間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的特點(diǎn)及其在宮腔粘連中的研究進(jìn)展

李 曉，段 華

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院婦科微創(chuàng)中心，北京 100006)

宮腔粘連(intrauterine adhesion，IUA)是一種子宮內(nèi)膜損傷性疾病，子宮內(nèi)膜細(xì)胞被細(xì)胞外基質(zhì)取代，大量成纖維細(xì)胞沉積在內(nèi)膜部位，子宮內(nèi)膜發(fā)生纖維化，該過程可能與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞缺失有關(guān)[1]。隨著間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)研究的不斷深入，其抗纖維化作用已得到證實(shí)。近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體作為MSCs旁分泌活動(dòng)的主要方式之一，在促進(jìn)損傷子宮內(nèi)膜再生修復(fù)和抑制纖維化中發(fā)揮重要作用。

1 MSCs外泌體的基本特點(diǎn)

1.1 MSCs外泌體概述 MSCs是起源于早期中胚層的一種多能干細(xì)胞，在組織器官損傷性疾病的治療中備受青睞。近年，有研究發(fā)現(xiàn)MSCs可能通過外泌體(exosomes)介導(dǎo)的旁分泌作用來發(fā)揮抗炎、抗凋亡、抗氧化和促進(jìn)血管新生等生物學(xué)功能[2]，在修復(fù)損傷器官中具有重要地位。

外泌體是一類直徑約為30～150nm的膜性囊泡，在透射電鏡下顯示為經(jīng)典的茶托樣結(jié)構(gòu)。幾乎所有活細(xì)胞都可以分泌外泌體[3]，故其廣泛分布于血液、尿液、乳汁和腹水等體液中。1987年，科學(xué)家在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)外泌體[4]，最初認(rèn)為這是細(xì)胞代謝廢物的“垃圾袋”；但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)含有多種細(xì)胞活性成分，如蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和脂質(zhì)等[5]，在組織損傷修復(fù)中參與細(xì)胞間通訊和信息傳遞。

與單純應(yīng)用MSCs相比，MSCs外泌體來源廣泛、易于獲得，不僅具有與其親本細(xì)胞類似的生物學(xué)特性，而且具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)安全性：外泌體的納米級(jí)結(jié)構(gòu)使其易于被靶細(xì)胞攝取，并可在循環(huán)血液中運(yùn)輸，避免了MSCs堵塞血管的風(fēng)險(xiǎn)[6]；作為天然細(xì)胞來源的納米載體，外泌體可有效避免循環(huán)單核細(xì)胞吞噬，促進(jìn)“貨物”的有效傳遞，且沒有免疫排斥反應(yīng)；另外，外泌體不引起溶血和全身過敏性反應(yīng)，對(duì)肝腎功能無副作用[7]。(2)穩(wěn)定性：外泌體沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，比MSCs更穩(wěn)定，易于保存和質(zhì)控。研究證實(shí),外泌體在-80℃保存數(shù)月仍可維持生物學(xué)特性不變[8]。外泌體具有良好的生物相容性，可穿透質(zhì)膜，易于在靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，同時(shí)也可作為藥物的載體用于生物治療。(3)多效性：外泌體內(nèi)含多種生物學(xué)活性成分，與單獨(dú)應(yīng)用某一活性因子所致的單一效應(yīng)相比，外泌體內(nèi)各活性因子之間可協(xié)同作用，在組織器官損傷的結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)中發(fā)揮多重效應(yīng)。

1.2 外泌體的合成與攝取 作為細(xì)胞外囊泡的一個(gè)亞類，有別于從質(zhì)膜脫落、以出芽方式分泌到胞外的微囊泡，外泌體的合成過程涉及多重環(huán)節(jié)和多個(gè)信號(hào)分子，如四次跨膜蛋白、神經(jīng)酰胺和負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)體分選復(fù)合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)[9]。外泌體經(jīng)核內(nèi)體途徑合成，即細(xì)胞內(nèi)高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白或細(xì)胞膜表面內(nèi)化的蛋白與細(xì)胞內(nèi)核酸被內(nèi)吞，轉(zhuǎn)運(yùn)到早期內(nèi)體中，后者成熟形成晚期內(nèi)體，也稱多囊泡小體(multiple vesicle bodies，MVBs)。一部分MVBs被溶酶體降解，而另一部分MVBs與胞膜融合后以胞吐方式將管腔內(nèi)囊泡釋放到胞外即產(chǎn)生外泌體[10]。

