單細(xì)胞組學(xué)在早期妊娠母胎界面異質(zhì)性中的研究進(jìn)展*

金貝貝，楊曉清

(1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南通 226006；2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，南通 226001)

妊娠早期是胚胎著床和胎盤形成的關(guān)鍵時期，其中早期妊娠丟失約占總?cè)焉飦G失的80%，部分妊娠晚期的嚴(yán)重并發(fā)癥在妊娠早期就能被預(yù)測到[1]。胚胎一直以來被認(rèn)為是母體的“同種異體移植物”，帶有父系基因的胚胎如何在母體內(nèi)穩(wěn)定存在一直是科研人員研究的熱點話題。母胎界面作為母體與胎兒直接交流對話的“接觸面”，除了有胎兒來源的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(extravillous trophoblast,EVT)外，還包括母體來源的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞(decidual stromal cell,DSC)和蛻膜免疫細(xì)胞(decidual immune cell,DIC)。母胎界面細(xì)胞因子平衡的失調(diào)將會導(dǎo)致流產(chǎn)、子癇等不良妊娠結(jié)局事件的發(fā)生[2-3]，因此維持母胎界面各細(xì)胞群間以及細(xì)胞內(nèi)部的動態(tài)平衡是妊娠成功的關(guān)鍵因素[4]。

細(xì)胞具有異質(zhì)性，相同種類的細(xì)胞其基因型和表型可能不同，相同表型的細(xì)胞其遺傳信息也可能存在顯著差異。母胎界面組織的異質(zhì)性問題是制約早期自然流產(chǎn)甚至復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)等妊娠相關(guān)疾病有效治療的關(guān)鍵因素。單細(xì)胞組學(xué)研究技術(shù)可從單個細(xì)胞水平分析母胎界面組織中各種細(xì)胞類型、細(xì)胞亞群及基因表達(dá)的差異性等因素，有助于揭示細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)交互對話的機制，從而更好地理解細(xì)胞異質(zhì)性。本綜述通過分析近年來單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)在早期妊娠母胎界面異質(zhì)性中的相關(guān)研究，旨在深入探究母胎界面組織的異質(zhì)性以及進(jìn)一步了解母胎免疫耐受的潛在機制，為臨床疾病的治療與研究提供指導(dǎo)方向。

1 單細(xì)胞組學(xué)

單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)是基于單個細(xì)胞分離技術(shù)的水平，探究細(xì)胞群體間及細(xì)胞內(nèi)部動態(tài)分化的新興技術(shù)，主要包括單細(xì)胞基因組學(xué)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、單細(xì)胞蛋白組學(xué)、單細(xì)胞代謝組學(xué)以及單細(xì)胞表觀基因組學(xué)。不同于以往高通量測序技術(shù)，單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)不僅能深入分析所測單個細(xì)胞亞群以及基因表達(dá)水平的差異性，也有助于進(jìn)一步探究細(xì)胞譜系、細(xì)胞分化軌跡的關(guān)系，構(gòu)建各細(xì)胞亞群間的互作網(wǎng)絡(luò)。目前單細(xì)胞組學(xué)的相關(guān)研究已在多個學(xué)科領(lǐng)域獲得突破進(jìn)展，包括腫瘤學(xué)、生殖、干細(xì)胞領(lǐng)域等[5-7]。近年來，單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，其中單細(xì)胞測序技術(shù)在妊娠早期的研究應(yīng)用尤為廣泛，這不僅促進(jìn)了母胎界面細(xì)胞分化發(fā)育及細(xì)胞命運的研究，也推動了母胎醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)展。

