益生菌改善牛乳蛋白過敏性的研究進(jìn)展

曹 婷，趙麗娜，陳慶學(xué)，岳瑩雪，呂秀莉，平麗筠，李柏良，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

牛乳蛋白過敏是一種常見的過敏性疾病，通常伴隨著不良免疫反應(yīng)。牛奶是嬰兒首先接受的外來抗原，是3 歲以下兒童的主要過敏食物，這也解釋了嬰幼兒牛乳蛋白過敏高發(fā)病率的原因。據(jù)研究，高達(dá)7.5%的兒童對牛奶過敏。越來越多的證據(jù)表明益生菌對改善牛乳蛋白過敏具有良好的效果。因此，益生菌對過敏癥狀的潛在預(yù)防和治療效果引起了人們的廣泛關(guān)注。大量研究表明益生菌可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡在宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育和調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，從而改變過敏性疾病的發(fā)病風(fēng)險[1]。本文從過敏原和誘導(dǎo)機(jī)理的角度介紹牛乳過敏，闡述益生菌對改善過敏的最新研究，最后總結(jié)當(dāng)下低致敏性產(chǎn)品的研究現(xiàn)狀。

1 牛乳蛋白過敏概述

牛奶蛋白過敏（Cow milk protein allergy，CMPA）是牛乳蛋白誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生不同程度的過敏反應(yīng)。牛乳蛋白是嬰兒生長發(fā)育所需重要的營養(yǎng)物質(zhì)，它被聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）、世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）認(rèn)為是八大過敏原之一，其中，主要的過敏原是酪蛋白和乳清蛋白。過敏現(xiàn)象的出現(xiàn)與人體產(chǎn)生的免疫球蛋白E（IgE）過多有關(guān)，當(dāng)IgE 無法正常調(diào)控時產(chǎn)生以下的過敏反應(yīng)，如特應(yīng)性皮炎[2]、過敏性濕疹、過敏性哮喘和過敏性鼻炎等，這也是嬰幼兒時期的常見問題[3-4]。

1.1 過敏原

牛乳中含有引起過敏的蛋白質(zhì)約30 種[5]，其基本理化特性如表1 所示。以牛乳為主的乳源中含有的酪蛋白和乳清蛋白在成分、含量以及結(jié)構(gòu)上都與母乳有很大的差異（在牛乳中的酪蛋白:乳清蛋白=8:2；在母乳中的酪蛋白:乳清蛋白=4:6[8]），并且存在一些可以被人體免疫系統(tǒng)識別的構(gòu)象表位和線性表位（圖1）。因此，當(dāng)乳蛋白進(jìn)入人體后免疫系統(tǒng)可以識別其抗原表位，從而引發(fā)過敏反應(yīng)?；谶@個原因，已經(jīng)對IgE 及IgG 結(jié)合區(qū)域進(jìn)行了大量研究，甚至通過丙氨酸掃描分析法確定了致敏蛋白關(guān)鍵的氨基酸殘基[9]。為牛乳蛋白脫敏技術(shù)的研究提供了一定的理論依據(jù)。

表1 牛乳過敏原基本信息[6-7]Table 1 Basic information of milk allergen[6-7]

圖1 過敏表位結(jié)構(gòu)[10]Fig.1 Allergic epitope structure[10]

1.2 牛乳蛋白過敏誘導(dǎo)機(jī)理

目前，CMPA 主要分為IgE 介導(dǎo)和非IgE 介導(dǎo)兩種，誘導(dǎo)機(jī)理如表2 所示。

表2 牛乳蛋白誘導(dǎo)機(jī)制的區(qū)別Table 2 Differences in milk protein induction mechanism

