DNA甲基化在骨質(zhì)疏松癥中的研究進(jìn)展

潘曉豪 周展毅 凌奕清 厲駒 徐濤濤*

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨脆性增加為特征的全身性代謝性骨骼疾病，常常導(dǎo)致脆性骨折的發(fā)生。而OP的發(fā)生多由基因和環(huán)境因素、飲食習(xí)慣、生活方式之間相互作用而引起骨骼重塑失調(diào)所致。骨形成與吸收的平衡和維持骨重塑中骨穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)[1]。在成人骨骼中，骨形成與吸收主要依賴于間充質(zhì)成骨細(xì)胞系和造血破骨細(xì)胞系兩者的相互作用、分化及其相應(yīng)的功能。由于成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)和破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的分化、活化和凋亡受到高度調(diào)控，能夠使骨重塑保持平衡。一旦調(diào)控過(guò)程出現(xiàn)異常，往往導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡。目前，有全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies，GWAS)表明在人類OP和骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在遺傳變異和DNA甲基化改變[2]。此外，Kemp等[3]通過(guò)GWAS分析確定了多個(gè)與骨密度(bone mineral density，BMD)相關(guān)的基因位點(diǎn)，然而這些位點(diǎn)只能解釋部分骨表型變異(約12%)。

表觀遺傳學(xué)是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，主要包括轉(zhuǎn)錄后microRNA(miRNA)介導(dǎo)的靶mRNA負(fù)調(diào)控、DNA甲基化以及組蛋白修飾。DNA甲基化修飾具有高度動(dòng)態(tài)、可逆、年齡相關(guān)、細(xì)胞和組織特異性的特征，并且對(duì)內(nèi)源性信號(hào)和(或)環(huán)境刺激敏感。目前，DNA甲基化被認(rèn)為是通過(guò)環(huán)境因素和隨機(jī)內(nèi)外源性應(yīng)激促進(jìn)OP發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制之一。DNA甲基化加強(qiáng)了個(gè)體基因組與環(huán)境之間的聯(lián)系，它能夠影響骨表型和患OP的風(fēng)險(xiǎn)，并與遺傳基因變異協(xié)同作用，在一定程度上可以解釋為什么僅靠遺傳因素不足以解釋OP發(fā)生發(fā)展和脆性骨折易感性的原因。DNA甲基化主要通過(guò)對(duì)OB、OC、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的調(diào)節(jié)引起骨重塑失調(diào)，從而促進(jìn)OP的發(fā)生發(fā)展。

本文通過(guò)綜述DNA甲基化對(duì)OB、OC以及MSCs的作用機(jī)制，探討將DNA甲基化作為OP診治及預(yù)后生物標(biāo)志物的意義和可能性。

1 DNA甲基化在骨穩(wěn)態(tài)中的影響

DNA甲基化是指在基因組CpG島上胞嘧啶殘基的第5個(gè)碳上加上一個(gè)甲基的可逆共價(jià)加成，通常與基因表達(dá)抑制有關(guān)。DNA甲基化在調(diào)節(jié)生物過(guò)程和響應(yīng)外界環(huán)境信號(hào)中發(fā)揮著重要作用。越來(lái)越多的研究證明環(huán)境因素包括行為、營(yíng)養(yǎng)、化學(xué)物質(zhì)以及工業(yè)污染物等具有表觀遺傳效應(yīng)。除了遺傳因素外，人的整體健康狀況被認(rèn)為是多種環(huán)境信號(hào)的整合，這些信號(hào)從妊娠開始并通過(guò)表觀遺傳修飾如DNA甲基化發(fā)揮作用[4]。一項(xiàng)全基因組研究評(píng)估了骨質(zhì)疏松性髖關(guān)節(jié)骨折患者股骨頭骨小梁樣本的DNA甲基化圖譜(分析了13463個(gè)基因中23367個(gè)GpG位點(diǎn)的甲基化)，結(jié)果表明，甲基化與全基因表達(dá)之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[5]。DNA甲基化狀態(tài)共同調(diào)節(jié)與骨相關(guān)細(xì)胞功能有關(guān)的各種重要基因表達(dá)，如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、硬化蛋白(sclerostin，SOST)、雌激素受體α(estrogen receptor alpha，ERα)、核因子kB受體活化因子配體(receptor activator of NF-kB ligand，RANKL)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)等[6]。其中RANKL/OPG被認(rèn)為是調(diào)節(jié)骨吸收的關(guān)鍵因素[7]。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)介導(dǎo)DNA甲基化，催化DNA序列CpG島甲基化，降低基因組穩(wěn)定性以抑制轉(zhuǎn)錄活性。DNMT由DNMT1、DNMT3A、DNMT3B組成[8]。DNMT1能夠維持半甲基化DNA的甲基化狀態(tài)，DNMT3A和DNMT3B則優(yōu)先作用于未甲基化和半甲基化的DNA；而TET蛋白(ten-eleven translocation，TET)能夠轉(zhuǎn)化5-甲基胞嘧啶為5-羥甲基胞嘧啶以誘發(fā)DNA脫甲基反應(yīng)[9]。有研究發(fā)現(xiàn)DNMT可參與調(diào)控骨形成與骨吸收[10-11]。TET1和TET2用以維持MSCs細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和骨穩(wěn)態(tài)，TET1和TET2缺失會(huì)導(dǎo)致MSCs成骨分化過(guò)程缺陷甚至嚴(yán)重骨質(zhì)疏松[12]。