2 單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中的研究

DSC是蛻膜組織的主要組成部分，可分泌多種因子共同調(diào)節(jié)早期妊娠母胎界面微環(huán)境，包括IGFBP1、PRL、白介素等[8]。作為DSC所分泌因子的主要組成部分及蛻膜化的重要指標(biāo)，IGFBP1和PRL在母胎界面也表現(xiàn)出差異表達(dá)的特征。Vento-tormo等[9]通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)全面解析妊娠早期的DSC并將其分為3種細(xì)胞亞群，DS1細(xì)胞亞群缺乏蛻膜經(jīng)典分子標(biāo)志物IGFBP1和PRL的表達(dá)，DS2和DS3細(xì)胞亞群表達(dá)IGFBP1，DS3細(xì)胞亞群表達(dá)PRL，且三類DSC亞群分布位置不同，進(jìn)而說明DSC在母胎界面組織具有差異表達(dá)的異質(zhì)性特征。DSC這一異質(zhì)性不僅表現(xiàn)在妊娠早期，在妊娠晚期也有蛻膜異質(zhì)性的表現(xiàn)。Huang等[10]通過單細(xì)胞RNA測序研究分娩前后的蛻膜組織細(xì)胞也得出相近的結(jié)論，揭示了有關(guān)分娩期蛻膜組織的異質(zhì)性，該研究不僅為妊娠早期母胎界面蛻膜組織的差異表達(dá)提供了基于單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)研究的證據(jù)，也為將來圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)DSC的研究提供了指導(dǎo)。

3 單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)在蛻膜免疫細(xì)胞中的研究

在正常妊娠中，胚胎作為“外來物質(zhì)”能夠免受母體免疫系統(tǒng)的排斥并且能在母體內(nèi)穩(wěn)定存在，這與母胎界面免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及特殊的免疫耐受機制密切相關(guān)。在早期妊娠中，蛻膜免疫細(xì)胞包含多種免疫細(xì)胞類型，其中蛻膜NK細(xì)胞(decidual natural killer cell,dNK)占比最多[11]，其次是蛻膜巨噬細(xì)胞(decidual macrophage,DM)、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)等[12]，各種免疫細(xì)胞類型及其分泌的細(xì)胞因子等協(xié)同作用以維持母胎界面免疫耐受平衡。

3.1 單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)在蛻膜自然殺傷細(xì)胞中的研究 早期妊娠期間，dNK細(xì)胞是占比最多的蛻膜免疫細(xì)胞群，約占50%～70%。隨著妊娠的進(jìn)行，子宮內(nèi)膜迅速蛻膜化，CD56brightCD25+dNK細(xì)胞優(yōu)先被募集到母胎界面[13]，具有耐受表型的CD56brightCD16-dNK細(xì)胞數(shù)量迅速增加。同時，dNK細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子、生長因子，在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、子宮螺旋動脈重構(gòu)、胎兒生長發(fā)育等多方面發(fā)揮重要作用[14-17]，但dNK細(xì)胞在早期妊娠母胎界面中的具體作用機制仍不明確。Vento-tormo等[9]基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和分層聚類等方法對妊娠6～14周的蛻膜和胎盤進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)dNK細(xì)胞3個細(xì)胞亞群具有不同的分子特征和免疫調(diào)節(jié)功能。dNK1細(xì)胞亞群高表達(dá)CSF1、LILRB1受體和KIR基因，與EVT相互作用，同時表達(dá)參與糖酵解的酶以引發(fā)代謝；dNK2細(xì)胞和dNK3細(xì)胞高表達(dá)XCL1，防止免疫激活；dNK3細(xì)胞高表達(dá)CCL5。研究者還通過開發(fā)配體-受體庫預(yù)測不同細(xì)胞類型分子的互作，構(gòu)建母胎界面單細(xì)胞圖譜，揭示早期妊娠母胎界面組織細(xì)胞交流互作的通訊機制，為探究母胎界面免疫微環(huán)境的研究提供新的思路。Guo等[2]對正常早期妊娠者及RSA患者的dNK細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序分析，探討dNK細(xì)胞亞群及其在母胎界面的功能，表明dNK1細(xì)胞高表達(dá)KIR基因家族成員及LILRB1，具有支持胚胎生長活性的功能；dNK2細(xì)胞和dNK3細(xì)胞高度富集細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路基因，傾向于細(xì)胞因子分泌的功能；dNK3細(xì)胞高表達(dá)IFNG免疫調(diào)節(jié)基因，推測dNK1細(xì)胞數(shù)量減少、IFNG基因表達(dá)量顯著增加可能導(dǎo)致RSA的發(fā)生，從單細(xì)胞角度對既往研究進(jìn)行了補充說明[18-19]，促進(jìn)了我們對疾病狀態(tài)下母胎界面異質(zhì)性的理解，為RSA臨床免疫治療研究提供新的視角。

