桿菌屬和乳酸桿菌屬等與有機(jī)酸具有較強(qiáng)的相關(guān)性。食品中風(fēng)味物質(zhì)的形成如酸、酯、醇、有機(jī)酸等都與微生物的作用相關(guān)。

Li 等[21]通過比較紅谷與其他5 種釀造原料在預(yù)處理過程中的理化和結(jié)構(gòu)特性發(fā)現(xiàn)紅谷含有較高的蛋白質(zhì)，浸泡后浸泡水酸度高、回生值低和預(yù)處理后具有較大的孔狀結(jié)構(gòu)，對(duì)于進(jìn)一步的釀造可能有益。紅谷具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值且適用于釀造的特點(diǎn)，可作為黃酒新的釀酒原料，目前這一新原料還未被深入開發(fā)。本研究以紅谷黃酒酒醪為對(duì)象，通過高通量測(cè)序技術(shù)分析不同發(fā)酵時(shí)間的酒醪中微生物群落結(jié)構(gòu)及其與風(fēng)味的相關(guān)性。旨在更好地了解研究紅谷黃酒發(fā)酵機(jī)理，為紅谷黃酒品質(zhì)的提升與發(fā)展提供理論參考。

1 材料方法

1.1 材料與儀器

紅谷 河南南陽當(dāng)?shù)爻?；小米紅曲 河南南陽潤(rùn)之酒業(yè)；甲醛 洛陽市化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；葡萄糖、苯酚天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；鹽酸 洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；以上所用試劑均為分析純；3-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 上海麥克林試劑有限公司；PowerSoil?DNA Isolation Kit 試劑提取盒深圳市安必勝科技有限公司；KOD FX Neo 聚合酶（活力1 U/μL）、KOD FX Neo 緩沖液 東洋紡（上海）生物科技有限公司；脫氧核苷三磷酸（dNTP） 上海源葉生物科技有限公司；ddH2O 上海譜振生物科技有限公司；OMEGA DNA 純化柱 廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司 。

5424R 高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；PAL-α糖度計(jì) 日本愛拓公司；ME204E 電子分析天平 梅特勒-托利儀器（上海）有限公司；PHS-3C pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；725N 紫外可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；DZKW-4 電熱恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；ZNCL-BS 磁力攪拌器 上海卓越儀器設(shè)備有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 頂空固相微萃取纖維頭 美國Supelco 公司；7890B-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent 儀器有限公司；NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì) 上海在途生物科技有限公司；Illumina Novaseq6000 PE250高通量測(cè)序平臺(tái) 北京擎科生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅谷黃酒的發(fā)酵 以紅谷為原料（以干米質(zhì)量2 倍的純凈水浸泡24 h），小米紅曲為酒曲，料液比（干紅谷:酒曲:水）為1:0.16:0.5（g/g/g）將蒸熟晾涼后的紅谷、酒曲、水混合均勻，落料品溫控制在24～28 ℃；前發(fā)酵維持7 d，發(fā)酵溫度為28～32 ℃；后發(fā)酵時(shí)間為23 d，控制溫度25～26 ℃，釀造紅谷黃酒并于發(fā)酵過程中取樣10 次，分別為第1～7、10、20和30 d，每個(gè)樣品做三個(gè)平行。

1.2.2 理化指標(biāo)測(cè)定 樣品先7500 r/min 離心10 min，取上清液測(cè)定。

1.2.2.1 總糖、還原糖的測(cè)定 3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定[22]。

a.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制：稱取大于1 g 的葡萄糖置于熱風(fēng)干燥箱98 ℃干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取1.000 g葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至1000 mL。分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 于25 mL 具塞試管中補(bǔ)蒸餾水至1.5 mL，加入1.5 mL DNS 試劑充分混勻后沸水浴5 min，流水冷卻后定容至25 mL 混勻，放置20 min 后以蒸餾水為空白對(duì)照在540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制吸光度-葡萄糖濃度曲線的回歸方程?；貧w方程為：y=0.4811x-0.0295（R2=0.9979）。

b.酒樣檢測(cè)：吸取試樣2～10 mL（控制水解液總糖含量為1～2 g/L）于500 mL 容量瓶中，加水50 mL和鹽酸溶液（6 mol/L）5 mL，在68～70 ℃水浴中加熱15 min。冷卻后加入甲基紅指示液2 滴，用氫氧化鈉溶液中和至紅色消失（近似于中性）。加水定容，搖勻，用濾紙過濾后備用；測(cè)定時(shí)，以試樣水解液代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，以蒸餾水為空白對(duì)照在540 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度帶入回歸方程得總糖含量。

