多光譜學(xué)與分子模擬技術(shù)表征甜菜苷與乳清蛋白的相互作用

胡 婷，耿 勤，付 敏，陳 軍，何雪梅，孫 健，戴濤濤,*

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007）

甜菜苷（Betanin，BT）是一種天然含氮的水溶性色素，呈現(xiàn)玫瑰紅至紫紅色[1]。廣泛分布于仙人掌科、陸商科、莧科等多種植物中，因最早在甜菜根中被發(fā)現(xiàn)而得名。甜菜苷是一類可食用天然色素，被批準(zhǔn)用于食品和藥品中的紅色著色劑[2]。甜菜苷作為一種天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗癌、抗炎癥、降血壓、降血脂等多種益于人體健康的生物活性[3]。與花青素相比，甜菜苷能在富含維生素C 和低酸性環(huán)境下維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和色澤[4]，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。然而，溫度、pH、氧氣等多種因素會(huì)促進(jìn)甜菜苷的降解，使其從艷麗的紫紅色褪為淺黃色，其抗氧化性等活性也隨之下降。高溫作為影響甜菜苷穩(wěn)定性的最大因素，在食品加工工業(yè)中極大地限制了甜菜苷的應(yīng)用。因此，尋找一種合適的保護(hù)方法至關(guān)重要。

蛋白質(zhì)作為一種公認(rèn)安全的可食用載體，因具有豐富營養(yǎng)和良好功能特性而廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[5]，可以與多種生物活性物質(zhì)發(fā)生相互作用，形成復(fù)合物并擴(kuò)大生物活性物質(zhì)在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。乳清蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物全價(jià)蛋白質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值高，容易消化吸收，具有多種人體必需的氨基酸[6]，有優(yōu)良的溶解性、乳化性、起泡性等，在食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。乳清蛋白是指牛乳在pH4.6 時(shí)酪蛋白沉淀后的可溶性蛋白的總稱，占乳蛋白的18%～20%[7]。乳清分離蛋白（Whey protein isolate, WPI）是將蛋白質(zhì)含量純化至90%以上的乳清蛋白粉末。

目前有大量的研究表明，蛋白質(zhì)能與小分子發(fā)生相互作用，形成復(fù)合物，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響并保護(hù)小分子的活性。蛋白質(zhì)與甜菜苷相互作用的研究雖不多，卻為提高甜菜苷的穩(wěn)定性提供了良好的思路。大豆蛋白纖維被證明能與甜菜苷通過疏水相互作用形成聚集體，并提高甜菜苷的熱穩(wěn)定性[8]；11S 藜麥種子蛋白與甜菜苷結(jié)合并作為甜菜苷的負(fù)載體，能減少甜菜苷與氧和光的接觸，從而提高甜菜苷的穩(wěn)定性[9]。由此可見，蛋白可能是一類較好的主體生物聚合物，能與甜菜苷發(fā)生相互作用，從而提高甜菜苷穩(wěn)定性。然而，目前關(guān)于蛋白與甜菜苷相互作用機(jī)制的研究較少，且蛋白質(zhì)提高甜菜苷穩(wěn)定性的機(jī)理尚不明確。因此，為探明甜菜苷與蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)制及對甜菜苷穩(wěn)定性的影響，本研究以乳清分離蛋白和甜菜苷為研究對象，明確乳清分離蛋白對甜菜苷熱穩(wěn)定的影響以及甜菜苷對蛋白內(nèi)源熒光、表面疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，并采用多光譜學(xué)結(jié)合分子模擬的方法探究乳清分離蛋白與甜菜苷的相互作用機(jī)制，為色素穩(wěn)定的研究及功能性蛋白色素復(fù)合物的應(yīng)用開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白（WPI，Hilmar 9410，純度＞90%）美國Hilmar 公司；甜菜苷（用糊精稀釋的紅甜菜根的提取物，CAS：S26010-25g） 上海源葉生物科技有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸鹽（ANS） 美國Sigma公司；PBS 磷酸鹽緩沖液 北京索萊寶科技有限公司。

