NLRP3炎癥小體在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用研究進(jìn)展

姜銅源，冀兵

1 山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030000；2 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)中心

蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）是臨床常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有高死亡率及高致殘率，幸存者也極有可能出現(xiàn)長(zhǎng)期神經(jīng)功能缺陷［1］。SAH 的不良預(yù)后與早期腦損傷（EBI）、腦水腫和遲發(fā)性腦血管痙攣相關(guān)。EBI是SAH 后72 h 內(nèi)整個(gè)腦組織的直接損傷，目前被認(rèn)為是SAH 患者死亡和遲發(fā)性神經(jīng)功能缺損的主要原因之一［2］。造成EBI 可能的機(jī)制包括神經(jīng)炎癥反應(yīng)、顱內(nèi)壓升高、腦血流減少、微血栓的形成、血腦屏障破壞（BBB）和腦水腫［3-4］。以促炎介質(zhì)的釋放以及小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，加劇了SAH 后的EBI。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體參與SAH 后神經(jīng)炎癥，在SAH 后24 h內(nèi)NLRP3炎癥小體表達(dá)水平上調(diào)并達(dá)高峰，同時(shí)炎癥因子及IL-1β、IL-18水平升高［1-2］。應(yīng)用NLRP3 炎癥小體抑制劑可提高前循環(huán)自體血注射SAH 模型小鼠的生存率，改善其EBI 和神經(jīng)功能缺損。這可能與NLRP3 炎癥小體在SAH后具有強(qiáng)大的抗炎作用有關(guān)，在減輕水腫、保護(hù)緊密連接、改善微血栓形成、延遲腦血管痙攣和改善功能缺陷中發(fā)揮重要作用［5］。本文對(duì)NLRP3炎癥小體在SAH中的作用進(jìn)行綜述。

1 NLRP3炎癥小體

NLRP3 炎癥小體是一種由NLRP3 蛋白、銜接蛋白（ACS）、半胱氨酸天冬氨酸酶-1 前體（pro-caspase-1）三部分組成的多蛋白聚合復(fù)合物。NLRP3 蛋白包含三部分：C 端的亮氨酸重復(fù)序列（LRR）、中段特征性的核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域和N 端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（PYD）三部分；ASC蛋白包含1個(gè)PYD結(jié)構(gòu)域和1個(gè)半胱天冬酶激活和募集結(jié)構(gòu)域（CARD）；pro-caspase-1 也包含一個(gè)CARD 結(jié)構(gòu)域［6］。NLRP3 蛋白可以與ACS 的PYD 結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，結(jié)合后的復(fù)合物通過ACS 的CARD 與pro-caspase-1 的CARD 相互結(jié) 合實(shí)現(xiàn)對(duì)pro-caspase-1 的募集，部分組裝的ACS 結(jié)構(gòu)域?qū)⑿?yīng)蛋白pro-caspase-1 剪切為caspase-1，形成具有活性的NLRP3 炎癥小體，caspase-1 可以剪切前IL-1β（pro-IL-1β）、前IL-18（pro-IL-18）、細(xì)胞焦亡效應(yīng)蛋白（GSDMD），促進(jìn)IL-1β、IL-18、活化型GSDMD（GSDMD-p30）的形成［6］。研究發(fā)現(xiàn)，有絲分裂基因A 相關(guān)表達(dá)的激酶7（NEK7）也是NLRP3 炎癥小體的組成部分，可以在啟動(dòng)和激活間期與NLRP3 蛋白的LRR及NACHT結(jié)合［7］。在靜息狀態(tài)下，NLRP3蛋白的基礎(chǔ)水平較低，不會(huì)與銜接蛋白ACS、效應(yīng)蛋白前體pro-caspase-1進(jìn)行［8］。

2 NLPR3炎癥小體的激活

活性NLRP3 炎性小體的功能調(diào)節(jié)過程分為兩步。首先需要非激活的“啟動(dòng)”刺激來啟動(dòng)關(guān)鍵炎癥小體成分的表達(dá)，然后是炎癥小體組裝的第二信號(hào)“激活”刺激。啟動(dòng)由TLR/核因子-κ 輕鏈增強(qiáng)子（NF-κB）途徑或活性氧自由基（ROS）通路誘導(dǎo)，使NLRP3 蛋白、pro-IL-1β、pro-IL-18 mRNA 表達(dá)上調(diào)。第二信號(hào)由K+外流、Ca2+內(nèi)流、ROS 的形成、溶酶體破裂介導(dǎo)，激活NLRP3 蛋白，并與ASC 和caspase-1在級(jí)聯(lián)反應(yīng)中結(jié)合，形成具有活性的NLRP3 炎癥小體。