IgE 介導(dǎo)的Ⅰ型急性超敏反應(yīng)是常見的免疫反應(yīng)，一般在攝入蛋白1 h 內(nèi)發(fā)生過敏反應(yīng)。這種超敏反應(yīng)發(fā)展的第一步是牛奶蛋白過敏原通過腸道粘膜呈現(xiàn)給免疫細(xì)胞誘導(dǎo)致敏然后進(jìn)行記憶誘導(dǎo)，隨后接觸牛奶蛋白過敏原發(fā)生即時反應(yīng)[11]，其致敏機(jī)制已經(jīng)有深入的研究[12-14]（圖2）。

圖2 IgE 介導(dǎo)的牛乳蛋白過敏機(jī)制[12-14]Fig.2 IgE-mediated mechanism of bovine milk protein allergy[12-14]

IgE 介導(dǎo)的CMPA 通常始于抗原呈遞細(xì)胞對蛋白抗原的內(nèi)化和加工。隨后Th 細(xì)胞被活化，以Th2途徑為主，分泌IL-4 和IL-13 細(xì)胞因子誘導(dǎo)漿細(xì)胞產(chǎn)生IgE，會與血液中肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞表面高親和力的Fc 受體特異性結(jié)合，從而產(chǎn)生組胺等物質(zhì)作用于細(xì)胞組織使機(jī)體處于致敏的狀態(tài)[14]。當(dāng)相同過敏蛋白再次進(jìn)入處于致敏狀態(tài)的機(jī)體時，就促發(fā)了激發(fā)效應(yīng)階段，多個過敏原與吸附于肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的兩個或兩個以上相鄰的IgE 結(jié)合發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使肥大細(xì)胞等效應(yīng)器細(xì)胞被激活，并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行一系列酶促反應(yīng)，從而激活致敏的肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞使其脫顆粒，進(jìn)而釋放組胺、白三烯等生物活性介質(zhì)，作用于血管，使血管擴(kuò)張、通透性增加；作用于腺體，使腺體分泌增多；作用于平滑肌，使平滑肌收縮，從而導(dǎo)致皮膚及呼吸道的不適[15]。

非IgE 介導(dǎo)的CMPA 多表現(xiàn)在攝入乳蛋白后的幾個小時到幾天后，故常被稱為“遲發(fā)型超敏反應(yīng)”。Savino 等[16]研究表明輕度至中度非IgE 介導(dǎo)的CMPA 患者的IL-4 和IL-13 平均值增加，IL-5和IL-10 平均值降低。白細(xì)胞介素5（IL-5）主要被認(rèn)為是一種Th2 細(xì)胞因子，它通過激活嗜酸性粒細(xì)胞引起過敏反應(yīng)。研究顯示IL-5 的值較低，這可能與非IgE 介導(dǎo)的食物過敏有關(guān)。目前的研究表明，Th2 分泌的IL-5 可能由于嗜酸性粒細(xì)胞的積累和激活而導(dǎo)致非IgE 細(xì)胞介導(dǎo)的過敏[10]。

2 益生菌改善牛乳過敏

由于益生菌所獨(dú)有的生物學(xué)特點(diǎn)和腸道黏膜免疫反應(yīng)的特異性，使腸道益生菌療法作為一種改善牛乳過敏的新療法日益受到重視。益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群豐度及結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)腸粘膜屏障功能、保持Th1/Th2和Treg/Th17 平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，表現(xiàn)出抗牛乳過敏的作用如表3 所示。

表3 益生菌對牛乳過敏的改善作用Table 3 Improvement effect of probiotics on milk allergy

2.1 調(diào)節(jié)腸道菌群

腸道是人體最大的免疫器官，人體和腸道菌群間進(jìn)行著活躍的代謝過程，并共同決定人的健康狀態(tài)。腸道微生物群被廣泛認(rèn)為是健康和疾病之間的重要調(diào)解者，特別是對早期宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟起著重要作用[25]。益生菌能夠改變腸道菌群豐度，調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)，潛在地降低CMPA 的風(fēng)險。

