ApoB100 對肝臟VLDL合成分泌的影響及其在獸醫(yī)臨床中的研究進展

范文文，王 爽，高暢鴻，田 艷，鄒存志，徐 闖，張冰冰，楊 威

（1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163319 ；2. 黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶 163319）

脂肪肝（fatty liver）是泌乳早期奶牛的主要代謝疾病，與健康狀況和繁殖性能下降有關。奶牛脂肪肝由多種因素引起，肝臟內(nèi)脂質(zhì)過量蓄積是脂肪肝發(fā)病的主要因素[1]。奶?；贾靖魏?，肝臟中蓄積大量脂肪，可導致肝臟合成能力減弱，從而使肝臟免疫應答有關的復合物能力降低，造成肝臟代謝化合物、代謝產(chǎn)物以及代謝激素發(fā)生改變，也會導致免疫功能減弱，影響繁殖性能及泌乳能力。因此，預防脂肪肝發(fā)生并有效治療可降低奶農(nóng)的損失。

肝臟是脂肪代謝的中心器官，通過分泌極低密度脂蛋白（VLDL）運輸內(nèi)源性合成的甘油三酯（TG），還可將一部分膽固醇和膽固醇酯輸送至外周組織。奶?；贾靖魏螅褐蟹酋セ舅幔∟EFA）濃度升高外，還會引起VLDL 濃度升高[2]。VLDL 分泌紊亂時會引起TG 積累，導致疾病發(fā)展。載脂蛋白B100（ApoB100）作為VLDL 的主要蛋白質(zhì)成分，能夠調(diào)控VLDL 的合成和分泌速率，為組裝和分泌富含TG顆粒所必需。肝臟VLDL的組裝一直是深入研究的主題之一，ApoB100 作為肝臟合成分泌VLDL必不可少的載脂蛋白，也一直是研究奶牛脂肪肝發(fā)病機制的熱點。

1 VLDL的合成與分泌

1.1 VLDL的原料組成

VLDL 是由肝臟利用乳糜微粒殘粒、膽汁酸、脂肪酸、糖和蛋白質(zhì)的中間代謝物與肝臟內(nèi)合成的載脂蛋白共同組成的一種脂蛋白[3]，大小約為30～80 nm，含有TG、膽固醇、膽固醇酯和磷脂，其中TG為主要成分，含量約占60%。VLDL蛋白質(zhì)部分包括ApoB100、ApoA1、ApoC、ApoE等，其中ApoB100是VLDL的核心結構蛋白，每個VLDL顆粒包含一個ApoB100分子[4]。

1.2 VLDL的生物學功能

肝細胞在系統(tǒng)性脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的一個主要功能是內(nèi)化循環(huán)脂質(zhì)。對脂酸進行加工，并將細胞代謝不需要的脂肪酸融入TG、膽固醇酯和膜酯，之后作為VLDL釋放至血液中[5]，此過程主要依賴TG的可用性，用于組裝VLDL的TG在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中合成，以預防游離脂肪酸流入。

向肝臟提供的游離脂肪酸主要有3 種來源，即脂肪細胞的游離脂肪酸、乳糜微粒殘留物以及腸道經(jīng)門靜脈[6]。無論是血液運輸?shù)礁渭毎闹舅幔€是糖代謝轉變形成的脂肪酸，在肝細胞中均可合成TG。在肝細胞內(nèi)，TG 與ApoB100、膽固醇等結合，形成VLDL并釋放入血。VLDL從肝臟向周圍組織輸出脂質(zhì)，是低密度脂蛋白（LDL）的前體，主要負責將肝臟中合成的內(nèi)源性TG運輸?shù)街車M織，提供了能量來源[7]。

1.3 VLDL的組裝和分泌

VLDL 的生物合成及其由肝臟分泌到循環(huán)系統(tǒng)中是1 個復雜且受到高度調(diào)控的過程，在整體脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起到重要作用[3]。VLDL 的生物合成發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，分為兩步完成：第一步是新翻譯的ApoB100通過粗糙的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進行易位，一部分新生的ApoB100 被脂化，形成了1 個缺乏脂質(zhì)的原始VLDL粒子。微粒體TG轉移蛋白（MTP）能夠?qū)⒅行院蜆O性脂質(zhì)轉移至發(fā)展中的VLDL粒子，促進了VLDL 的生物合成[8-9]。除MTTP 外，酵母Hsp110 可防止ApoB 的降解。Hrizo 等[10]將Hsp110 在哺乳動物細胞中過表達，結果發(fā)現(xiàn)，Hsp110、Sse1p 可能有助于Hsp70 或Hsp90 依賴性ApoB 的共翻譯降解，表明ApoB 可看作是Hsp110的作用位點。