1.2.2.2 其他理化指標(biāo)的測(cè)定 酒精度、總酸、pH、氨基態(tài)氮：按照GB/T 13662-2018《黃酒》測(cè)定?？扇苄怨绦挝铮禾嵌葍x測(cè)定。

1.2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定 樣品前處理：使用SPME 設(shè)備和50/30 μm（DVB/CAR/PDMS）涂覆的纖維。將NaCl（1.0 g）和25.0 μL 3-辛醇添加到20 mL頂空瓶中的樣品（7.5 mL）中。將樣品在50 ℃下萃取15 min；然后，將纖維插入GC（250 ℃）的進(jìn)樣口中7 min 以解吸分析物。用于氣相色譜-質(zhì)譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）測(cè)定[23]。

GC 的柱溫箱溫度最初以50 ℃保持2 min，以3 ℃/min 至80 ℃（保持2 min），以5 ℃/min 至230 ℃（保持10 min），10 ℃/min 至250 ℃（保持5 min）。載氣：氦氣（＞99.999%），流速為1 mL/min，分流比5:1。

MS 條件：在70 eV 電壓下產(chǎn)生了在電子碰撞（EI）模式下運(yùn)行的質(zhì)量檢測(cè)器，離子源溫度為230 ℃。使用全掃描（Scan）；掃描范圍29～350 amu。通過比較質(zhì)譜庫搜索（NIST 14.0 和Wiley 6.0）和真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)的保留時(shí)間來量化揮發(fā)性化合物。對(duì)匹配度80%以上的組分進(jìn)行半定量分析，并將濃度表示為插入內(nèi)標(biāo)物（3-辛醇）的當(dāng)量。

1.2.4 DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增 采用PowerSoil?DNA Isolation Kit 試劑盒提取酒醪微生物宏基因組總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 提取結(jié)果，用NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA提取濃度和純度。以提取的DNA 為模板，根據(jù)引物338F （5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)細(xì)菌16S rDNA 的V3-V4 區(qū)擴(kuò)增。根據(jù)引物ITS1F （5'-CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2 （5'-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3'）對(duì)真菌ITS1 區(qū)域的擴(kuò)増。

DNA 模板50 ng，正反向引物各0.9 μL，KOD FX Neo 聚合酶0.6 μL，KOD FX Neo 緩沖液15 μL，脫氧核苷三磷酸（dNTP） 6 μL，加入ddH2O 定容至30 μL。PCR 擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存[24]。

1.2.5 高通量測(cè)序 PCR 產(chǎn)物通過1.8%瓊脂糖凝膠回收，利用OMEGA DNA 純化柱進(jìn)行純化，用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，文庫構(gòu)建和測(cè)序由北京擎科生物科技有限公司Illumina Novaseq6000 PE250平臺(tái)來完成。以上DNA 的提取、PCR 擴(kuò)增及高通量測(cè)序均由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Origin Pro 8.6 統(tǒng)計(jì)程序分析，顯著性分析使用SPSS v.22.0 軟件。將Illumina Novaseq 6000 PE250 測(cè)序平臺(tái)生成的原始數(shù)據(jù)使用QIIME平臺(tái)進(jìn)行生物學(xué)信息分析，具體如下：測(cè)序得到的數(shù)據(jù)首先將成對(duì)的reads 拼成一條序列，使用 Usearch v10 軟件對(duì)拼接效果進(jìn)行質(zhì)量控制和過濾；然后使用cutadapt 1.9.1 軟件根據(jù)引物序列和序列首末兩端的條形碼（barcode）進(jìn)行區(qū)分樣品；使用 UCHIME v4.2 軟件，鑒定并去除嵌合體序列并得到有效序列；使用Usearch 軟件對(duì)前述得到的優(yōu)化序列按97%的相似度進(jìn)行操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）劃分。以SILVA 和NCBI 為參考數(shù)據(jù)庫，利用QIIME 軟件生成不同分類水平上的物種豐度表以及使用MEGAN 軟件將測(cè)序得到的物種豐度信息回歸至數(shù)據(jù)庫的分類學(xué)系統(tǒng)關(guān)系樹中。使用QIIME 平臺(tái)自帶程序分別計(jì)算黃酒樣品真菌和細(xì)菌的α與β多樣性（β多樣性采用 binary jaccard、bray curtis、weighted unifrac（限細(xì)菌）、unweighted unifrac（限細(xì)菌）等4 種算法計(jì)算）。微生物檢測(cè)所得數(shù)據(jù)的處理計(jì)算均由北京擎科生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中理化指標(biāo)變化