Toll 樣受體4（TLR4）可識(shí)別SAH 后損傷相關(guān)分子模式、腫瘤壞死因子等信號(hào)，隨后通過激活NF-κB使NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18 mRNA 表達(dá)上調(diào)［9］。NF-κB 通路使NLRP3 炎癥小體啟動(dòng)的機(jī)制可能由p65核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)，增加了NLRP3蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，這有助于NLRP3炎癥小體的形成［10］。

ROS 通路的關(guān)鍵步驟是ROS 的產(chǎn)生，其中線粒體功能障礙來源的ROS 是最早被認(rèn)為激活炎癥小體的主要因素之一。受體相互作用蛋白（RIP）是一個(gè)絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族，由四種異構(gòu)體RIP1-4 組成。研究指出RIP1 和RIP3 的活性形式可以構(gòu)成RIP1-RIP3 復(fù)合物，該復(fù)合物參與NLRP3 炎癥小體的激活。在SAH 后腫瘤壞死因子刺激RIP1-RIP3 復(fù)合物的形成。線粒體功能障礙由動(dòng)力相關(guān)蛋白1（DRP1）調(diào)節(jié)，DRP1 介導(dǎo)線粒體有絲分裂，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增加ROS 的生成［11］。SAH 的發(fā)生會(huì)導(dǎo) 致RIP1、RIP3、磷酸化DRP1 和NLRP3 蛋 白、pro-IL-1β、ROS 類物質(zhì)表達(dá)上調(diào)，且SAH 后NLRP3炎癥小體激活可能是由RIP1-RIP3-DRP1-ROS 通路介導(dǎo)。同時(shí)向SAH 小鼠腹腔注射PIP1 激酶抑制劑（Nec-1）或線粒體分裂抑制劑（Mdivi-1），發(fā)現(xiàn)Nec-1降低了小鼠腦組織中的RIP1、RIP3、磷酸化DRP1和NLRP3 炎癥小體表達(dá)；Mdivi-1 可抑制DRP1 蛋白表達(dá)，減輕線粒體損傷，減少ROS 的產(chǎn)生，抑制NLRP3炎癥小體表達(dá)［12］。

綜上所述，ROS 在NLRP3 炎癥小體的啟動(dòng)與激活兩個(gè)過程中都發(fā)揮了一定作用。然而，其啟動(dòng)及激活NLRP3 炎癥小體的具體機(jī)制尚未闡明，ROS 作為啟動(dòng)信號(hào)可能的機(jī)制是NEK7識(shí)別ROS 信號(hào)并使下游蛋白質(zhì)巰基氧化［7］，作為第二信號(hào)的機(jī)制可能與硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）有關(guān)［13］。

兩種激活通路在SAH 中并非單獨(dú)出現(xiàn)，有研究證實(shí)，ROS 的產(chǎn)生可以激活TLR4-NF-κB 通路［9］。NLRP3 炎癥小體經(jīng)過上述通路并不能直接成為具有活性的多聚復(fù)合物，需要第二信號(hào)調(diào)控復(fù)合物的組裝過程［14］。NLRP3 炎癥小體第二信號(hào)主要包括K+外流、Ca2+內(nèi)流、ROS的形成、溶酶體破裂［15］。其中K+外流作為第二信號(hào)對(duì)NLRP3 炎癥小體的活化最為重要，其可能是通過影響NEK7 與NLRP3 蛋白的結(jié)合，促進(jìn)NLRP3 炎癥小體的組裝［16］。溶酶體破裂釋放的組織蛋白酶B 促進(jìn)了NLRP3 炎性小體的激活［2］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于NLRP3炎癥小體的激活及組裝機(jī)制這一過程已經(jīng)有初步研究，但是對(duì)于啟動(dòng)通路與第二信號(hào)之間以及第二信號(hào)在NLRP3 炎癥小體組裝過程中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3 NLRP3炎癥小體在SAH后EBI中的作用

