溶藻弧菌檢測技術研究進展

◎ 劉 瑩，倪春苗，李思佳，徐映如

（上海市虹口區(qū)疾病預防控制中心，上海 200082）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是革蘭氏染色陰性、有鞭毛、無芽孢和莢膜的條件致病菌，在海洋和河口中分布廣泛，不僅對魚、蝦、貝類等水生生物具有致病性，還能通過進食被感染的水產(chǎn)品和感染創(chuàng)口等方式引起人體食物中毒、組織壞死、中耳炎等疾病[1]。因此，能快速、靈敏、準確地檢測溶藻弧菌，有助于及時阻斷疾病傳播，減少水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)損失，維護食品安全和人類健康。

1 傳統(tǒng)細菌檢測技術

通過細菌培養(yǎng)技術分離病原菌，并根據(jù)菌落特征、生化反應等方法對病原菌加以鑒定是食源性病原菌的經(jīng)典檢測手段[2]。張曉艷等[3]先使用3%氯化鈉堿性蛋白胨水對樣本進行增菌，再依次接種到TCBS平板和科瑪嘉弧菌顯色平板上進行分離培養(yǎng)，然后通過生化反應鑒定目標菌落。溶藻弧菌在TCBS平板上為圓形、表面光滑、大而扁平的黃色菌落，在科瑪嘉平板上為較小的無色菌落。傳統(tǒng)細菌檢測技術在檢驗檢測實驗室中應用廣泛，但完成一次檢測通常需要數(shù)天，不適用于大樣本量或緊急情況的檢測。

2 免疫學技術

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一種十分靈敏的免疫學檢測方法，原理是抗原與抗體的特異性結(jié)合，以及作為標記物的酶與底物發(fā)生的顯色反應，既可以通過觀察有無顯色反應來做定性判斷，也可以利用酶標儀測定光密度進行定量分析[4]。李明云等[5]構(gòu)建了表達溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的重組質(zhì)粒pET-28a-OmpK，利用該蛋白免疫小鼠得到抗血清，建立溶藻弧菌間接ELISA檢測法，該方法特異性強，靈敏度為104CFU·mL-1。職通瑞等[6]以滅活溶藻弧菌為抗原制備兔抗溶藻弧菌抗體，建立了間接ELISA檢測法，靈敏度為104CFU·mL-1，與副溶血性弧菌等6種弧菌無交叉反應。

2.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法（Colloidal Gold Immunochromatography Assy，GICA）通過觀察待檢物質(zhì)與膠體金標記的抗原或抗體在膜上相結(jié)合發(fā)生的顯色反應來檢測病原菌，較ELISA更快速簡便，廣泛應用于現(xiàn)場檢測及疾病初篩[7]。王蓓等[8]利用兔抗溶藻弧菌多克隆抗體制作了穩(wěn)定性良好的溶藻弧菌免疫膠體金快速檢測試紙，檢測靈敏度為106CFU·mL-1，檢測時間不超過10 min，與其他8株菌無交叉反應。李嘉文等[9]通過待檢細菌樣品與溶藻弧菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物、全菌破碎蛋白競爭性結(jié)合膠體金標記的兔抗溶藻弧菌多克隆抗體來檢測溶藻弧菌，方法靈敏度為5×105CFU·mL-1，反應時間為10～15 min，與副溶血性弧菌等4種弧菌無交叉反應。

2.3 免疫磁珠分離法

免疫磁珠分離法（Immunomagnetic Beads Separation，IMBS）利用包被特異性抗體的免疫磁珠與目標抗原相結(jié)合，在磁場的作用下分離抗原，具有簡易、快速、靈敏度高的優(yōu)點[10]。紀勇[11]以兔抗溶藻弧菌IgG包被的免疫磁珠富集溶藻弧菌，確立了該方法中免疫磁珠的最佳工作濃度和最佳反應時間，靈敏度為 2.8 CFU·mL-1。

3 分子生物學檢測技術

3.1 聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）利用DNA半保留復制和堿基互補配對原理，通過一對特異性引物體外擴增目標基因片段，操作簡單、靈敏快速、特異性強[12]。龐興紅等[13]針對溶藻弧菌毒力菌株HN08155的SDRH基因設計引物，使用該引物可以鑒別與HN08155菌株具有相似遺傳型的溶藻弧菌毒力菌株，該方法靈敏度為1.58×102CFU·mL-1。李丹丹等[14]設計了雙啟動寡核苷酸引物來檢測溶藻弧菌的膠原蛋白水解酶基因，雙啟動寡核苷酸引物比普通引物特異性更強，退火溫度范圍更大，該方法特異性強，靈敏度為1.14×102CFU·mL-1。

3.2 多重PCR

多重PCR（Multiplex PCR，MPCR）是指在一個PCR反應管中加入多對引物，同時擴增多個靶基因序列，因此比普通PCR的檢測效率更高[15]。桑艷嬌等[16]針對副溶血性弧菌和溶藻弧菌的gyrB基因設計引物，通過不斷優(yōu)化PCR反應體系和反應條件，建立了靈敏度高、特異性強的可同時檢測副溶血性弧菌和溶藻弧菌的檢測方法，其中檢測溶藻弧菌的靈敏度為2.03×102CFU·mL-1。魏霜等[17]設計了5對引物——4對包括溶藻弧菌gyrB基因在內(nèi)的食源性弧菌基因引物和1對細菌16S rRNA基因引物，建立了一種可以同時檢測4種食源性弧菌并能排除假陰性的五重PCR檢測法，對溶藻弧菌的檢測靈敏度為10 CFU·mL-1。