經(jīng)檢測(cè)紅谷黃酒最終總糖含量為9.18 g/L，根據(jù)GB/T 13662-2018《黃酒》標(biāo)準(zhǔn)，為非稻米干型黃酒。由表1 可知，還原糖含量先急劇減少后逐漸穩(wěn)定。發(fā)酵1 d 酒中還原糖含量較高可能是因?yàn)榫魄写嬖诘摩?淀粉酶和γ-淀粉酶共同作用于淀粉，將原料內(nèi)的淀粉分解后產(chǎn)生大量還原糖。發(fā)酵1～7 d，從49.37 g/L 降低至12.36 g/L，可能由于發(fā)酵劑分泌的淀粉酶附著于谷物原料，將淀粉等生物大分子分解成的糖類轉(zhuǎn)化成谷氨酸、乙醇等小分子物質(zhì)，用于后期風(fēng)味形成[25]。發(fā)酵后期含量變化較平緩在5.93 g/L左右，酒醪中只存在少量葡萄糖、糊精、低聚糖。

表1 發(fā)酵過程中紅谷黃酒理化指標(biāo)Table 1 Physiochemical indexes of red millet Huangjiu during fermentation

酒精度變化趨勢(shì)與還原糖相反，前酵（1～7 d）酒精度從1.30%vol 快速上升至14.73%vol。后酵（第8～30 d）發(fā)酵溫度降低，酒精度增長(zhǎng)緩慢；20 d 達(dá)到最高值（15.55%vol），30 d 酒精度有所下降（14.63%vol）。后酵階段酒精度較高可能會(huì)反過來抑制酵母菌的代謝活動(dòng)，導(dǎo)致還原糖的分解轉(zhuǎn)化效率降低，導(dǎo)致黃酒糖分積累；乙醇也可與酸類物質(zhì)進(jìn)行酯化反應(yīng)生成酯類成分[26]。

總酸含量先快速增加（1～4 d）后減少（5～7 d）再增加（10～30 d）。發(fā)酵初始酒中總酸含量為3.54 g/L，可能是前期谷物浸泡的米漿水中酸類物質(zhì)通過蒸米飯帶入發(fā)酵醪中，從而創(chuàng)造適合發(fā)酵醪中酵母菌生長(zhǎng)的發(fā)酵環(huán)境，抑制雜菌的生長(zhǎng)[27]。發(fā)酵后期總酸增加，可能是產(chǎn)酸菌株在后期釀造中也比較活躍[28]。紅谷在發(fā)酵過程中易吸水溶脹，使自溶產(chǎn)物增加（氨基酸、有機(jī)酸），而有機(jī)酸作為乳酸菌代謝主要產(chǎn)物，發(fā)酵醪酸值與乳酸桿菌數(shù)量成正相關(guān)[29]。pH 在發(fā)酵過程中未見顯著變化（P＞0.05），發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH＜4（3.66）。較低的pH 為有益優(yōu)勢(shì)菌群的快速繁殖、生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境，保證發(fā)酵順利完成[30]。

氨基態(tài)氮先波動(dòng)增加（0～7 d）后急劇上升（10～30 d）。由于前酵時(shí)間較短，酒中蛋白質(zhì)初級(jí)水解，氨基態(tài)氮生成量少，穩(wěn)定在0.26～0.59 g/L。發(fā)酵后期原料中蛋白質(zhì)在酒曲微生物分泌的肽酶、蛋白酶作用下逐步水解成氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致氨基態(tài)氮富集[31]。除了原料（米和酒曲）中蛋白質(zhì)能釋放氨基態(tài)氮，酵母釀造后期自溶也會(huì)增加氨基態(tài)氮含量[31]。