3.1 NLRP3 炎癥小體在SAH 后EBI 中的作用機(jī)制

3.1.1 參與神經(jīng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng) NLRP3 炎癥小體在SAH后參與神經(jīng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致EBI的發(fā)生。caspase-1 可以將pro-IL-1β、pro-IL-18 轉(zhuǎn)化為IL-1β、IL-18，促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重SAH 后EBI［17］。IL-1是一種促炎癥細(xì)胞因子，是炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的重要介質(zhì)。IL-1 及其下游介質(zhì)（尤其是IL-6）在正常環(huán)境下不具有神經(jīng)毒性，但在SAH 神經(jīng)病理學(xué)狀態(tài)下具有顯著毒性。IL-6可導(dǎo)致血管炎癥及破壞內(nèi)皮細(xì)胞屏障作用，還可充當(dāng)中間體，誘導(dǎo)病變區(qū)域炎性細(xì)胞聚集，增加ROS 的釋放，與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）協(xié)同作用，促進(jìn)腦血管痙攣及EBI［18］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，使用IL-1β 抗體中和IL-1 可抑制SAH 小鼠的血管痙攣、小膠質(zhì)細(xì)胞激活及外周白細(xì)胞向神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)［19］。有學(xué)者提出，自噬是可以將老化或受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊或突變的蛋白質(zhì)分離形成雙層膜泡的自噬體，然后融合到溶酶體中將分離成分降解的一個(gè)過程，自噬可以清除IL-1、IL-18 及ROS 從而對(duì)炎癥小體的激活起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，組裝的NLRP3 炎癥小體也可通過自噬途徑被清除，從而減輕SAH后EBI［20］。

3.1.2 參與小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變 小膠質(zhì)細(xì)胞是參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫的重要組成部分，其被激活后分為促炎表型（M1）和抗炎表型（M2）。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6 和TNF-α 等促炎細(xì)胞因子；M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-10 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等抗炎細(xì)胞因子，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并有助于神經(jīng)元再生［21］。SAH 后早期M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞占主導(dǎo)地位，隨后向M2 型轉(zhuǎn)變；促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 型極化可以改善SAH 后神經(jīng)炎癥反應(yīng)［22］。研究表明，抑制NLRP3 炎癥小體活性可促使小膠質(zhì)細(xì)胞由M1 型向M2 型轉(zhuǎn)變，改善SAH 后神經(jīng)功能缺損、腦水腫、氧化損傷、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)細(xì)胞焦亡［1］。因此，NLRP3 炎癥小體或可成為小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的治療靶點(diǎn)，有希望改善患者的EBI。

3.1.3 參與神經(jīng)細(xì)胞焦亡過程 細(xì)胞焦亡是炎癥小體所介導(dǎo)的一種特殊的程序性細(xì)胞死亡。在SAH后caspase-1可以切割GSDMD生成活化的GSDMD-p30［2］，后者在細(xì)胞膜上形成多聚化孔道，細(xì)胞內(nèi)炎性分子細(xì)胞內(nèi)IL-1β 和IL-18 等經(jīng)該孔道釋放，同時(shí)細(xì)胞腫脹破裂，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的焦亡。通過抑制GSDMD 蛋白的表達(dá)，可減輕神經(jīng)元變性，改善SAH 后的EBI，減輕神經(jīng)功能障礙［23］。目前關(guān)于SAH 后EBI 中神經(jīng)元焦亡的知識(shí)有限，亟待進(jìn)一步研究。

3.1.4 參與微血栓形成 SAH 患者尸檢及動(dòng)物模型中在大腦缺血區(qū)域均發(fā)現(xiàn)了大量微血栓。微血栓形成被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后不良的主要原因［24］。SAH 后抑制NLRP3 炎癥小體可以減少微血栓的形成，改善患者的EBI 和遲發(fā)性神經(jīng)功能缺損［25］。有學(xué)者認(rèn)為，微血栓形成的主要原因是炎癥介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及凝血功能障礙［26］。關(guān)于NLRP3炎癥小體在微血栓形成中的機(jī)制研究較少，由其介導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的微血栓形成，或其自身具有致微血栓形成的作用尚未明確，仍需進(jìn)一步研究。