外泌體可通過多種方式傳遞信號(hào)，從而被受體細(xì)胞所攝?。?1)靶向受體細(xì)胞，通過膜表面的膜暴露蛋白、糖類或脂類等特異性分子以受體-配體結(jié)合的機(jī)制與受體細(xì)胞相互作用；(2)通過脂質(zhì)筏、網(wǎng)格蛋白等介導(dǎo)的非特異性胞飲被受體細(xì)胞攝??；(3)直接與靶細(xì)胞膜融合，將外泌體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，最后將內(nèi)容物傳遞到受體細(xì)胞[10]。

1.3 MSCs外泌體的生物學(xué)特性 MSCs來源的外泌體不僅表達(dá)其親本干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，如CD105、CD73和CD90，也表達(dá)特定的外泌體標(biāo)志蛋白，如四次跨膜蛋白(CD63、CD81和CD9等)、熱休克蛋白家族(HSP60、HSP70和HSP90等)，及Alix蛋白、同線蛋白(syntenin)、腫瘤易感基因101(TSG101)和網(wǎng)格蛋白等[11]。雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的包裹可保護(hù)外泌體內(nèi)容物的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)移[12]。但是，在不同生理和病理?xiàng)l件下，外泌體內(nèi)容物的成分也有很大差異，當(dāng)MSCs釋放外泌體時(shí)，其內(nèi)容物可被運(yùn)輸?shù)绞荏w細(xì)胞，參與抗原提呈、遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)態(tài)維持、腫瘤轉(zhuǎn)移及細(xì)胞微環(huán)境調(diào)控等生物學(xué)活動(dòng)[13]。

2 MSCs外泌體在IUA中的作用機(jī)制

IUA是由刮宮或其他宮腔操作及感染等引起的一種子宮內(nèi)膜基底層損傷性疾病，其病理特征主要為上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞異常增生[14]，多種細(xì)胞因子和趨化因子[如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)、白介素-6(IL-6)和趨化因子配體-10(CXCL-10)]異常分泌，引起I型膠原纖維沉積造成子宮內(nèi)膜纖維化和過量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；異常的炎性反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步使大量纖維沉積于內(nèi)膜，該過程與TGF-β1和經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的異常激活有關(guān)[15]，因此IUA也被認(rèn)為是一種纖維化疾病[16]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，MSCs外泌體與多種組織器官纖維化密切相關(guān)，包括子宮內(nèi)膜纖維化[17]等。外泌體不僅可以參與器官纖維化的發(fā)病機(jī)制，還可作為血液、尿液等體液的纖維化標(biāo)志物，為疾病診斷提供依據(jù)[18-19]。越來越多的研究已證實(shí),外泌體所攜帶的非編碼RNA，尤其是miRNA可在細(xì)胞間橫向運(yùn)輸，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控細(xì)胞分化、增殖和凋亡等關(guān)鍵信號(hào)通路[20]。MSCs外泌體參與子宮內(nèi)膜纖維化，促進(jìn)損傷內(nèi)膜再生修復(fù)的調(diào)控機(jī)制主要體現(xiàn)在抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)、促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖和血管形成及參與免疫調(diào)控等方面。

2.1 MSCs外泌體抑制EMT EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和緊密連接，同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞特性[21]；其中II型EMT是炎癥反應(yīng)時(shí)上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化，上皮細(xì)胞表現(xiàn)出遷移侵襲的特性，在子宮內(nèi)膜損傷和纖維化中發(fā)揮重要作用[22]。

諸多體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)均表明,MSCs外泌體具有逆轉(zhuǎn)EMT、改善纖維化的作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)揭示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(bone marrow mesenchymal stem cells derived exosomes，BMSCs-Exo)可通過抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路，減少內(nèi)膜纖維化比率，增加內(nèi)膜腺體數(shù)量；同時(shí)增加維持子宮內(nèi)膜細(xì)胞完整性的細(xì)胞骨架蛋白CK-19的表達(dá)，而下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物波形蛋白的表達(dá)，證實(shí)了BMSCs-Exo通過逆轉(zhuǎn)EMT對(duì)損傷內(nèi)膜的修復(fù)作用[23]。