牛乳過敏者與正常人的腸道菌群有部分差異。Esber 等[17]研究鼠李糖乳桿菌LA305、唾液乳桿菌LA307 和長雙歧桿菌嬰兒亞種LA308 三種益生菌對過敏性小鼠腸道菌群的影響如表4 所示。Bunyavanich 等[26]研究表明腸道菌群組成的不同可以改變食物過敏的易感性和抗性，進(jìn)一步揭示生命早期的腸道菌群可能是影響CMPA 機(jī)制和過程的關(guān)鍵因素。在一項對226 名牛奶過敏兒童的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)3～6 個月嬰兒的腸道微生物特征與8 歲時牛奶過敏的消除有關(guān)，特別是3～6 個月的嬰兒期是形成CMPA 過程的一個特殊的發(fā)育時間窗口[27]。兒童腸道微生物群中梭狀芽胞桿菌和厚壁菌門的富集有助于在8 歲時減輕CMPA，而腸桿菌和擬桿菌門的增加導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)[28]。

表4 不同益生菌對腸道菌群豐度的影響[17]Table 4 Different probiotics on the intestinal flora abundance[17]

因此，腸道菌群的平衡對CMPA 產(chǎn)生至關(guān)重要的影響。腸道菌群可能通過調(diào)節(jié)Ⅱ型免疫、影響免疫調(diào)節(jié)和耐受、調(diào)節(jié)嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量、促進(jìn)腸道屏障功能等途徑影響食物過敏易感性[29]。并且，腸道菌群在促進(jìn)腸道免疫系統(tǒng)的成熟和觸發(fā)宿主免疫和防御反應(yīng)的介質(zhì)的傳遞、調(diào)節(jié)Th 細(xì)胞平衡和口服耐受性的獲得、維持腸道上皮細(xì)胞的完整性等方面發(fā)揮著重要作用。

2.2 提高腸道免疫

2.2.1 促進(jìn)sIgA 增加，增強(qiáng)腸粘膜屏障功能 研究發(fā)現(xiàn)腸內(nèi)益生菌不僅可以改善防御屏障，而且對增強(qiáng)嬰幼兒腸道免疫力有刺激作用[30]。嬰幼兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育相對未成熟，因此腸道抵御過敏蛋白的能力也相對較差。在腸道上層的細(xì)胞表面有一層菌膜屏障，具有免疫保護(hù)作用，維持腸道微生態(tài)；當(dāng)嬰幼兒腸道菌群失調(diào)時，有害菌會造成腸黏膜通透性改變，導(dǎo)致致敏性蛋白進(jìn)入體內(nèi)，引起過敏反應(yīng)，而益生菌定植后，能夠在腸黏膜上形成一層保護(hù)膜，不僅修復(fù)并增強(qiáng)腸黏膜的屏障功能，還調(diào)節(jié)了菌群平衡，促進(jìn)了免疫屏障的穩(wěn)固[31]。

益生菌通過促進(jìn)分泌性免疫球蛋白（slgA）的分泌，減少過敏原從腸道進(jìn)入血液。在腸道黏液層，slgA 可通過與細(xì)菌胞壁抗原決定簇結(jié)合包裹異物來減緩過敏的發(fā)生[32]。陳毅秋[18]發(fā)現(xiàn)給小鼠灌胃鼠李糖乳桿菌GG（LGG）后，LGG 在腸道定植的同時增強(qiáng)了B 細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)B 細(xì)胞分泌免疫球蛋白，顯著提高了小鼠腸道黏膜sIgA 的分泌量，從而調(diào)節(jié)了小鼠黏膜免疫系統(tǒng)，以此提高了機(jī)體免疫水平。雙歧桿菌能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生sIgA 的細(xì)胞增殖，從而使得sIgA 水平上升。Rigo-adrover 等[19]為探究哺乳期補(bǔ)充益生菌短雙歧桿菌（Bifidobacterium brevis）M-16V 對腸道和免疫系統(tǒng)成熟的影響，自新生小鼠出生后的第6～18 d 對其補(bǔ)充益生菌并進(jìn)行每日評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)短雙歧桿菌M-16V 增強(qiáng)了小鼠腸道內(nèi)IgA 的合成，促進(jìn)了早期黏膜免疫的發(fā)展。通過飼喂小鼠益生菌（嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌），然后對小鼠免疫器官的重量、脾淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、脾細(xì)胞抗體的生成、腸黏膜sIgA 含量研究發(fā)現(xiàn)，攝入一定劑量的益生菌，可增強(qiáng)小鼠特異性及非特異性免疫功能[20]。