可溶性固形先劇烈下降（1～3 d）后趨于穩(wěn)定（4～30 d）。發(fā)酵1 d 樣品可溶性固形物大部分來自于酒曲中曲霉、根霉等微生物代謝產(chǎn)物?？扇苄怨绦挝锖侩S時(shí)間增加而迅速降低，在4 d 降至最低10.36%。這是因?yàn)樘穷惖葼I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被酒曲中的微生物大量消耗轉(zhuǎn)化為乙醇、二氧化碳等非可溶性固形物，可溶性固性物含量呈下降趨勢(shì)[32]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行固形物含量增加，發(fā)酵30 d 含量略有回升為12.25%，可能是發(fā)酵后期微量元素、水溶性蛋白等有機(jī)物的積累所致。

2.2 發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化

由表2 可知，發(fā)酵階段檢測(cè)出7 種醇、9 種酯、2 種酸和1 種醛共19 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。這些物質(zhì)在酒中的含量不同形成了黃酒不同的香氣特征[33]。醛類、酮類、酯類、醇類等非烴類化合物是黃酒香氣的主要來源[34]。由表2 可知，黃酒中醇和酯類含量較多，種類豐富，發(fā)酵結(jié)束時(shí)含量分別為687718.51 μg/L和70684.11 μg/L，乙醇是黃酒中主要的成分。苯乙醇具有玫瑰香、甜香香氣，可以貢獻(xiàn)愉悅、柔和、協(xié)調(diào)的黃酒香氣[35]，其含量在第30 d 為768.82 μg/L。2-丁醇、異丁醇、異戊醇和2,3-丁二醇是黃酒中的重要醇。醇類物質(zhì)由谷物蛋白分解得到的氨基酸分解代謝形成，是陳化酯類成分的前體物質(zhì)。

表2 紅谷黃酒發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量Table 2 Contents of volatile flavor compounds in the fermentation process of red millet Huangjiu

酯類的花香、水果香氣對(duì)黃酒的風(fēng)味有很大的影響。其中，乙酸乙酯含量最高，從390.71 μg/L（發(fā)酵1 d）增長(zhǎng)到52828.30 μg/L（發(fā)酵30 d）。酯類物質(zhì)在后酵后期（20～30 d）快速積累，說明后發(fā)酵階段是一些酯類（乳酸乙酯、己酸乙酯）形成的關(guān)鍵時(shí)期，酯類風(fēng)味可以通過氨基酸、有機(jī)酸及其他物質(zhì)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。發(fā)酵30 d 的黃酒樣品中的乙醛含量較高為6572.29 μg/L，在發(fā)酵前期呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，后酵期間顯著下降（P＜0.05）。這說明在發(fā)酵后期乙醛在酒醪微生物的作用下存在一定降解。

研究發(fā)現(xiàn)，谷物發(fā)酵能增加黃酒中的的非烴類揮發(fā)性化合物，如酸類化合物[31]。酸類物質(zhì)特別是有機(jī)酸（如琥珀酸、乳酸等）對(duì)黃酒良好風(fēng)味的形成具有重要影響[26]。紅谷黃酒產(chǎn)生了大量的乙酸，其是最重要的揮發(fā)性酸，占黃酒總酸的20%以上。醇、酯、酸、醛等風(fēng)味物質(zhì)的相互融合，賦予了紅谷黃酒豐滿、醇香、協(xié)調(diào)的感官品質(zhì)。

2.3 發(fā)酵過程中Alpha 多樣性分析

如表3 所示，10 次取樣中細(xì)菌和真菌不重復(fù)的OTU 總個(gè)數(shù)分別為438 和246。在97%相似度情況下，細(xì)菌ACE 指數(shù)為252.34～372.68，Shannon 指數(shù)為1.65～4.72，Chao 1 指數(shù)為234.03～395.22，覆蓋率99.90%～99.94%。發(fā)酵5 d 和20 d 細(xì)菌Chao 1指數(shù)和ACE 指數(shù)數(shù)值較高，表明發(fā)酵5 d 和20 d 細(xì)菌群落豐富度較高，群落結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。發(fā)酵4 d的Shannon 指數(shù)最高，隨后逐漸降低，可能是發(fā)酵過程中低氧、高酸及高乙醇等因素導(dǎo)致許多細(xì)菌生長(zhǎng)受抑制。