MSCs外泌體攜帶的miRNA可調(diào)節(jié)EMT相關(guān)信號(hào)通路從而抑制靶細(xì)胞纖維化。在小鼠皮膚損傷模型中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(umbilical cord mesenchymal stem cells derived exosomes，UCMSCs-Exo)能抑制肌成纖維細(xì)胞分化和瘢痕形成；隨后經(jīng)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(GEO)、TargetScan和基因本體(GO)數(shù)據(jù)庫等挖掘發(fā)現(xiàn)，UCMSCs-Exo內(nèi)高表達(dá)的多種miRNA(如miR-145-5p、miR-21-5p和miR-125b-5p等)及下游的TGF-β1/Smad2信號(hào)通路可能是外泌體抑制損傷皮膚纖維化的機(jī)制所在[24]。近期研究結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜異位癥中，異位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體可運(yùn)輸miR-214，減少纖維化基因[如膠原α1(COLα1)和CTGF]的表達(dá)，為逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜異位癥的纖維化提供可能的治療手段[17]。Xiao等探索了BMSCs-Exo改善IUA纖維化的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)BMSCs-Exo可將miR-340運(yùn)輸?shù)紼SCs，下調(diào)纖維化基因[膠原1A1(COL1A1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和TGF-β1]的表達(dá)，減少膠原沉積，并促進(jìn)子宮內(nèi)膜的功能性恢復(fù)。該研究結(jié)果證實(shí)了BMSCs-Exo通過運(yùn)輸miRNA發(fā)揮抗纖維化作用，為促進(jìn)IUA內(nèi)膜的無瘢痕修復(fù)提供一定借鑒價(jià)值[25]。由此可見，抑制EMT是促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生修復(fù)的重要途徑，MSCs外泌體可能成為抑制EMT的新載體，為治療IUA提供新的治療策略。

2.2 MSCs外泌體促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成 細(xì)胞增殖和血管生成在子宮內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)和功能再生修復(fù)中尤為重要，不僅參與子宮內(nèi)膜增殖期的生理進(jìn)展，同時(shí)影響子宮內(nèi)膜容受性，在胚胎植入中發(fā)揮重要作用[26]。MSCs外泌體內(nèi)富含多種生長(zhǎng)因子[如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、TGF-β1和IL-8等]，有助于促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成活性，同時(shí)顯著改善子宮內(nèi)膜容受性，有助于胚胎植入[27]。

在體外，UCMSCs通過外泌體促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells，ESCs)增殖，起效迅速、效應(yīng)持久且具有劑量依賴性[28]。探討機(jī)制發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)miR-21-5p的表達(dá)水平顯著上調(diào)；抑制其表達(dá)后，ESCs的增殖活性和增殖能力均下降；生物信息學(xué)分析則顯示UCMSCs-Exo攜帶的miR-21-5p可通過調(diào)控多種與子宮內(nèi)膜再生修復(fù)相關(guān)的信號(hào)通路，加速損傷內(nèi)膜的再生修復(fù)[29]。還有研究顯示,UCMSCs-Exo可抑制ESCs凋亡，激活PTEN/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和血管形成[30]。

在體內(nèi)，研究證實(shí)BMDSCs-Exo可促進(jìn)兔損害子宮內(nèi)膜的腺體增生，抑制纖維化進(jìn)展，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)[31]。Saribas等將子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(uterus mesenchymal stem cell，uMSCs)及其產(chǎn)生的外泌體(uMSCs-Exo)移植到IUA模型宮腔中，結(jié)果證實(shí)外泌體可增加基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix matalloproteinases 2,MMP-2)和MMP-9，降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2組織抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 2,TIMP-2)的表達(dá)，同時(shí)增加增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和白細(xì)胞分化抗原31(CD31)的表達(dá)；相較于單獨(dú)使用干細(xì)胞，MSCs外泌體可在更短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖和血管形成并減少纖維化[32]。