3.1.5 參與血腦屏障破壞 血腦屏障的破壞會(huì)引起血腦屏障的通透性增加、腦水腫、顱內(nèi)壓升高、繼發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞焦亡等，其被認(rèn)為是腦疝的主要原因，升高SAH 患者病死率。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體與血腦屏障的破壞相關(guān)，但其作用機(jī)制尚不明確。研究提出，NLRP3 炎癥小體參與血腦屏障的破壞可能是IL-1 介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶9 降解腦內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白所致［27］。caspase-1-GSDMD 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡也參與血腦屏障的破壞，抑制NLPR3 炎癥小體可以保護(hù)血腦屏障的完整性［28］。

3.2 NLRP3炎癥小體在EBI治療中的作用

上述證據(jù)表明，SAH 可以激活NLRP3 炎癥小體，而炎癥小體的激活通路中抑制其中任何一個(gè)靶點(diǎn)均可能減輕神經(jīng)炎癥和改善SAH 患者的預(yù)后，這些藥物大致可以分為四類：作用于NF-κB 通路的藥物、作用于ROS 通路的藥物、NLRP3 炎癥小體特異性抑制劑、其他特殊藥物。

3.2.1 作用于NF-κB通路的藥物 研究發(fā)現(xiàn)，SAH后用右美托咪定治療可部分通過抑制TLR4/NF-κB通路來抑制NLRP3 炎癥小體激活，改善神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分，減輕腦水腫，降低血腦屏障的通透性，并上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)，減輕SAH 誘導(dǎo)的EBI［29］。氟西汀是一種抗抑郁藥物，其可以抑制抑郁癥患者的NLRP3 小體的激活。氟西汀治療SAH，其作用機(jī)制主要是減少M(fèi)1 型小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和外周中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、下調(diào)TLR4 的表達(dá)、激活自噬作用等，減輕EBI［30］。富氫鹽水在SAH 后發(fā)揮抗氧化和抗凋亡作用，其可部分通過Akt/GSK3β 途徑減弱SAH 誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，還可通過抑制NF-κB 通路和促進(jìn)NLRP3 炎癥小體的失活，抑制EBI 炎癥，改善SAH后的神經(jīng)行為［4］。二氫硫辛酸治療通過SAH 后EBI中的LAMP1/CaMKII/TAK1通路減輕炎癥并改善神經(jīng)功能［31］。其主要機(jī)制是阻斷TAK1，不僅可以抑制磷酸化NF-κB p65 表達(dá)和NLRP3 炎癥小體激活，還能抑制ROS 的產(chǎn)生，并阻止促進(jìn)自噬的溶酶體組織蛋白酶B 釋放到細(xì)胞質(zhì)中［2］。此外，Resolvin D1（RVD1）是一種從二十二碳六烯酸中提取的脂質(zhì)介質(zhì)，具有抗炎和神經(jīng)保護(hù)特性。RVD1 的內(nèi)源性受體是甲酰肽受體2，通過IκBα 途徑上調(diào)脂多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接蛋白的表達(dá)，降低血管通透性。甲酰肽受體2 通過上調(diào)TNF-α 誘導(dǎo)蛋白3 來抑制NF-κB 通路激活，阻斷NLRP3 炎癥小體的激活，從而起保護(hù)血腦屏障的作用［10］。