DNA甲基化能夠改變個(gè)體的表觀遺傳組成并產(chǎn)生穩(wěn)定的表觀遺傳效應(yīng)。通常DNA甲基化通過(guò)維持穩(wěn)定的濃縮染色質(zhì)構(gòu)型來(lái)建立基因表達(dá)抑制狀態(tài)[13]。Laurent等[14]研究表明DNA甲基化在DNA復(fù)制和有絲分裂過(guò)程中得以保留，因此基因組的抑制狀態(tài)可以遺傳至子代。這一發(fā)現(xiàn)表明，母體DNA甲基化改變對(duì)骨穩(wěn)態(tài)的影響可能遺傳至子代。

因此，更好地理解DNA甲基化對(duì)骨穩(wěn)態(tài)的影響，并闡明可能的表觀遺傳機(jī)制，這將有助于降低老年人骨質(zhì)疏松和脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)。

1.1 DNA甲基化對(duì)成骨細(xì)胞的影響

SOST基因的甲基化與絕經(jīng)后婦女的OPF發(fā)生密切相關(guān)[15]。SOST基因編碼硬化蛋白，硬化蛋白主要在骨細(xì)胞中表達(dá)，是一種重要的骨調(diào)節(jié)劑[16]。硬化蛋白能夠抑制OB活性，同時(shí)刺激OC來(lái)抑制骨形成[17]。Reppe等[15]實(shí)驗(yàn)表明，硬化蛋白作為Wnt/β-catenin信號(hào)調(diào)節(jié)劑通常在成骨時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用。在OP患者中，SOST啟動(dòng)子甲基化增加被認(rèn)為是一種代償性抵消機(jī)制，該機(jī)制降低血清硬化蛋白濃度并減輕對(duì)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的抑制，從而促進(jìn)骨骼的形成。時(shí)宇博等[18]研究結(jié)果顯示，絕經(jīng)后OP患者血漿SOST mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于無(wú)OP者。與無(wú)OP者血漿SOST基因甲基化狀態(tài)相比，絕經(jīng)后OP患者血漿中SOST基因甲基化陽(yáng)性率低，提示SOST基因甲基化可抑制其mRNA表達(dá)。Cao等[19]研究證明OPF患者骨組織中SOST mRNA表達(dá)水平與SOST基因甲基化陽(yáng)性率呈負(fù)相關(guān)。Delgado-Calle等[20]觀察到，在人股骨骨細(xì)胞中，SOST近端啟動(dòng)子區(qū)域呈低甲基化，而在原代OB和骨內(nèi)膜細(xì)胞中則無(wú)甲基化，這表明不同細(xì)胞類型之間SOST的差異性表達(dá)至少部分受到DNA甲基化的調(diào)節(jié)。因此，SOST基因甲基化可通過(guò)阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合影響mRNA表達(dá)，降低轉(zhuǎn)錄水平，這可能是OP發(fā)生的機(jī)制之一。

眾所周知，雌激素缺乏易導(dǎo)致OP。雌激素通過(guò)與ERα結(jié)合激活ERα相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)SOST啟動(dòng)子甲基化的改變可影響雌激素與ERα的結(jié)合[21]。此外，雌激素能夠通過(guò)DNA甲基化增強(qiáng)ERα基因表達(dá)，這在一定程度上也影響了雌激素的生物學(xué)功能[22]。