在此基礎(chǔ)上，諸多研究證實(shí)了MSCs外泌體可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成提高IUA的生育力。有證據(jù)表明，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(adipose derived mesenchymal stem cells derived exosomes，ADSCs-Exo)有助于子宮內(nèi)膜再生和膠原重塑，并增加子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)蛋白[如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、整合素β3和VEGF]的表達(dá)；相較于IUA模型組，ADSCs-Exo治療后的IUA大鼠妊娠率和胚胎植入率均顯著增加，且受孕時(shí)間更短[33]。經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(menstrual blood mesenchymal stem cells derived exosomes，MenSCs-Exo)可遷移至子宮內(nèi)膜病變部位，促進(jìn)腺體新生，增加子宮內(nèi)膜和肌層的血管分布，提高IUA大鼠的子宮內(nèi)膜容受性，恢復(fù)其生育能力[34]。進(jìn)一步研究證實(shí)，經(jīng)血基質(zhì)細(xì)胞來源的小細(xì)胞外囊泡(menstrual blood mesenchymal stem cells derived small extracellular vesicles，MenSCs-sEVs)可抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，并促進(jìn)Smad1/5/8和Erk1/2磷酸化，促進(jìn)血管新生和腺體生成，進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜纖維化[35]。上述研究說明MSCs外泌體的無細(xì)胞療法在促進(jìn)IUA模型損傷內(nèi)膜的再生修復(fù)、提高其生育力方面是安全且有效的。

2.3 MSCs外泌體參與免疫調(diào)控 MSCs外泌體通過傳遞炎癥因子、轉(zhuǎn)錄因子和miRNA等來調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，進(jìn)而調(diào)節(jié)各種免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖、成熟、極化和遷移等[36]。MSCs外泌體可觸發(fā)巨噬細(xì)胞M1型向M2型極化，減少炎癥因子[如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)、IL-6和干擾素-γ(IFN-γ)等]的表達(dá)[37]；還可誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞1(Th1)轉(zhuǎn)化為Th2，并減少T細(xì)胞向Th17轉(zhuǎn)變；另外，能增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4的表達(dá)，抑制T細(xì)胞的異常激活，維持免疫平衡[38]。

近期有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過將干細(xì)胞外泌體負(fù)載在膠原支架上構(gòu)建生物支架/外泌體復(fù)合體(collagen scaffold and exosomes，CS/Exo)可減少CD86+細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)分泌的促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α，增加CD163+細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)分泌的抗炎因子IL-10、TGF-β1和VEGFB；這可能是由外泌體所攜帶的miR-223介導(dǎo)的，后者與其靶基因stmn1的3'-非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTRs)結(jié)合，以調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜再生，并恢復(fù)內(nèi)膜功能[39]。類似的研究發(fā)現(xiàn)，UCMSCs-Exo與雌激素在修復(fù)IUA大鼠損傷內(nèi)膜中具有協(xié)同療效，可顯著下調(diào)多種炎癥因子和纖維化相關(guān)標(biāo)記物，并促進(jìn)血管形成和細(xì)胞增殖，對(duì)IUA的預(yù)后具有明顯改善[40]?？梢?，MSCs外泌體通過免疫調(diào)控可加速損傷子宮內(nèi)膜的修復(fù)重建，逆轉(zhuǎn)纖維化，但其作用機(jī)制以及對(duì)免疫系統(tǒng)的平衡調(diào)節(jié)尚需進(jìn)一步探討。

3 小 結(jié)

應(yīng)用MSCs外泌體對(duì)損傷內(nèi)膜進(jìn)行再生修復(fù)，可突破MSCs移植的應(yīng)用壁壘，提供更高的安全性和治療特異性，為IUA的抗纖維化治療提供了新的治療手段。為更好發(fā)揮MSCs外泌體修復(fù)損傷內(nèi)膜的天然載體功能，進(jìn)一步研究應(yīng)對(duì)外泌體攜帶的內(nèi)容物及其介導(dǎo)的分子生物學(xué)機(jī)制深入探究。目前，有關(guān)外泌體修復(fù)損傷內(nèi)膜的研究多數(shù)為短期實(shí)驗(yàn)，其長(zhǎng)期療效還需進(jìn)一步研究和隨訪；同時(shí)，外泌體進(jìn)入臨床試驗(yàn)前對(duì)其安全劑量進(jìn)行效價(jià)測(cè)定也是尤為重要的。