第二步是原始VLDL 顆粒從定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的脂滴中接收脂質(zhì)，脂質(zhì)通過脂質(zhì)融合或腔內(nèi)TG水解，之后酯化轉移至高爾基體，發(fā)生進一步膨脹[5]。有研究提出，Cideb（細胞死亡誘導DFF45 樣效應物的同源物）蛋白也在含有ApoB100 的脂質(zhì)化不良原始VLDL 顆粒的脂質(zhì)化中起到了一定作用；小鼠試驗表明，Cideb通過與ApoB100相互作用，并將脂滴中的TG 轉移至更高密度的VLDL 前體，在VLDL脂化和成熟中起重要作用[11]。

2 ApoB100對肝臟VLDL合成分泌調(diào)控特征

2.1 ApoB100的結構和功能

載脂蛋白B（ApoB）是一種存在于血漿脂蛋白中的大型兩性親糖性蛋白，分子量約為515 kDa，屬于載脂蛋白。根據(jù)氨基酸組成不同，可將ApoB 分為兩種亞型，分別為ApoB48 和ApoB100[12]。ApoB48 是哺乳動物腸道內(nèi)主要的亞型，通過產(chǎn)生終止密碼子Apobec-1 介導的位點特異性mRNA編輯合成[13]，存在于乳糜微粒及其殘余物中。在人類及哺乳動物肝臟中，ApoB100 為主要成分，存在于VLDL、中密度脂蛋白（IDL）和LDL 上，并在肝臟中表達。而在大鼠和小鼠體內(nèi)，上述兩種亞型均在肝臟內(nèi)合成，可以組裝成VLDL[14]。

ApoB100是完全翻譯的蛋白質(zhì)，具有廣泛的疏水性斑塊和多個分子內(nèi)二硫鍵。ApoB100 折疊并組裝成新生的VLDL 前體顆粒需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行處理，在高爾基體中發(fā)生更多的VLDL 前體成熟，以達到分泌能力狀態(tài)[15]。ApoB100作為肝臟合成分泌VLDL必不可少的載脂蛋白，是低密度脂蛋白受體（LDLR）介導的LDL顆粒內(nèi)吞作用的配體，也是血漿中乳糜微粒和LDL 主要的組成蛋白，主要通過肝臟表面的LDLR 介導細胞內(nèi)吞作用清除脂質(zhì)代謝的殘余物[4]。

ApoB100組裝成VLDL 大致可分為兩個步驟：翻譯過程中，通過MTP 將脂質(zhì)轉移至ApoB100 以及載脂蛋白前體粒子與TG液滴融合形成成熟的VLDL。磷脂酶可能啟動第二步融合所需的膜運輸步驟，引導磷脂進入VLDLTG生產(chǎn)途徑，VLDL生產(chǎn)主要控制在分泌前降解水平[16]。

2.2 ApoB100影響VLDL合成分泌機制

VLDL和乳糜微粒的合成與分泌受到脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的影響。食物經(jīng)過胃及小腸被消化后，進入小腸的膽固醇以乳糜微粒的形式進入血液中，在肝臟中與ApoB 轉化為富含TG 的VLDL，其中的TG 被水解，轉化為富含膽固醇的LDL。LDL 中的ApoB 能夠特異識別LDLR 并與之結合，經(jīng)胞內(nèi)吞飲作用送至溶酶體中降解，從而清除循環(huán)中大部分的LDL。若編碼ApoB 的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，可引起ApoB結構改變，無法識別LDLR，進而引發(fā)其水平升高，還可引起脂質(zhì)代謝紊亂。

ApoB100是VLDL 組裝和分泌所必需的蛋白質(zhì)，且每個VLDL均具有一個相應的ApoB100分子，使ApoB100的可用性成為決定VLDL粒子數(shù)量的關鍵因素，進而決定了肝細胞分泌的TG[17]。但與大多數(shù)肝臟分泌蛋白的合成不同，肝臟中的ApoB100通常并非由其相對恒定的合成水平調(diào)控，而是由共降解和翻譯后降解調(diào)節(jié)，此現(xiàn)象首次在人類HepG2 細胞和大鼠原代肝細胞中觀察到。研究表明，ApoB100在細胞內(nèi)發(fā)生降解，在原代肝細胞中降解不太明顯，但在一些肝癌細胞系（如典型的HepG2 細胞）中，幾乎80%新合成的ApoB100可通過此類降解去除[18]。