表3 發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)表Table 3 Table of bacteria and fungi diversity indexes during fermentation

發(fā)酵過程中真菌ACE 指數(shù)為96.59～220.62，Shannon 指數(shù)為1.28～3.69，Chao 1 指數(shù)為89.50～176.00，覆蓋率99.97%～99.99%。發(fā)酵30 d 的Shannon 指數(shù)最大，表明發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒糟微生物多樣性遠(yuǎn)高于發(fā)酵期。實(shí)驗(yàn)樣品中細(xì)菌和真菌文庫覆蓋率都較高，表明本次測(cè)序結(jié)果基本能夠代表樣品實(shí)際情況。

2.4 發(fā)酵過程中菌落結(jié)構(gòu)變化

2.4.1 細(xì)菌結(jié)構(gòu) 在門水平10 次取樣共檢測(cè)出14 個(gè)細(xì)菌門，主要細(xì)菌門（平均含量大于1%）有變形桿菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）（圖1a）。10 次取樣中均有分布且相對(duì)豐度較高的為Proteobacteria 和Firmicutes。變形菌門是細(xì)菌中最大一門，包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等著名的種類[36]，生長(zhǎng)可能會(huì)受到發(fā)酵過程中低氧、高酸及高乙醇等因素抑制。

圖1 發(fā)酵過程中主要細(xì)菌門和主要細(xì)菌屬分布Fig.1 Changes in relative abundance of major bacterial phylum and major bacterial genus during fermentation

在屬水平10 次取樣共檢測(cè)出228 個(gè)細(xì)菌屬，主要菌屬（平均含量大于0.1%）有克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、乳球菌屬（Lactococcus）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、片球菌屬（Pediococcus）、大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、布勞特氏菌屬（Blautia）（圖1b）。發(fā)酵過程中主要優(yōu)勢(shì)菌屬為Klebsiella、Lactobacillus、Lactococcus和Pediococcus。隨著發(fā)酵進(jìn)行Lactobacillus相對(duì)豐度逐漸增加并在發(fā)酵末期成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，這與韓國米酒中發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬細(xì)菌在米酒發(fā)酵階段逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌結(jié)果一致[37]。乳桿菌屬、片球菌屬、乳球菌屬都是乳酸菌，乳酸菌在釀造過程中能利用發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸等降低酒中pH，并且乳酸與乙醇反應(yīng)生成酯類是酒中重要風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)乳酸菌代謝產(chǎn)生乙酰和雙乙酰賦予酒特色風(fēng)味[38]。腸桿菌屬一般為非條件致病菌或條件致病菌，部分腸桿菌屬是為人體腸道內(nèi)正常微生物，能夠利用糖酵解和戊糖磷酸途徑對(duì)糖進(jìn)行降解產(chǎn)生有機(jī)酸[37]。芽孢桿菌的α-淀粉酶活性和糖化酶活性很高[37,39]，有利于黃酒主發(fā)酵的糖化，但紅谷黃酒中未發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌，這可能是酒曲原料及釀造工藝的不同，導(dǎo)至酒曲微生物組成也不同。

2.4.2 細(xì)菌屬群落結(jié)構(gòu)相似性 由NMDS 圖（圖2a）可知，發(fā)酵3、7 d 的細(xì)菌屬群落同在第三象限；發(fā)酵2、4、5、6、10、20、30 d 的細(xì)菌屬群落較近，都靠近橫軸差異較小；發(fā)酵1 d 細(xì)菌屬遠(yuǎn)離其他發(fā)酵時(shí)間的，差異較大為單獨(dú)群組。如圖2b，10 次取樣細(xì)菌屬群落可分為3 類，發(fā)酵3、7 d 的細(xì)菌屬群落可聚為一類，發(fā)酵2、4、5、6、10、20、30 d 的細(xì)菌屬群落聚為一類，發(fā)酵1 d 細(xì)菌屬單獨(dú)為一類。NMDS 圖分析結(jié)果和Beta 分析較為相似。