2.2.2 減少Th2 極化，保持Th1/Th2 平衡 當(dāng)致敏蛋白質(zhì)進(jìn)入人體內(nèi)后，引起過敏反應(yīng)的程度與體內(nèi)淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)控密切相關(guān)。有研究證實(shí)嬰幼兒牛乳蛋白過敏反應(yīng)與不同亞型的T 細(xì)胞調(diào)節(jié)體系的失衡有關(guān)，早先發(fā)現(xiàn)Th2 占優(yōu)勢的Th1/Th2 細(xì)胞失衡是牛乳蛋白過敏的一個重要因素[33]。益生菌調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡過程（見圖3）。益生菌可通過增進(jìn)Th1 型免疫反應(yīng)，調(diào)控因過敏而反應(yīng)過度的Th2 型免疫反應(yīng)，從而減緩過敏癥狀[34]。Fu 等[21]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ZDY2013 和鼠李糖乳桿菌GG 口服可抑制過敏反應(yīng)，其原因主要是通過誘導(dǎo)Th1 或調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分化抑制Th2 的反應(yīng)，調(diào)節(jié)Th1/Th2 的免疫平衡；顯著增加了緊密連接蛋白的相對表達(dá)，增強(qiáng)腸道屏障功能；調(diào)節(jié)過敏引起的腸道菌群的改變。Shandilya等[22]在乳清蛋白致敏小鼠后喂養(yǎng)選育后的嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌，發(fā)現(xiàn)益生菌組小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中產(chǎn)生的Th1 特異性輔助因子增加（包括IFN-γ，IL-12 和IL-10），Th2 特異性細(xì)胞因子IL-4 下降，這表明益生菌的調(diào)節(jié)作用使血清中Th2 特異性免疫應(yīng)答向Th1 傾斜，抑制了血清中IgE 的產(chǎn)生，從而減輕小鼠對乳清蛋白的過敏反應(yīng)。這說明益生菌可通過上調(diào)Th1 細(xì)胞因子表達(dá)，下調(diào)Th2 細(xì)胞因子表達(dá)，來調(diào)節(jié)Th1/Th2 的免疫平衡來抑制過敏。

圖3 益生菌調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡過程[35]Fig.3 Probiotics regulate the process of Th1/Th2 balance[35]

2.2.3 誘導(dǎo)Foxp3+Treg，保持Treg/Th17 的平衡近年來越來越多的研究表明Treg/Th17 的失衡也是導(dǎo)致過敏性疾病的關(guān)鍵因素之一。不同轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)Q定了Treg/Th17 的平衡。Treg 細(xì)胞的Foxp3 的表達(dá)水平在維持腸道穩(wěn)態(tài)，對抗過敏反應(yīng)和抗原特異性Treg 的產(chǎn)生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在β-乳球蛋白（BLG）致敏小鼠模型中，補(bǔ)充副干酪乳桿菌L9 或長雙歧桿菌BBMN68 可以刺激樹突細(xì)胞（如CD11c+CD103+DCs）的表達(dá)和誘導(dǎo)T 細(xì)胞轉(zhuǎn)換Foxp3+ Treg 進(jìn)而抑制CMPA[23-24]。