2.3 ApoB100在肝臟中的降解

與許多其他分泌的肝臟蛋白質(zhì)相比，ApoB100的分泌主要由共降解和翻譯后降解調(diào)節(jié)。此過程發(fā)生在VLDL組裝和成熟期間。ApoB100 的產(chǎn)生主要受細胞內(nèi)降解的調(diào)節(jié)，蛋白酶體途徑是降解的主要機制。ApoB100的產(chǎn)生受到多種降解途徑的影響，目前已報道的ApoB 降解位點有3個：

（1）由蛋白酶體介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關聯(lián)降解（ERAD)。ERAD 作為分泌途徑中的蛋白經(jīng)典途徑，至少包括3 個步驟，分別是底物識別、從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉位到胞質(zhì)和泛素化以及在蛋白酶體中降解。上述步驟需要腔內(nèi)伴侶、完整膜蛋白、胞質(zhì)伴侶和蛋白酶體間的合作，其中一些ERAD 成分參與了ApoB100 的蛋白酶體降解。細胞脂質(zhì)缺乏或脂質(zhì)轉移時，ERAD 途徑最活躍。在此情況下，脂蛋白組裝所需的新合成ApoB100較少，而相對過量的ApoB100會被蛋白酶體降解[19-20]。

在限制脂質(zhì)供應的條件下，如微粒體TG 轉運蛋白活性或脂質(zhì)可用性降低，導致ApoB100在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上轉位至泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的過程中未能脂化，此過程稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關聯(lián)降解。Fisher 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，減少ApoB100 的泛素化可增強VLDL的組裝，而改善ApoB100的脂化則會降低其泛素化，表明ApoB100 對VLDL 組裝過程具有調(diào)節(jié)作用，且ERAD是ApoB100組裝成VLDL的關鍵降解位點。

（2）新合成的ApoB100 在到達細胞表面時，遇到LDLR 或硫酸肝素蛋白聚糖被內(nèi)化，并進行溶酶體降解的再攝取途徑。sortilin 作為參與高爾基體到溶酶體運輸?shù)亩嗯潴w分選受體，與ApoB100 具有高親和力，在高濃度條件下可能會引導ApoB100，促進溶酶體降解[21]。LDLR 在調(diào)節(jié)含有ApoB100的脂蛋白分泌方面具有重要作用；有研究表明，LDLR 不僅與細胞表面的ApoB100 相互作用，在分泌途徑的早期與ApoB100 也會發(fā)生相互作用[22]。上述相互作用對ApoB100的翻譯后降解具有重要意義。

Twisk 等[23]探究了野生型和LDLR缺陷小鼠肝細胞中LDLR的存在與脂蛋白分泌之間的關系，研究表明，LDLR的缺失對ApoB100的再攝取途徑存在不同程度的影響。

（3）后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌前蛋白水解過程（PERPP）是指ApoB100 在離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后受調(diào)控的降解。PERPP 是一種非蛋白酶體途徑，由體外和體內(nèi)多種代謝因子引起，包括細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化，如sortilin 介導的ApoB 降解[14]。sortilin 1 是miR-378a-3p 直接作用的靶點。Zhang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在高脂血癥的狀態(tài)下，miR-378a-3p 在肝臟內(nèi)通過抑制sortilin 1 作為跨膜運輸受體的功能進行特異性表達，能夠促進VLDL的肝臟分泌，提高了VLDL或LDL、膽固醇以及TG的水平。

PERPP 是在肝臟來源的細胞內(nèi)降解新合成ApoB100的新途徑，通過翻譯后降解調(diào)節(jié)，減少了肝臟細胞的脂蛋白分泌。該途徑通過飲食多不飽和脂肪酸，在肝細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧而增加。通過PERPP 控制ApoB100 分泌，是血漿中ApoB 水平正常和病理調(diào)節(jié)的關鍵組成部分，也是一種顯著的分泌蛋白后期質(zhì)量控制手段[25]。

ApoB100 的降解是肝細胞可分泌VLDL 顆粒數(shù)量的主要決定因素，也是肝臟凈TG 產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因子。完成ApoB100降解的方式較多，可表明ApoB100在VLDL組裝和分泌中的重要性以及肝細胞對各種代謝狀態(tài)和應激作出反應的靈活性。ApoB100 降解速率的變化是各種代謝擾動后，含ApoB100和ApoB100脂蛋白肝臟分泌差異的潛在解釋，確定每種已知的ApoB100降解途徑對其體外凈分泌調(diào)控的定量影響非常重要。通常情況下，每個途徑的作用均孤立于其他途徑。