圖2 細(xì)菌屬群落結(jié)構(gòu)相似性分析Fig.2 Community structure similarity analysis of bacterial genera

2.4.3 真菌結(jié)構(gòu) 在門水平上10 次取樣共檢測(cè)出7 個(gè)真菌門，主要（平均含量大于1%）為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（圖3a）。在整個(gè)發(fā)酵過程中Ascomycota 是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，說明其在發(fā)酵過程中起主要作用。有研究表明子囊菌門不僅是黃酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢(shì)真菌，也是白酒及食醋等多種發(fā)酵食品中主要真菌群落[40]。子囊菌中有些著名真菌（釀酒酵母等）是烘焙和釀造工業(yè)的基礎(chǔ)菌株[41]。

在屬水平上10 次取樣共檢測(cè)出108 個(gè)真菌屬，主要的真菌屬（平均含量大于0.1%）有紅曲霉屬（Monascus）、酵母屬（Saccharomyces）、塞伯林德納氏酵母屬（Cyberlindnera）、Apiotrichum、米勒氏酵母屬（Millerozyma）、Saitozyma、鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）、被孢霉屬（Mortierella）、分子孢子菌屬（Cladosporium）（圖3b）。不同發(fā)酵時(shí)期真菌群落組成相似但豐度存在較大差異。Monascus、Saccharomyces在發(fā)酵過程中是優(yōu)勢(shì)真菌屬。酵母菌屬是一種重要真菌有較強(qiáng)發(fā)酵、高產(chǎn)乙醇能力，乙醇耐受性強(qiáng)，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖等產(chǎn)生酒精，在釀酒工業(yè)中有著重要應(yīng)用[42]，是白酒釀造過程中最主要的功能菌株[43]。

圖3 發(fā)酵過程中主要真菌門和主要真菌屬的分布Fig.3 Changes in relative abundance of major fungi phylum and major fungi genus during fermentation

2.4.4 真菌屬群落結(jié)構(gòu)相似性 由主成分分析（圖4a）可知，發(fā)酵2、3、7 d 的真菌屬群落距離較近，差異性較??；發(fā)酵4、5、6、10 d 的真菌屬群落距離較近，差異性較?。话l(fā)酵1、20、30 d 的真菌屬群落均離其他菌落較遠(yuǎn)，差異較大為單獨(dú)組群。由NMDS 圖分析（圖4b）可知，10 次取樣真菌群落聚類分析后可分為5 個(gè)類群，發(fā)酵2、3、7 d 的真菌屬聚為一類，發(fā)酵4、5、6、10 d 的真菌屬聚為一類，發(fā)酵1、20、30 d 的真菌屬分別單獨(dú)為一類。Beta 分析結(jié)果與PCA 分析較為相似。

圖4 真菌屬群落結(jié)構(gòu)相似性分析Fig.4 Community structure similarity analysis of fungi genera

2.5 發(fā)酵過程中微生物群落與代謝產(chǎn)物相關(guān)性

2.5.1 理化指標(biāo)與微生物群落相關(guān)性分析 利用SPSS 軟件對(duì)紅谷黃酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)與微生物多樣性進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。如表4 所示，細(xì)菌多樣性與還原糖呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.664（P＜0.05）；與總酸呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.644（P＜0.05）；氨基態(tài)氮與真菌多樣性呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.643（P＜0.05）。

表4 發(fā)酵過程中理化指標(biāo)與微生物多樣性的相關(guān)性Table 4 Correlation coefficients between physicochemical indicators and microbial diversity during fermentation

2.5.2 微生物群落與揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)性 圖5 顯示微生物與揮發(fā)性化合物相關(guān)性。3 個(gè)細(xì)菌屬與揮發(fā)性化合物顯著相關(guān)（P＜0.05）。Klebsiella與辛酸乙酯顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Lactobacillus與2,3-丁二醇、乳酸乙酯極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Lactococcus與乙醇、2-丁醇、異丁醇、苯乙醇和棕櫚酸乙酯呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。有研究表明Lactobacillus是醬香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中最常見重要微生物菌群[44]。Lactobacillus在谷物當(dāng)中普遍存在，能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，為酵母形成乳酸乙酯提供底物，而乳酸乙酯是白酒中重要的風(fēng)味成分之一[45]。Lactobacillus和Klebsiella與醋酸呈現(xiàn)較強(qiáng)的相關(guān)性[46]。