Esber 等[17]研究表明，鼠李糖乳桿菌LA305，唾液乳桿菌LA307 和長雙歧桿菌嬰兒亞種LA308 三種益生菌誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞，可能與腸道菌群產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物，特別是乙酸、丙酸和丁酸有關(guān)[36]，腸道微生物產(chǎn)生的主要代謝物是短鏈脂肪酸（SCFAs）[37]。SCFAs 通過誘導(dǎo)保護(hù)性的黏膜Treg 細(xì)胞反應(yīng)和增強(qiáng)腸道屏障的完整性來抑制食物過敏[38]。研究表明SCFAs 通過作用于IECs 上的受體GPR43 和GPR109a，增強(qiáng)CD103+DCs 中視黃醛脫氫酶（retinal dehydrogenase，RALDH）的活性和增加抗原特異性Foxp3+Treg 細(xì)胞數(shù)目[39]。例如，SCFAs（如丁酸）可以通過識別DCs 上的GPR109a 受體促進(jìn)Treg 細(xì)胞的產(chǎn)生（缺乏GPR109a 的小鼠的Treg 細(xì)胞數(shù)量則會降低），這表明在DCs 中SCFAs-GPR109a 軸在食物過敏原的免疫耐受中起著關(guān)鍵作用[40]。SCFAs 也可以直接調(diào)節(jié)T 細(xì)胞優(yōu)先分化成Treg 細(xì)胞，其機(jī)制可能是由于SCFAs 通過識別GPR109a 或GPR43 來增加Foxp3位點(diǎn)的組蛋白H3 乙?；痆41-42]。在短鏈脂肪酸中，丁酸是維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)所必需的，并在免疫耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在過敏性疾病中具有強(qiáng)烈的抗炎作用。另外，丁酸鹽參與了食物免疫耐受性的形成，特別是在嬰兒出生后的頭1000 d[43]。SCFA在預(yù)防過敏中的作用，發(fā)現(xiàn)丁酸鹽水平最高的兒童對食物過敏原過敏的風(fēng)險降低[44]。近來有研究表明，益生菌胞外多糖對過敏機(jī)體內(nèi)T 細(xì)胞分化與樹突狀細(xì)胞活化也具有調(diào)節(jié)作用。益生菌胞外多糖介導(dǎo)T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Foxp3+Treg 細(xì)胞，通過分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子來逆轉(zhuǎn)特異性Th2 偏倚的免疫反應(yīng)[45]。

益生菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群、提高腸道免疫，有利于維持腸道健康。直接食用益生菌制劑具有一定的風(fēng)險且不易于人們接受。利用奶及奶制品作為益生菌的載體，進(jìn)而開發(fā)低致敏性產(chǎn)品是食用益生菌的有效途徑。

3 益生菌在低致敏性牛乳開發(fā)中的應(yīng)用

3.1 配方奶粉

大多數(shù)患有CMPA 的兒童年齡小于1 歲，在沒有母乳的情況下可能需要低過敏性配方奶粉[46]。而添加LGG 的以酪蛋白水解物為基礎(chǔ)的嬰兒配方奶粉可以刺激CMPA 患兒的免疫耐受，并減少CMPA的發(fā)生率[47]。為了消除牛乳蛋白的致敏性，理應(yīng)開發(fā)最適合嬰兒生長發(fā)育的低致敏性產(chǎn)品。

低致敏性產(chǎn)品的選擇取決于兩個主要因素，即營養(yǎng)充足性和過敏原性。采用益生菌降低配方奶粉的過敏原性是一種有效方法。Guest 等[48]選擇940 位對廣泛水解配方粉過敏的嬰兒，通過臨床試驗進(jìn)一步證明，喂養(yǎng)添加鼠李糖乳桿菌的水解配方粉，24 個月后，77%的嬰兒患腸道疾病、濕疹和哮喘癥狀顯著減輕[48]。Nocerino 等[49]也證明喂養(yǎng)添加鼠李糖乳桿菌水解配方粉的嬰兒縮短了免疫耐受的獲得時間[49]，這可能是由于鼠李糖乳桿菌增強(qiáng)了腸上皮細(xì)胞的增殖分化、緊密連接蛋白的形成，從而減緩牛乳過敏患兒的過敏進(jìn)程。然而，目前根據(jù)歐洲兒科胃腸病學(xué)和營養(yǎng)學(xué)會（ESPGHAN）評估，由于配方粉中所含益生菌的真正安全性尚未得到充分驗證，還未應(yīng)用到商業(yè)生產(chǎn)低致敏配方粉中，有待進(jìn)一步對其安全性進(jìn)行研究。