UV-2450 紫外可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；F-7000 型熒光光度計(jì) 日本Hitachi 公司；MOS-450 型圓二色譜儀 法國Bio-Logic 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳清分離蛋白-甜菜苷復(fù)合物的制備 乳清分離蛋白粉末溶于10 mmol/L PBS 緩沖液（pH7.0），過夜攪拌以使蛋白質(zhì)充分水合，在4 ℃下保存。甜菜苷溶于10 mmol/L PBS 緩沖液（pH7.0），現(xiàn)配現(xiàn)用。復(fù)合物的制備方法在Huang 等[10]的基礎(chǔ)上稍作修改。乳清分離蛋白溶液與甜菜苷溶液按一定比例混合，磁力攪拌30 min，形成乳清分離蛋白-甜菜苷混合液。

1.2.2 濁度的測定 采用紫外可見分光光度計(jì)在600 nm 處測量WPI-Betanin 混合液的濁度，以相應(yīng)濃度的甜菜苷水溶液作為空白，通過宏觀濁度的比較初步判定復(fù)合物的形成[11]。乳清分離蛋白的終濃度為20 mg/mL，乳清分離蛋白與甜菜苷的質(zhì)量比分別為16:0、16:1、16:2、16:4、16:8。

1.2.3 紫外光譜測定 采用紫外光譜測定WPIBetanin 體系的紫外吸收，實(shí)驗(yàn)方法在Cai 等[12]的方法上稍作修改，將1.6 mg/mL 乳清分離蛋白母液與0.4 mg/mL 甜菜苷母液按不同比例配制成具有不同甜菜苷含量的WPI-Betanin 混合體系，使得體系中蛋白濃度為0.8 mg/mL、甜菜苷濃度為0.05、0.1、0.2 mg/mL。掃描WPI-Betanin 混合體系在250～345 nm 的紫外圖譜，以甜菜苷水溶液的紫外吸收為空白，并予以扣除。

1.2.4 內(nèi)源熒光光譜測定 采用F-7000 熒光光譜儀測定WPI-Betanin 混合體系的內(nèi)源熒光。熒光光譜測量方法根據(jù)前人的研究方法[13]有所改動(dòng)。將1.6 mg/mL 乳清分離蛋白母液與0.4 mg/mL 甜菜苷母液按不同比例配制成具有不同甜菜苷含量的WPI-Betanin 混合體系，使得體系中蛋白濃度為0.8 mg/mL、甜菜苷濃度為0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2 mg/mL。在298、304、310 K溫度條件下，測定WPI-Betanin 混合體系的內(nèi)源熒光，激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫波長均為2.5 nm，在290～480 nm 處收集熒光發(fā)射光譜，掃描前分別在298、304、310 K 溫度條件下水浴30 min。

內(nèi)源熒光猝滅數(shù)據(jù)采用Stern-Volmer 方程（1）分析，WPI-Betanin 復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)通過雙對數(shù)方程（2）計(jì)算，采用Van’t Hoff 方程（3）和方程（4）計(jì)算WPI-Betanin 復(fù)合物結(jié)合過程中的焓變（ΔH），熵變（ΔS）和吉布斯自由能變化（ΔG），進(jìn)一步推斷復(fù)合物的相互作用機(jī)制[14]。

式中：F0：乳清分離蛋白起始內(nèi)源熒光；Fc：添加甜菜苷之后的內(nèi)源熒光；[BT]：甜菜苷濃度；KSV：Stern-Volmer 猝滅常數(shù)；Kq：乳清分離蛋白猝滅速率；τ0：生物大分子猝滅平均壽命6.2×10-9s[15]。