圖5 紅谷黃酒發(fā)酵過程中微生物群落與揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)性熱圖Fig.5 Heatmap of correlation between microbial community and volatile substances during fermentation of red millet Huangjiu

9 個(gè)真菌屬與揮發(fā)性化合物顯著相關(guān)（P＜0.05）。Monascus與乳酸乙酯顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Cyberlindnera與2,3-丁二醇和乳酸乙酯極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；Apiotrichum與2-丁醇、異丁醇和異戊醇顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Millerozyma與亞油酸乙酯和乙醛顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；Saitozyma、Fusarium、Alternaria、Mortierella和Cladosporiu與2,3-丁二醇以及乳酸乙酯顯著正相關(guān)（P＜0.05）；Fusarium與乙酸乙酯和辛酸乙酯顯著正相關(guān)（P＜0.05）；洪家麗等[18]研究發(fā)現(xiàn)米曲霉和紫色紅曲霉等真菌與發(fā)酵過程中的大部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，這與本研究類似。酵母菌屬在發(fā)酵過程中對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的影響較大，與乳酸乙酯和亞油酸乙酯呈正相關(guān)[47]，而本文結(jié)果中酵母菌屬與乳酸乙酯負(fù)相關(guān)，與亞油酸乙酯呈正相關(guān)，但結(jié)果并不顯著（P＞0.05）。鏈格孢屬與酸類物質(zhì)有較強(qiáng)的相關(guān)性，與風(fēng)味的形成關(guān)系密切[48]，在空氣中大量存在，能夠在糧食中快速生長(zhǎng)但不利于大曲發(fā)酵和白酒釀造[49]。鏈格孢屬與異丁醇有極強(qiáng)的相關(guān)性[46]，在本研究中鏈格孢屬與異丁醇呈正相關(guān)，但結(jié)果并不顯著（P＞0.05）。

3 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)分析紅谷黃酒不同發(fā)酵時(shí)期樣品中微生物群落及其多樣性。結(jié)果顯示紅谷黃酒不同發(fā)酵時(shí)期共檢測(cè)出14 個(gè)細(xì)菌門和228 個(gè)細(xì)菌屬；7 個(gè)真菌門和108 個(gè)細(xì)菌屬。不同時(shí)期菌落結(jié)構(gòu)相似但豐度卻有較大差異，體現(xiàn)了紅谷黃酒發(fā)酵過程微生物組成種類的復(fù)雜程度。

對(duì)紅谷黃酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)及風(fēng)味與微生物多樣性進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析顯示，發(fā)酵過程中細(xì)菌屬水平與總酸正相關(guān)，與還原糖負(fù)相關(guān)，真菌屬水平與氨基態(tài)氮正相關(guān)。3 個(gè)細(xì)菌屬、9 個(gè)真菌屬與揮發(fā)性化合物顯著相關(guān)（P＜0.05）。乳酸桿菌屬在發(fā)酵過程中逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌屬，為酒中重要風(fēng)味乳酸乙酯的形成提供底物。酵母菌屬在發(fā)酵過程中對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的影響較大，與多種酯類物質(zhì)的形成有相關(guān)性。這些對(duì)酒風(fēng)味物質(zhì)的改善有重要的意義。

酒的品質(zhì)、風(fēng)味受微生物代謝產(chǎn)物影響很大，本研究通過對(duì)紅谷黃酒發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及與風(fēng)味相關(guān)性進(jìn)行分析，為后續(xù)紅谷黃酒品質(zhì)提升與發(fā)展提供理論參考。但是同時(shí)也有一些可能對(duì)人體健康構(gòu)成潛在威脅的物質(zhì)被檢出，例如致病菌克雷伯氏菌屬，這說明黃酒在釀造過程中尤其是主發(fā)酵階段容易受原料、環(huán)境和病原微生物的影響，在今后釀造黃酒的過程中應(yīng)如何避免這類物質(zhì)的污染還有待研究，或許可以從原料的滅菌、通氣的方式以及發(fā)酵環(huán)境等方面入手。