3.2 單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)在蛻膜巨噬細(xì)胞中的研究 DM是早期妊娠母胎界面第二大免疫細(xì)胞群體，在重塑子宮螺旋動脈、維持母胎界面免疫耐受等方面發(fā)揮重要作用[20-21]。既往研究通常將DM分為促炎性M1型和抗炎性M2型兩種細(xì)胞類型[22]，DM在妊娠初期偏向M1型，隨著妊娠的進(jìn)行，在胎盤形成后主要向M2型轉(zhuǎn)變[23]。Guo等[2]從單細(xì)胞水平檢測母胎界面DM的異質(zhì)性，將DM分為mac1和mac2兩種細(xì)胞亞群，研究其差異基因并結(jié)合富集分析表明：在正常早期妊娠者中，mac1細(xì)胞與中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫作用有關(guān)，mac2細(xì)胞與NK細(xì)胞趨化性調(diào)節(jié)作用有關(guān)，mac1細(xì)胞和mac2細(xì)胞分別表征M1和M2基因特性。在RSA病理妊娠狀態(tài)下，DM總量顯著減少且有T細(xì)胞趨化性，其中mac1細(xì)胞亞群的功能增強和比例增加伴隨著mac2細(xì)胞亞群數(shù)量顯著減少，這與M1/M2兩種分型作用相似。

然而，有研究者認(rèn)為部分DM細(xì)胞不適合常規(guī)M1/M2分型，Houser等[24]根據(jù)CD11c表達(dá)水平將CD45+CD14+DM分為CD11cHIDM和CD11cLODM兩種類型，且其分別產(chǎn)生促炎性和抗炎性因子，在母胎界面表達(dá)獨特的基因特征和功能，以共同維持母胎免疫微環(huán)境的平衡。Jiang等[25]在此基礎(chǔ)上首次鑒定出DM三個不同亞群的存在，促進(jìn)DM在妊娠早期母胎界面異質(zhì)性中的研究。Chen等[26]通過單細(xì)胞RNA測序技術(shù)研究表明富含于RSA蛻膜組織的第6巨噬細(xì)胞亞群同時高表達(dá)M1和M2基因組合特征，不同于傳統(tǒng)M1/M2分型，在疾病狀態(tài)下從單細(xì)胞和分子方面進(jìn)一步探討了DM的分型問題，為探究不明原因RSA患者的發(fā)病機制及診療方案提供了新思路。

3.3 單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)在T細(xì)胞中的研究 蛻膜T細(xì)胞參與維持母胎界面免疫耐受，主要包括CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。Guo等[2]鑒定并分析了上述3種T細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)RSA患者T細(xì)胞各亞群的細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路及其促炎特性均有增強，表明RSA蛻膜免疫微環(huán)境以Th1型為主，推測改變蛻膜免疫細(xì)胞亞群的比例可能有助于將RSA病理妊娠轉(zhuǎn)變?yōu)檎Ｈ焉?。Wang等[27]對孕6～8周的正常妊娠者和RSA患者的蛻膜組織及外周白細(xì)胞進(jìn)行了綜合分析，同樣表明RSA患者的蛻膜T細(xì)胞優(yōu)先表現(xiàn)為促炎特性，并首次通過單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)外周血中黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞(mucosal-associated invariant T cell,MAIT)的激活可能與母體的炎癥狀態(tài)有關(guān)，進(jìn)一步推動了早期妊娠失敗的免疫發(fā)病機制的研究。然而，RSA疾病狀態(tài)下的蛻膜免疫異質(zhì)性在很大程度上仍然未知。為進(jìn)一步揭示蛻膜T細(xì)胞潛在的功能亞型，Chen等[26]對T細(xì)胞亞群的特異性表達(dá)基因進(jìn)行了差異分析，研究表明早期妊娠期間CD4+T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用和CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用相互協(xié)調(diào)，共同維持蛻膜免疫微環(huán)境的平衡，但T細(xì)胞在母胎界面的異質(zhì)性表現(xiàn)仍有待進(jìn)一步探究。