骨細(xì)胞中的ERα通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt拮抗劑表達(dá)而在小梁骨形成中起骨保護(hù)作用[23]。單獨(dú)敲除小鼠OC中的ERα?xí)r，小鼠則出現(xiàn)骨小梁區(qū)骨量的顯著降低、骨轉(zhuǎn)換率升高以及OC數(shù)量的增多[22]。Rooney等[24]研究集中于特定骨細(xì)胞及其前體中靶向缺失ERα的小鼠。成骨祖細(xì)胞及前體細(xì)胞中缺乏ERα，通常會(huì)影響小鼠的骨膜。小鼠分化的OB、OC中缺失ERα，通常會(huì)導(dǎo)致骨松質(zhì)骨量減少，而雌性小鼠通常出現(xiàn)更嚴(yán)重的骨量缺陷，提示ERα對(duì)骨具有保護(hù)作用。此外，Lv等[25]研究證明ERα基因啟動(dòng)子a區(qū)甲基化導(dǎo)致雌激素受體mRNA減少，相比絕經(jīng)前婦女，絕經(jīng)后婦女中啟動(dòng)子甲基化水平增加。Penolazzi等[26]研究人OB中ERα基因遠(yuǎn)端啟動(dòng)子F的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)其與OB的生長(zhǎng)、分化、活性有密切關(guān)系，且ERα基因啟動(dòng)子F內(nèi)部CpG位點(diǎn)的甲基化可能直接或間接有助于ERα基因的轉(zhuǎn)錄控制，從而影響該基因的組織特異性表達(dá)。由此可知，DNA甲基化對(duì)雌激素及ERα在OP的影響是多途徑的。

1.2 DNA甲基化對(duì)破骨細(xì)胞的影響

核因子kB受體活化因子(receptor activator of NF-kB，RANK)是OC表面的受體，由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、OB兩者合成分泌的RANKL和OPG為RANK的配體，兩者結(jié)合可刺激OC分化，促進(jìn)骨吸收，而OPG與RANK的結(jié)合阻斷這種活性[27-29]。OPG/RANKL/RANK作為介導(dǎo)OB與OC相互作用的信號(hào)通道，可調(diào)控OC的成熟、分化、活性，是最重要的骨代謝信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一[30]。因此，該系統(tǒng)的甲基化調(diào)節(jié)可能在原發(fā)性O(shè)P發(fā)生中起到重要作用[31]。

OC的分化被認(rèn)為需要RANKL與巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)信號(hào)傳導(dǎo)[32]。小鼠ST2細(xì)胞去甲基化處理后，RANKL表達(dá)顯著增加，說(shuō)明RANKL啟動(dòng)子的甲基化水平與其表達(dá)水平相關(guān)。在高同型半胱氨酸血癥伴OP動(dòng)物模型中，DNMT1表達(dá)增強(qiáng)，使OPG啟動(dòng)子被高甲基化，OPG轉(zhuǎn)錄被抑制，從而激活RANKL表達(dá)和OC形成，導(dǎo)致骨丟失[33]。Wang等[7]研究證明RANKL和OPG啟動(dòng)子中CpG位點(diǎn)甲基化水平能夠影響其表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)與非骨質(zhì)疏松性骨折的骨組織組相比，RANKL啟動(dòng)子CpG島中32個(gè)CpG位點(diǎn)在OPF組中高度去甲基化。OPG基因啟動(dòng)子在OPF組與非OPF組均被低水平甲基化，但是OPF組中的甲基化水平高得多。這些結(jié)果表明，DNA甲基化通過(guò)抑制RANKL和OPG表達(dá)從而影響OPG-RANKL系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

DNMT3A介導(dǎo)DNA甲基化，參與OC的生成、分化成熟。Nishikawa等[34]研究證明，DNMT3A通過(guò)S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionin，SAM)介導(dǎo)DNA甲基化，抑制干擾素調(diào)節(jié)因子8(interferon regulatory factor 8，IRF8)以調(diào)控OC生成，IRF8是OC表型的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，需要在表觀遺傳上沉默才能使OC生成。DNMT3A敲除小鼠OC前體不能在體外有效地分化成熟，DNMT3A敲除小鼠模型與正常對(duì)照組相比，活性O(shè)C數(shù)量減少，骨量增加，然而給去卵巢的雌性小鼠(作為絕經(jīng)后OP的模型)注射DNMT3A抑制劑Theaflavin-3，30-Digallate(TF-3)，發(fā)現(xiàn)活化OC數(shù)量減少，骨量增加，有利于防止骨丟失，提示抑制DNMT3A可能是預(yù)防骨丟失和控制絕經(jīng)后OP的有益策略[10]。因此需要進(jìn)行以O(shè)C活性過(guò)高為特征的OP和其他骨骼疾病的臨床試驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)果，為探索OP新的治療方法帶來(lái)希望。