式中：Ka：結(jié)合常數(shù)；通用氣體常數(shù)R=8.314 J·mol-1·K-1；反應(yīng)溫度T=298、304、310 K。

1.2.5 表面疏水性的測定 采用F-7000 熒光光度計(jì)，以8-苯胺-1-萘磺酸鹽（ANS）為熒光探針測定表面疏水性[16]，激發(fā)波長為390 nm，激發(fā)狹縫寬度為2.5 nm，發(fā)射狹縫寬度為5.0 nm。將16 μL 8 mmol/L ANS 添加到3.2 mL WPI-Betanin 混合溶液（蛋白濃度為0.8 mg/mL，甜菜苷濃度分別為0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2 mg/mL）中。相應(yīng)的甜菜苷的背景熒光被扣除以矯正熒光數(shù)據(jù)，以ANS 熒光強(qiáng)度來表示乳清分離蛋白的表面疏水性[17]。

1.2.6 圓二色譜的測定 采用圓二色譜儀測定WPIBetanin 復(fù)合體系的遠(yuǎn)紫外圓二色譜。在乳清分離蛋白濃度為0.8 mg/mL，甜菜苷濃度分別為0 （對照組）、0.1、0.2 mg/mL 時(shí)，測定乳清分離蛋白在200～240 nm下的遠(yuǎn)紫外吸收?？鄢鄳?yīng)濃度的甜菜苷背景后，根據(jù)DICHROWEB CONTIN 在線的方法計(jì)算乳清分離蛋白的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲含量變化[18]。

1.2.7 分子對接模擬 采用Discovery Studio 2019軟件中的CDOCKER 程序進(jìn)行分子對接可視化地研究乳清分離蛋白與甜菜苷的相互作用。CDOCKER程序是Discovery Studio 中的一種半柔性分子對接分析方法。從PDB 數(shù)據(jù)庫中獲取了包括β-乳球蛋白（PDB: 3NPO）、α-乳白蛋白（PDB: 1HFZ）、牛血清白蛋白（PDB: 3V03）和乳鐵蛋白（PDB: 1BLF）在內(nèi)的乳清分離蛋白的主要蛋白結(jié)構(gòu)，從PubChem 數(shù)據(jù)庫中獲得甜菜苷分子結(jié)構(gòu)。然后將甜菜苷結(jié)構(gòu)及以上四種蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入分子對接軟件中，受體蛋白與配體甜菜苷賦予CHARMm 力場，采用CDOCKER 程序進(jìn)行分子對接。在2000 步的加熱程序下將WPIBetanin 加熱至700 K，然后在5000 步的降溫程序下將WPI-甜菜苷降溫至298 K。保存最多10 個(gè)對接結(jié)果，對接的聚類半徑為0.5 ?。選擇CDOCKER相互作用能（CDOCKER interaction energy）最低的對接結(jié)果為最優(yōu)構(gòu)象，進(jìn)行相互作用分析。

1.2.8 乳清分離蛋白對甜菜苷的保護(hù)作用 為了便于觀察蛋白質(zhì)對甜菜苷的熱保護(hù)效果，從宏觀上體現(xiàn)乳清分離蛋白-甜菜苷復(fù)合物在加熱過程中的顏色變化，本部分采用較高濃度的乳清分離蛋白與甜菜苷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別制備WPI 終濃度為5、10 mg/mL，甜菜苷終濃度為5 mg/mL 的WPI-Betanin 復(fù)合物，使體系中WPI 與甜菜苷的質(zhì)量比分別為1:1 和2:1。甜菜苷溶于PBS 緩沖液作為對照組。三組溶液在避光條件下80 °C 水浴加熱60 min。此后，將樣品放入冰水中冷卻，然后在設(shè)定的時(shí)間（0、10、30、60 min）進(jìn)行表征。WPI-Betanin 混合體系中甜菜苷含量的測量方法在Liu 等[19]的基礎(chǔ)上略加改動(dòng)，將樣品以2500 g（8000 r/min）離心30 min 后使用紫外-可見分光光度計(jì)測定甜菜苷的濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法在538 nm 處測定甜菜苷含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)三次或以上，采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算整理和統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 2021 軟件繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±平均偏差表示，P＜0.05 代表樣品間存在顯著性差異，在圖中用不同字母表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清分離蛋白-甜菜苷復(fù)合物的形成