3.4 單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)在DC中的研究 DC在蛻膜免疫細(xì)胞中占比較少，約1%～2%，是妊娠期關(guān)鍵的抗原提呈細(xì)胞，在母胎界面發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。根據(jù)成熟度分類，DC可分為CD83+成熟的樹突狀細(xì)胞(mDC)、CD209+(DC-SIGN)未成熟的樹突狀細(xì)胞(imDC)和中間態(tài)DEC-205+DC，妊娠早期以DC-SIGN+DC為主。近年來，Villani等[28]利用單細(xì)胞RNA測序技術(shù)探究人血液中DC的新細(xì)胞亞型及表達(dá)特征，促進(jìn)人類免疫細(xì)胞圖譜的建立。Suryawanshi等[29]對妊娠6～11周的胎盤及蛻膜進(jìn)行單細(xì)胞組學(xué)研究，繪制妊娠早期胎盤絨毛和蛻膜細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，表明DC1屬于CLEC9A+亞型，DC2屬于CD1C+亞型，與Villani等[28]研究一致。Chen等[26]通過單細(xì)胞RNA測序?qū)φＨ焉镎呒癛SA患者的蛻膜進(jìn)行研究，結(jié)合基因表達(dá)譜評估DC亞群的細(xì)胞特征，闡明多數(shù)DC屬于cDC1譜系，少數(shù)DC屬于cDC2譜系，提出部分來源于RSA蛻膜的呈激活態(tài)的DC所致的免疫紊亂可能與RSA發(fā)病有關(guān)。目前基于單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)分析DC在早期妊娠母胎界面的相關(guān)研究較少，尚不明確DC確切的細(xì)胞亞群分型及功能特征。

4 單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)在絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞中的研究

EVT的侵襲作用是母胎界面形成的起始及關(guān)鍵因素[30]。在妊娠過程中，胚胎來源的EVT侵入蛻膜，與母體免疫細(xì)胞互作重塑母體子宮螺旋動脈，使得胎兒獲得充足的營養(yǎng)和能量支持，在胚胎著床、胎盤形成以及維持母胎耐受的過程中發(fā)揮重要作用。Suryawanshi等[29]鑒定分析早期妊娠中絨毛和蛻膜組織的主要細(xì)胞類型及基因特征，在確定已知EVT標(biāo)志物的同時也發(fā)現(xiàn)了新的EVT標(biāo)志物，包括HTRA4，這為先前報道的HTRA4與EVT侵襲及分化作用的相關(guān)研究提供了基于單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)的論據(jù)支撐[31]。同時研究表明，妊娠早期EVT表達(dá)具有抗炎作用的MMP12，而非妊娠晚期高度表達(dá)的MMP11[32]，體現(xiàn)EVT從孕早期抗炎作用到孕晚期高度浸潤作用的動態(tài)轉(zhuǎn)變，有助于了解不同妊娠狀態(tài)下細(xì)胞功能的動態(tài)變化過程。Liu等[33]將妊娠8周的胎盤EVT分為3個細(xì)胞亞群，富集分析各細(xì)胞亞群的功能并剖析其高表達(dá)的特異性基因，表明EVT_8W_1亞群傾向于增殖作用，高表達(dá)RRM2；EVT_8W_3亞群傾向于免疫調(diào)節(jié)作用，高表達(dá)TAC3、SERPINE1等基因；EVT_8W_2亞群的基因表達(dá)水平居中位。研究還發(fā)現(xiàn)EVT表達(dá)多種多肽激素基因，雖未能鑒定出已知的部分EVT,如血管內(nèi)EVT等，但仍能幫助我們更好地理解EVT在母胎界面的異質(zhì)性表現(xiàn)。

5 總結(jié)與展望

近年來，單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)促進(jìn)了我們對妊娠早期母胎界面組織異質(zhì)性的深入理解，推動了生殖醫(yī)學(xué)及母胎醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展進(jìn)程，極大地加速了“人類細(xì)胞圖譜”的構(gòu)建，為探究細(xì)胞命運及異質(zhì)性的研究提供了有力的技術(shù)支撐[34]。目前，單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)不斷成熟，但其在早期妊娠母胎界面中的研究仍較少，且主要通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)來完成。未來，我們?nèi)孕枰趩渭?xì)胞高分辨率技術(shù)的支持下對母胎界面進(jìn)行多組學(xué)的深入探究，以期最終減少妊娠期母胎疾患的發(fā)生率，保障母胎健康。