1.3 DNA甲基化對(duì)MSCs的影響

MSCs向OB分化的過(guò)程同樣也受DNA甲基化的調(diào)節(jié)。Cao等[35]進(jìn)行了MSCs非誘導(dǎo)成骨分化和MSCs誘導(dǎo)成骨分化之間DNA甲基化水平的全基因組研究，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)MSCs組中CpG的大多數(shù)胞嘧啶被甲基化。Marofi等[36]發(fā)現(xiàn)ZBTB16和Twist1基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的DNA甲基化可能是控制MSCs向OB分化的主要機(jī)制之一。

Nomura等[37]研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A和DNMT3B活性在MSCs軟骨分化過(guò)程中顯著上調(diào)，DNMT3A過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了MSCs軟骨分化能力。此外，Cakouros等[38]發(fā)現(xiàn)TET在MSCs分化中起關(guān)鍵作用。TET1可以抑制MSCs成骨和成脂分化，并且可能通過(guò)募集其他表觀遺傳修飾劑以間接發(fā)揮作用，而TET2則直接促進(jìn)MSCs成骨和成脂分化。同樣地，在OP患者中TET1和TET2轉(zhuǎn)錄水平均被下調(diào)。靶向TET分子或其下游靶標(biāo)可能提供新的治療策略，以幫助防止骨丟失和創(chuàng)傷或疾病后的修復(fù)。

脂肪細(xì)胞和OB皆源自MSCs的中胚層譜系。Cho等[39]證明了DNA甲基化抑制劑5-氮雜2'-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dC)在脂肪形成和OB發(fā)生之間具有譜系確定作用。Wnt10a是決定間充質(zhì)譜系走向OB的關(guān)鍵因素。Wnt10a 5'-區(qū)域富含CpG位點(diǎn)，5-Aza-dC能夠顯著降低其甲基化水平，上調(diào)Wnt10a基因表達(dá)，提示5-Aza-dC可通過(guò)抑制3T3-L1脂肪前體細(xì)胞中的DNA甲基化而顯著抑制脂肪生成，并促進(jìn)OB生成。因此，DNA甲基化抑制劑5-Aza-dC的應(yīng)用可能為伴有肥胖癥的OP患者的治療提供新途徑。

2 DNA甲基化研究對(duì)骨質(zhì)疏松癥預(yù)防、診斷、治療的意義

2018年中國(guó)首個(gè)OP流行病學(xué)調(diào)查發(fā)布，結(jié)果顯示我國(guó)50歲以上人群的OP患病率為19.2%，50歲以上女性的OP患病率高達(dá)32.1%，65歲以上女性的OP患病率更是達(dá)到了51.6%。我國(guó)低骨量人群數(shù)量大，在不良生活習(xí)慣與年齡增加等多因素影響下，其患OP的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步加重，且普遍對(duì)OP認(rèn)知不足，骨密度檢測(cè)率低，預(yù)防意識(shí)不強(qiáng)。因此，如何有效、科學(xué)地防治OP是當(dāng)前亟待解決的公共健康問(wèn)題。但目前在治療過(guò)程中尚沒有合適的指標(biāo)可以預(yù)示患者的新發(fā)骨折風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也缺乏合適指標(biāo)用于治療早期監(jiān)測(cè)藥物療效與指導(dǎo)臨床醫(yī)師治療方案的選擇[40]。

在細(xì)胞分化過(guò)程中，DNA甲基化是動(dòng)態(tài)的，但某些DNA甲基化模式可能會(huì)以表觀遺傳記憶的形式保留，且DNA甲基化能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的表觀遺傳效應(yīng)[41]。盡管存在外部干擾，但由于甲基化的高穩(wěn)定性以及穩(wěn)定表觀遺傳效應(yīng)，它們?nèi)钥梢栽诒姸嗌飿悠分凶鳛橹笇?dǎo)診斷、預(yù)后、治療的生物標(biāo)志物。然而，目前仍無(wú)甲基化測(cè)試應(yīng)用于臨床OP篩檢治療，且外周血DNA甲基化模式是否可以作為OP生物標(biāo)記的研究較少且研究結(jié)果不一致[42]。因此，目前外周血DNA甲基化標(biāo)記用于OP患者的篩檢和療效的監(jiān)測(cè)是否可行仍然存疑。