3.3 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）在PCR反應體系中加入熒光物質(zhì)，熒光物質(zhì)隨PCR反應而積累，通過實時監(jiān)測熒光信號得到擴增曲線和CT值，從而進行基因定量檢測，該方法用時短、自動化高、靈敏度高、特異性強[18]。李丹丹等[19]針對溶藻弧菌膠原蛋白水解酶基因設計引物和TaqMan探針，構(gòu)建了一種特異性良好的溶藻弧菌qPCR檢測法，靈敏度為18 CFU·mL-1。鐘淵福等[20]針對溶藻弧菌鞭毛基因fli C設計探針引物，建立了Taqman探針qPCR檢測法，靈敏度為102CFU·mL-1，特異性良好。

3.4 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）是第三代核酸擴增技術，通過微滴化處理將核酸樣品平均分配到幾十到幾十萬個反應單元中進行PCR反應，然后根據(jù)熒光信號陽性數(shù)和泊松分布對DNA拷貝數(shù)進行絕對定量[21]。李丹等[22]利用優(yōu)化的微滴式數(shù)字PCR反應體系檢測溶藻弧菌，結(jié)果顯示其準確度與靈敏度均優(yōu)于實時熒光定量PCR，說明該方法在低濃度DNA檢測中存在優(yōu)勢。

3.5 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）核酸擴增在恒溫下進行，不需要昂貴的儀器設備，較普通PCR和qPCR更便捷、快速、經(jīng)濟，該法的關鍵是LAMP引物的設計[23]。徐義剛等[24]針對溶藻弧菌膠原酶基因設計LAMP引物，65 ℃下反應45～60 min即可成功擴增出典型LAPM條帶，用該方法檢測純培養(yǎng)溶藻弧菌和污染水產(chǎn)品中溶藻弧菌，靈敏度分別為 10 CFU·mL-1和 19 CFU·mL-1。陳昌國等[25]針對溶藻弧菌gyrB基因設計LAMP引物，結(jié)果顯示最佳擴增溫度和時間分別為60 ℃和60 min，該方法靈敏度為 10-4mg·L-1。

4 其他溶藻弧菌檢測技術

4.1 PCR-變性高效液相色譜法

PCR-變性高效液相色譜法（PCR-Denaturing High Performance Liquid Chromatography，PCRDHPLC）指利用變性高效液相色譜法檢測靶基因PCR擴增產(chǎn)物，然后根據(jù)樣本中不同菌株的特異性峰型來判定目標菌株，與傳統(tǒng)的PCR產(chǎn)物鑒定法——凝膠電泳法相比，可實現(xiàn)更快速、高通量的檢測[26]。邵碧英等[27]在單一PCR的基礎上建立了多重PCR-變性高效液相色譜法（MPCR-DHPLC），可以同時檢測5種食品中的致病性弧菌——霍亂弧菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌和擬態(tài)弧菌。

4.2 生物芯片

生物芯片（Biochip）可以通過收集芯片載體上的生物分子探針與被標記的靶分子的雜交信號來檢測病原微生物，生物分子探針有寡核苷酸、抗原、抗體等，該法具有高通量、高靈敏度、高特異性的優(yōu)點[28]。丁君等[29]構(gòu)建了一種可以同時檢測溶藻弧菌、副溶血性弧菌等6種致病性弧菌的基因芯片。繩秀珍等[30]用6種常見魚類病原性弧菌的外膜蛋白、胞外產(chǎn)物、鞭毛蛋白和全菌蛋白構(gòu)建了血清學診斷抗原芯片。

4.3 生物傳感器

生物傳感器（Biosensor）的原理是將生物物質(zhì)的濃度轉(zhuǎn)化成電信號加以檢測，高效、快速、靈敏，廣泛應用于食品檢驗和環(huán)境監(jiān)測等領域[31]。TIAN等[32]利用石墨烯開發(fā)了一種基于溶藻弧菌特異性DNA酶的熒光傳感器，反應快速，靈敏度高，特異性強。

4.4 核酸適配體

核酸適配體（Aptamer）是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術篩選出來的與靶基因具有高特異性和親和力的單鏈寡核苷酸序列[33]。林筱鈞等[34]構(gòu)建了磁珠-核酸適配體-熒光報告探針復合物，通過檢測反應中的熒光信號實現(xiàn)對溶藻弧菌的定量檢測。

4.5 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometer，MALDI-TOF MS）將通過軟電離獲得的細菌蛋白質(zhì)組特異性指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫中的標準菌株指紋圖譜進行比對來鑒定目標菌種[35]。趙曉娟等[36]建立了溶藻弧菌MALDI-TOF MS檢測法，并對實驗中的影響因素進行比較評估，發(fā)現(xiàn)傳代次數(shù)不影響檢測結(jié)果，而甲酸提取法、合適的激光強度和完備的數(shù)據(jù)庫可提高檢測準確度。

5 結(jié)語

溶藻弧菌作為海洋和水生生物中常見的條件致病菌，對水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品安全和人類健康都存在著潛在威脅。因此，溶藻弧菌也被列為食品安全風險監(jiān)測常規(guī)監(jiān)測菌種之一。隨著對溶藻弧菌生物學特性的深入研究，新型檢測技術和設備的不斷出現(xiàn)，以及各種檢測技術的相互結(jié)合，將來會有更多更快速、靈敏、精確、高通量的檢測技術應用到溶藻弧菌的檢測中去。