2.4 ApoB100在肝臟中的自噬作用

自噬是介導ApoB100 降解的一種誘導形式。自噬在參與維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的主要器官肝臟和脂肪組織中調(diào)節(jié)脂質(zhì)儲存，在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和VLDL分泌中發(fā)揮多種作用。肝細胞中，自噬作用的關鍵是胞質(zhì)脂滴的分解，此過程被稱為脂噬；與之相反，脂肪細胞分化和脂滴的同時積累需要自噬。

自噬還可通過促進脂蛋白組裝影響脂質(zhì)代謝。目前已有許多研究表明，ApoB100 的降解過程中存在自噬現(xiàn)象；如對大鼠肝癌細胞的研究發(fā)現(xiàn)，通過敲低ATG7表達或使用3-MA 過表達抑制自噬體組裝，可緩解細胞內(nèi)ApoB100 的 降解[26]；Sun 等[27]通 過過 表達PCSK9，表 明PCSK9 與ApoB 相互作用，通過影響自噬抑制ApoB 的降解途徑，進而調(diào)節(jié)ApoB的分泌。

異常自噬可能與代謝紊亂（如代謝綜合征）中脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)失調(diào)有關。胰島素信號和自噬活性在相互調(diào)節(jié)機制中出現(xiàn)分歧，提示自噬在胰島素抵抗中發(fā)揮作用；上調(diào)自噬可能導致白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉化，從而調(diào)節(jié)能量消耗和肥胖。此外，上調(diào)肝細胞自噬可增加脂質(zhì)儲存的破壞，控制TG穩(wěn)態(tài)和脂肪肝[28]。

自噬或PERPP 可視為1 種通過破壞ApoB100 從而調(diào)節(jié)其水平的控制途徑，以避免肝細胞出現(xiàn)ApoB100 和VLDL 顆粒積累；若顆粒太大而無法由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關降解途徑處理，需要從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逆向易位并由蛋白酶體降解。因此，增加自噬是一種保護性的、穩(wěn)態(tài)的反應。由此可見，自噬在脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮非常復雜的作用，根據(jù)不同組織影響脂質(zhì)儲存并參與脂蛋白的代謝途徑[29]。

3 ApoB100在獸醫(yī)臨床中的相關研究

ApoB100的合成分泌受到代謝影響，自然發(fā)生和乙硫氨酸誘發(fā)的脂肪肝血清中ApoB100濃度降低。因此，脂肪肝是奶牛血清ApoB水平降低的主要原因。ApoB100受體結合區(qū)的基因結構及其突變情況可為揭示圍產(chǎn)期奶牛脂肪肝和酮病的發(fā)病機制提供參考，同時為奶牛脂肪肝的基因治療提供參考。

ApoB100作為VLDL 的結構蛋白和主要的載脂蛋白，其主要功能是參與VLDL和LDL的組裝和分泌，而預防或治療脂肪肝的方法之一是增加VLDL 從肝臟輸出的速率[30]。ApoB100 的降解是肝細胞可分泌VLDL 顆粒數(shù)量的主要決定因素。隨著越來越多小鼠模型建立，上述降解通路通過基因操作而減弱或過度活躍，在體內(nèi)測試其對肝臟ApoB100 產(chǎn)生的影響將是細胞培養(yǎng)研究和治療奶牛脂肪肝的重要聯(lián)系。Zhou等[31]采用油酸誘導肝細胞、果糖誘導小鼠肝脂肪變性，結果發(fā)現(xiàn)，GF-Ala 能夠顯著抑制ApoB100 的翻譯后降解，改善肝臟脂質(zhì)積累，減少脂質(zhì)過氧化，促進肝細胞TG 轉運。研究表明，GF-Ala 可能是治療脂肪肝的潛在藥物。

4 結論

肝臟VLDL 的組裝一直是深入研究的主題。20 世紀80年代中期，已有對ApoB100通過降解調(diào)控VLDL的相關研究，但主要集中于原代大鼠肝細胞和人HepG2細胞中新合成的ApoB100的周轉率。隨著研究深入，越來越多的研究表明，ApoB100通過多個降解途徑以及自噬等方式影響VLDL的合成分泌。

ApoB100作為VLDL 顆粒中的主要和必需蛋白質(zhì)，對VLDL 顆粒的組裝和分泌發(fā)揮重要作用。因此，后續(xù)的深入研究對臨床上相關疾病的治療可起到關鍵作用。