Fernandez-Rebollo等[43]比較分析了16名非OP患者與32例原發(fā)性O(shè)P患者的外周血全基因組DNA甲基化譜，但未在OP患者中發(fā)現(xiàn)任何一個(gè)CpG位點(diǎn)存在顯著異常甲基化。同上述結(jié)論相反，Reppe等[44]研究測(cè)試了患OP和健康的絕經(jīng)后婦女骨骼和血液中的DNA甲基化分布，在對(duì)應(yīng)100個(gè)表達(dá)水平與BMD最顯著相關(guān)基因的2 529個(gè)CpG位點(diǎn)中，有63個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平在患OP女性和健康女性之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的不同，其中有53個(gè)CpG位點(diǎn)患OP婦女的甲基化水平高于健康婦女。絕經(jīng)后婦女中間組結(jié)果(其BMD水平和臨床特征介于患OP女性和健康婦女之間的中間水平)也證實(shí)了63個(gè)CpG位點(diǎn)中的84%為中間DNA甲基化水平。隨后測(cè)試了來(lái)自獨(dú)立隊(duì)列血細(xì)胞中選定的骨CpG的甲基化水平。此分析局限于450名68歲及以上獻(xiàn)血者中的250名白人婦女?？偣策x擇了63個(gè)CpG甲基化位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試。有趣的是，在獨(dú)立的隊(duì)列中，血液中的63個(gè)CpG中有13個(gè)也顯示與BMD相關(guān)。當(dāng)比較高骨密度和低骨密度時(shí)，其中的12種CpG(除UGP2中的cg12876517以外)沿著與骨骼相同的方向改變，因此表明骨骼和血液中的DNA甲基化調(diào)節(jié)機(jī)制相似[44]。Cheishvili等[45]檢測(cè)了22名正常女性和22名絕經(jīng)后OP女性(51～89歲)的外周血全基因組DNA甲基化譜，在對(duì)比分析得出的1 233個(gè)差異甲基化的CpG位點(diǎn)列表中進(jìn)一步進(jìn)行熱圖和聚類分析，最終發(fā)現(xiàn)差異最顯著的77個(gè)CpG位點(diǎn)的差異甲基化可有效區(qū)分非OP者與OP患者，提示這些位點(diǎn)與OP有關(guān)。在早期OP患者中也發(fā)現(xiàn)了這些差異位點(diǎn)，因此這些位點(diǎn)也可作為OP早期外周血生物標(biāo)記。

表觀遺傳修飾劑可緩解OP的發(fā)展，如DNA甲基化抑制劑5-Aza-dC可改善廢用性O(shè)P發(fā)展[46]。但目前表觀遺傳修飾劑用于OP治療仍然難以實(shí)現(xiàn)。因此，表觀遺傳修飾劑臨床實(shí)驗(yàn)研究的開展對(duì)OP的治療具有重大意義。例如開展在外周血DNA甲基化模式的大規(guī)模研究可進(jìn)一步幫助確定外周血DNA甲基化標(biāo)記與OP的相關(guān)性，使外周血DNA甲基化標(biāo)記用于OP患者的篩檢和療效的監(jiān)測(cè)成為可能。

3 總結(jié)

DNA甲基化在骨代謝和OP等年齡相關(guān)性疾病中具有重要作用且通常與基因表達(dá)的抑制有關(guān)。DNA甲基化影響OB的分化和MSCs成骨分化譜系確定，并在OC的分化、成熟以及OC和OB間平衡的調(diào)控中發(fā)揮作用。盡管存在外部干擾，但由于甲基化具有很高的穩(wěn)定性，它們?nèi)跃哂性诒姸嗌飿悠分杏米髦笇?dǎo)診斷、預(yù)后、治療的生物標(biāo)志物的潛力。但目前仍無(wú)OP針對(duì)性的甲基化測(cè)試，外周血DNA甲基化標(biāo)記用于OP患者的篩檢和療效的監(jiān)測(cè)是否可行仍然存疑。因此致力于尋找外周血中OP相關(guān)甲基化生物標(biāo)記及外周血DNA甲基化模式作為OP生物標(biāo)記可行性驗(yàn)證的研究，對(duì)早期OP患者的發(fā)現(xiàn)診斷、指導(dǎo)治療方案的選擇以及個(gè)體化精準(zhǔn)治療OP具有重大的意義。