通過使用紫外可見光譜法測量濁度來驗(yàn)證WPI-Betanin 復(fù)合物的形成。當(dāng)由光波的散射而形成膠體粒子時(shí)，溶液的濁度會(huì)增加。濁度增加的幅度取決于顆粒的數(shù)量、大小和折射率對比度等。因此，濁度的測量可以快速指示膠態(tài)顆粒的形成[20]。圖1顯示了乳清分離蛋白：甜菜苷質(zhì)量比對乳清分離蛋白-甜菜苷溶液的外觀和濁度的影響。當(dāng)乳清分離蛋白與甜菜苷的比例從16:0 增加至16:8 時(shí)，濁度從0.290 顯著提高至0.306 cm-1（P＜0.05），從外觀上看，溶液變得越來越混濁，但在室溫下儲(chǔ)存一天之后，也并沒有沉淀跡象。這些結(jié)果表明乳清分離蛋白與甜菜苷形成了相對較小的膠體復(fù)合物，具有較強(qiáng)的抗重力沉淀能力。

圖1 不同比例甜菜苷對乳清分離蛋白濁度的影響Fig.1 Effect of different proportions of betanin on turbidity of WPI

2.2 紫外光譜

蛋白質(zhì)分子微環(huán)境中芳香族氨基酸殘基的變化可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的紫外吸收發(fā)生變化，因此可以應(yīng)用蛋白質(zhì)的紫外光譜來分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。紫外光譜可反映乳清分離蛋白與甜菜苷間的相互作用，表現(xiàn)為紫外光譜峰值的藍(lán)移或紅移、信號(hào)的增強(qiáng)或減弱。圖2 中顯示乳清分離蛋白在280 nm 處有最大吸收峰，此處的吸收可能是由于色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）存在C=O 鍵的紫外吸收[12]。乳清分離蛋白的紫外吸收隨著甜菜苷濃度的增加而增加，進(jìn)一步證明乳清分離蛋白與甜菜苷發(fā)生了相互作用，改變了色氨酸和酪氨酸的微環(huán)境[13]。吳云雪等[21]觀察到了類似的現(xiàn)象，表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）與乳清分離蛋白發(fā)生相互作用，蛋白的紫外吸收隨著EGCG 含量的增加而增加。

圖2 不同濃度甜菜苷對乳清分離蛋白紫外吸收的影響Fig.2 Ultraviolet spectra of WPI treated by betanin with different betanin concentrations

2.3 熒光發(fā)射光譜

于280 nm 的激發(fā)波長，測定了0.6～1.2 mg/mL乳清分離蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度。從圖3A 可得知，乳清分離蛋白在0.6～1.2 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)蛋白的熒光強(qiáng)度隨其濃度呈現(xiàn)先增后減的關(guān)系，且分為兩段線性關(guān)系，最大值位于0.9 mg/mL，因此選擇了0.8 mg/mL 的蛋白濃度進(jìn)行內(nèi)源熒光實(shí)驗(yàn)，該濃度可以避免蛋白濃度過高而引起的內(nèi)濾效應(yīng)，提高實(shí)驗(yàn)精度。圖3B～D 顯示了在298、304、310 K 溫度下，不同濃度甜菜苷對乳清分離蛋白內(nèi)源熒光的猝滅效果。乳清分離蛋白的色氨酸在280 nm 的激發(fā)波長下在332 nm 處有最大的熒光發(fā)射峰，熒光強(qiáng)度隨著甜菜苷濃度的增加而不斷下降，表明甜菜苷對乳清分離蛋白有熒光猝滅效果。此外，由圖2 中可知，甜菜苷在0.2 mg/mL 濃度下，其紫外吸收非常低，（A280+A332）/2＜0.1，這表明甜菜苷對乳清分離蛋白幾乎不產(chǎn)生內(nèi)濾效應(yīng)[16]，這個(gè)熒光強(qiáng)度的下降可能是由于甜菜苷與乳清分離蛋白發(fā)生了相互作用并形成復(fù)合物，改變了乳清分離蛋白中酪氨酸和色氨酸的微環(huán)境。類似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在一些多酚與乳清分離蛋白的相互作用中，咖啡酸（CA）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）與乳清分離蛋白通過非共價(jià)相互作用結(jié)合，猝滅了乳清分離蛋白的內(nèi)源熒光[22]。