3.2 發(fā)酵乳制品

發(fā)酵是最古老的食品加工技術(shù)之一。發(fā)酵乳制品的特點(diǎn)是具有更好的消化率和降敏性[50]。最近研究表明，CMPA 兒童可以耐受酸奶，這表明發(fā)酵的牛奶也可以作為CMPA 患者的食品。益生菌發(fā)酵生產(chǎn)的酸奶中，乳清蛋白的過敏性顯著降低，β-乳球蛋白的致敏性顯著降低，酪蛋白的致敏特性也由于牛奶發(fā)酵的干酪乳桿菌而降低[51]。不同益生菌對乳蛋白抗原性的降低效率不同，這為開發(fā)用于CMPA 管理的新型發(fā)酵乳提供了可能性。Anggraini 等[52]研究保加利亞菌是降低水牛和山羊酪蛋白過敏原的最佳菌種。保加利亞嗜熱鏈球菌感染12～18 h。發(fā)酵后，乳清過敏原在脫脂牛奶和乳清提取物中均有輕微降解。結(jié)果表明在各種酪蛋白源中山羊酪蛋白的致敏性顯著降低。Biscola 等[53]研究巴西手工成熟奶酪，手工奶酪可以作為蛋白水解益生菌的來源，具有成為新型低過敏性乳制品的潛力。其中糞腸桿菌VB43對牛奶酪蛋白具有較好的水解活性，能夠廣泛水解αS1-CN、αS2-CN 和β-CN。Nath 等[54]研究用液態(tài)乳蛋白濃縮物（LMPC）經(jīng)嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌水解和胰蛋白酶酶解后制備具有低致敏性的生物活性肽。由于微生物水解，酪蛋白對抗體Rb 抗酪蛋白的抗原性降低。隨著0.016 g·L-1胰蛋白酶處理LMPC經(jīng)發(fā)酵后未見致敏性。

發(fā)酵是開發(fā)低致敏性產(chǎn)品有效的技術(shù)途徑，它具有條件溫和、工藝簡單、可行性強(qiáng)的優(yōu)勢。因此，研究生產(chǎn)低致敏性產(chǎn)品既能保證過敏人群的安全食用，也為我國低致敏性產(chǎn)品的開發(fā)提供關(guān)鍵技術(shù)。

4 結(jié)語

益生菌通過調(diào)節(jié)腸道微生物，保持Th1/Th2 和Treg/Th17 的平衡進(jìn)而預(yù)防或改善兒童牛乳蛋白過敏，達(dá)到對微生物-免疫軸的適當(dāng)調(diào)整，因而成為近年來預(yù)防牛乳蛋白過敏的熱點(diǎn)。目前對于腸道菌群調(diào)節(jié)牛乳蛋白過敏的機(jī)制以及益生菌緩解牛乳蛋白過敏的研究都處于初步階段，深入探究益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群、提高腸道免疫的途徑；尋找益生菌作用于機(jī)體腸道內(nèi)的靶點(diǎn)；利用復(fù)合益生菌的聯(lián)合降敏作為緩解CMAP 有效手段，為進(jìn)一步改善CMAP 提供了可能。探索高質(zhì)量且易于人體腸道吸收的低過敏性乳制品是未來開發(fā)相關(guān)低致敏產(chǎn)品目標(biāo)。