圖3 不同濃度乳清分離蛋白的熒光強(qiáng)度和不同濃度甜菜苷對乳清分離蛋白的熒光猝滅Fig.3 Fluorescence intensity of WPI at different concentrations and fluorescence quenching of WPI at different concentrations of betanin

2.4 熒光猝滅機(jī)制及結(jié)合參數(shù)

如圖4 所示，在298、304、310 K 溫度下，Stern-Volmer 方程具有良好的擬合性，表明甜菜苷猝滅為動(dòng)態(tài)或靜態(tài)單一猝滅類型[23]。由表1 可知，在298、304、310 K 溫度下，WPI-Betanin 的猝滅常數(shù)分別為2.06×102·mol-1、2.26×102·mol-1和2.58×102·mol-1。最小的猝滅速率常數(shù)Kq（Kq=KSV/τ0）為3.32×1010L·mol-1·s-1明顯大于各類猝滅劑對生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率2.0×1010L· mol-1·s-1，表明甜菜苷猝滅乳清分離蛋白內(nèi)源熒光的機(jī)制為靜態(tài)猝滅過程[24]。對于靜態(tài)猝滅過程，可以采用雙對數(shù)方程（2）計(jì)算乳清分離蛋白與甜菜苷之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。從表1中可知，在不同溫度下甜菜苷與乳清分離蛋白的結(jié)合常數(shù)分別為1783.16 L/mol （298 K）、672.59 L/mol（304 K）、259.81 L/mol（310 K），結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而明顯降低，說明溫度對乳清分離蛋白-甜菜苷相互作用的影響比較大，溫度較低時(shí)結(jié)合得越緊密，這可能是因?yàn)榛钚孕》肿犹鸩塑諏Ω邷剌^敏感。溫度對結(jié)合位點(diǎn)數(shù)幾乎沒有影響，三種溫度下的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均接近1，表明乳清分離蛋白與甜菜苷以1:1 的比例復(fù)合。

圖4 乳清分離蛋白-甜菜苷在298、304、310 K 溫度下Stern-Volmer 擬合（A）和靜態(tài)猝滅方程的擬合（B）Fig.4 Stern-Volmer fitting (A) and static quenching equation fitting (B) at 298, 304 and 310 K for WPI and betanin

相互作用的Van’t Hoff 方程為Y=14827.67X-42.27（R2=0.99），熱力學(xué)參數(shù)ΔH 和ΔS 可由方程的斜率和截距得出。蛋白質(zhì)與活性小分子之間常常通過靜電作用力、疏水作用力、氫鍵和范德華力等非共價(jià)相互作用結(jié)合成復(fù)合物[25]。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)的不同，可判斷二者結(jié)合的作用力類型。蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合時(shí)，若ΔH＞0 及ΔS＞0 時(shí)，主要表現(xiàn)為疏水作用；若ΔH＜0 及ΔS＞0，主要表現(xiàn)為靜電作用；ΔH＜0 及ΔS＜0，主要表現(xiàn)為氫鍵或范德華力作用[26]。由表1可知，ΔG 為負(fù)值表明WPI-Betanin 復(fù)合物為自發(fā)結(jié)合的過程，ΔH 和ΔS 均為負(fù)值表明WPI-Betanin 復(fù)合物的形成為焓驅(qū)動(dòng)反應(yīng)，且主要相互作用為范德華力和氫鍵相互作用。

表1 乳清分離蛋白與甜菜苷的結(jié)合參數(shù)Table 1 Binding parameters of WPI and betanin

2.5 表面疏水性

疏水基團(tuán)指示著蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用ANS熒光探針探究乳清分離蛋白與不同濃度甜菜苷結(jié)合后表面疏水性的變化。由圖5 所示，乳清分離蛋白的表面疏水性隨著甜菜苷含量的增加而逐漸降低。表面疏水性的降低可能是由于從甜菜苷引入了極性基團(tuán)（羧基和羥基）所致[27]。此外，甜菜苷與蛋白質(zhì)表面上的疏水性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)（尤其是芳香環(huán)）結(jié)合導(dǎo)致熒光探針ANS 可檢測的表面疏水性基團(tuán)減少，這兩個(gè)因素都會(huì)導(dǎo)致疏水性降低。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）也被觀察到能使乳清蛋白的表面疏水性降低，并在240 μmol/g 的EGCG 濃度下降低50%[28]。

圖5 不同濃度甜菜苷對乳清分離蛋白表面疏水性的影響Fig.5 Effect of different concentrations of betanin on surface hydrophobicity of WPI

2.6 圓二色譜

圓二色譜主要反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。圖6 顯示，乳清分離蛋白的圓二色譜在216 nm 附近顯示了一個(gè)負(fù)峰，這是二級(jí)結(jié)構(gòu)β-折疊的特征峰。如表2 所示，在不存在甜菜苷的情況下，乳清分離蛋白含有12.5%的α-螺旋，31.1%的β-折疊，24.4%的β-轉(zhuǎn)角和31.9%的無規(guī)則卷曲，隨著甜菜苷濃度的增加，α-螺旋含量和β-轉(zhuǎn)角含量分別降至10.1%和23.8%，而β-折疊含量增加至34.2%。由此可推斷出，乳清分離蛋白與甜菜苷之間的相互作用可能導(dǎo)致了蛋白質(zhì)多肽鏈的部分解折疊，并破壞了用于穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵，使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得更加松散[29]。花青素與乳清蛋白相互作用也有類似的現(xiàn)象，乳清蛋白與紫薯粉花青素結(jié)合后，α-螺旋含量從20.8%下降到13.4%，花青素分子在乳清蛋白的α-螺旋區(qū)域結(jié)合，破壞了穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵[30]。

圖6 不同濃度甜菜苷對乳清分離蛋白圓二色譜的影響Fig.6 Effect of different concentrations of betanin on circular dichroism spectrum of WPI

表2 不同濃度甜菜苷對乳清分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effects of different concentrations of betanin on secondary structure of WPI

2.7 分子模擬

為了進(jìn)一步研究乳清分離蛋白與甜菜苷之間相互作用的位置，采用CDOCHER 分子對接可視化地進(jìn)行對接模擬。如圖7 所示，甜菜苷分別與乳清分離蛋白的主要成分α-乳白蛋白（1NFZ）、牛血清蛋白（3VO3）、乳鐵蛋白（1BLF）和β-乳球蛋白（3NPO）對接，甜菜苷被WPI 包裹在內(nèi)部。α-乳白蛋白（1HFZ）的His 107、 Asn 102、 He 101、 Asp 97 與甜菜苷通過氫鍵相互作用結(jié)合，且Asn 102 與甜菜苷形成了多個(gè)氫鍵（2.22 ?、5.73 ?、2.32 ?），Lys 108 與甜菜苷有靜電相互作用；牛血清蛋白（3V03）與甜菜苷主要通過氫鍵相互作用結(jié)合（Arg 435、Glu 186、 Lys 431、Arg 144、Leu 112、 Asp 111）；乳鐵蛋白（1BLF）的Ser 185、 His 253、Glu 187、Pro 188 與甜菜苷形成氫鍵，Asp 197、 Glu 15、 Lys 197 通過靜電相互作用與甜菜苷結(jié)合；β-乳球蛋白（3NPO）主要通過氫鍵（Gln 120、Pro 38）和靜電相互作用（Phe 105）與甜菜苷結(jié)合?？傮w而言，四種蛋白質(zhì)與甜菜苷結(jié)合以氫鍵相互作用為主，與圓二色譜數(shù)據(jù)結(jié)合，可推斷甜菜苷被包裹在蛋白質(zhì)中，與乳清分離蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)中的氨基酸發(fā)生了大量的氫鍵相互作用，從而破壞了蛋白質(zhì)α-螺旋中原有的氫鍵，降低了α-螺旋的含量。

圖7 甜菜苷分別與（A）α-乳白蛋白（1NFZ）、（B）牛血清蛋白（3VO3）、（C）乳鐵蛋白（1BLF）、（D）β-乳球蛋白（3NPO）的分子對接圖Fig.7 Molecular docking of betanin with (A) α-lactalbumin (1NFZ), (B) bovine serum protein (3VO3),(C) lactoferrin (1BLF), and (D) β -lactoglobulin (3NPO)

2.8 乳清分離蛋白對甜菜苷的保護(hù)作用

蛋白質(zhì)分子可以與小分子物質(zhì)通過自組裝形成納米運(yùn)載體，以封裝和保護(hù)某些活性物質(zhì)，或改善產(chǎn)品的穩(wěn)定性和外觀[31]。如圖8 所示，與乳清分離蛋白形成復(fù)合物后，甜菜苷在80 ℃下的保留率提高，且隨著乳清分離蛋白比例的增加而增加。加熱1 h后，甜菜苷水溶液（對照組）中的甜菜苷保留率僅為6.17%，而乳清分離蛋白與甜菜苷1:1 復(fù)合后，保留率增加到18.78%，二者2:1 復(fù)合時(shí)，甜菜苷保留率為27.26%。表明在高溫條件下，乳清分離蛋白對甜菜苷有一定的保護(hù)作用，且該保護(hù)作用依賴于蛋白質(zhì)含量。結(jié)合前文相互作用及分子模擬的研究結(jié)果，推斷該保護(hù)作用可能歸因于甜菜苷被乳清分離蛋白包裹在內(nèi)部，與蛋白中氨基酸發(fā)生了大量的非共價(jià)相互作用，在一定程度上避免了甜菜苷的熱降解。

圖8 WPI-Betanin 復(fù)合物加熱過程中甜菜苷保留率的變化Fig.8 Change of retention rate of betanin in WPI-Betanin complex during heating

3 結(jié)論

本文通過多光譜學(xué)和分子模擬技術(shù)研究了乳清分離蛋白與甜菜苷的相互作用，并探討了乳清分離蛋白對甜菜苷的熱穩(wěn)定性影響及甜菜苷對乳清分離蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響。結(jié)果表明乳清分離蛋白對甜菜苷熱穩(wěn)定性的提高具有顯著性影響，使甜菜苷在80 ℃下加熱1 h 的保留率從6.17%提高到27.26%，穩(wěn)定性的提高與乳清分離蛋白-甜菜苷復(fù)合物的形成有關(guān)。乳清分離蛋白與甜菜苷通過范德華力和氫鍵發(fā)生相互作用以1:1 的比例形成復(fù)合物，從而提升甜菜苷的熱穩(wěn)定性。同時(shí)，甜菜苷的加入使乳清分離蛋白表面疏水性降低，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量降低，β-折疊和無規(guī)卷曲的含量增加。本文深入探究了甜菜苷與乳清分離蛋白的相互作用，對于甜菜苷的保護(hù)、運(yùn)載等方面的研究提供了思路，為功能性蛋白色素復(fù)合物的應(yīng)用開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。