3.2.2 作用于ROS 通路的藥物 白黎蘆醇（RSV）與薯蕷皂苷均可通過血腦屏障，是SIRT1 的有效激活劑。SAH 后，SIRT1 通過抑制ROS 介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。RSV還可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 表型分化，這可能是抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活及小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)的原因［32］。芒果苷（MF）具有改善SAH后神經(jīng)功能和組織水腫的功能；通過降低脂質(zhì)過氧化、恢復(fù)內(nèi)源性酶（超氧化物歧化酶和過氧化氫酶）和增加谷胱甘肽來減輕SAH 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激；減少SAH 后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和腦組織線粒體凋亡途徑的激活；在減輕SAH 后促炎細(xì)胞因子的局部釋放的同時(shí)，MF 下調(diào)NLRP3、ASC 和切割的caspase-1的表達(dá)以及NF-κB的激活；MF還可以劑量相關(guān)的方式有效上調(diào)SAH大鼠大腦中核因子NF-E2相關(guān)因子（Nrf2）和血紅素氧化酶1（HO-1）的表達(dá)。Nrf2/HO-1 級(jí)聯(lián)可能是MF 發(fā)揮藥理作用的主要途徑。Nrf2/HO-1 級(jí)聯(lián)促進(jìn)線粒體相關(guān)凋亡蛋白如Bcl-2激活，激活的Bcl-2可以抑制細(xì)胞色素C 將procaspase-3 加工成活化的caspase-3。Nrf2/HO-1 級(jí)聯(lián)也可抑制ROS 的產(chǎn)生，從而抑制NLRP3炎癥小體的激活和組裝［9］。apelin-13 可顯著改善SAH 后神經(jīng)功能，減輕腦水腫，并維持血腦屏障完整性；顯著改善長(zhǎng)期空間學(xué)習(xí)和記憶；抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，防止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過度激活，并降低TXNIP、NLRP3、裂解的caspase-1、IL-1β、TNF-α、髓過氧化物酶和ROS 的水平。其作用機(jī)制部分由ROS 通路的TXNIP 抑制NLRP3 炎癥小體激活所介導(dǎo)［13］。銀杏葉提取物已被廣泛應(yīng)用于各種心腦血管疾病的治療，最近研究發(fā)現(xiàn)將銀杏葉提取物用于治療SAH 可改善EBI，其作用機(jī)制與TXNIP 的抑制有關(guān)［33］。坦螺旋霉素（17-AAG）是熱休克蛋白90（HSP90）的特異性抑制劑。在SAH 后應(yīng)用17-AAG 可減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)、減少微血栓的形成。17-AAG 改善SAH 后的神經(jīng)功能部分通過HSP90/RIP3/NLRP3 信號(hào)通路完成［25］。在此之前一項(xiàng)研究報(bào)道，抑制HSP90 可減輕NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［34］。17-AGG 在SAH 后的作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)議，但其對(duì)于NLRP3 炎癥小體激活的抑制作用得到了肯定。

3.2.3 NLRP3 炎癥小體特異性抑制劑 MCC950作為NLRP3 炎癥小體的選擇性抑制劑，在治療炎癥性疾病時(shí)對(duì)NLRP3 炎癥小體的抑制有效。在SAH后24 h，MCC950 通過抑制NLRP3 炎癥小體減輕EBI。用MCC950 治療大腦血管穿孔的SAH 模型小鼠EBI，神經(jīng)功能缺損和腦水腫得到改善［5］。

3.2.4 其他藥物 褪黑素（MLT）除是一種重要的晝夜節(jié)律分子外，還具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎和抗凋亡。通過自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤可以逆轉(zhuǎn)MLT 對(duì)于NLRP3 炎癥小體的抑制作用，MLT 對(duì)于炎癥小體的激活主要由自噬介導(dǎo)［35］。研究發(fā)現(xiàn)，MLT的抗凋亡作用可以上調(diào)Bcl-2表達(dá)以及抑制NLRP3 炎癥小體的激活，但其研究結(jié)果更傾向于抑制NLRP3 炎癥小體是MLT 抗凋亡調(diào)節(jié)的主要原因［36］。最新研究結(jié)果與之相反，認(rèn)為上調(diào)Bcl-2表達(dá)是MLT 抗凋亡調(diào)節(jié)的主要原因［3］。還有研究提出，氫氣的吸入可以降低SAH 大鼠血管中炎癥和凋亡標(biāo)志物的表達(dá)，減輕腦水腫，抑制微血栓形成和血管痙攣。其分子機(jī)制可能與抑制ROS/NLRP3 軸的激活有關(guān)［37］。

越來越多的證據(jù)表明，NLRP3 炎癥小體激活在SAH 后是一種常見現(xiàn)象。NLRP3 炎癥小體參與了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、促炎性因子的釋放、神經(jīng)炎癥、血腦屏障的破壞、微血栓的形成以及神經(jīng)細(xì)胞的焦亡。多類藥物可以抑制NLRP3 炎癥小體激活，改善SAH 患者預(yù)后，但是目前暫無上述藥物對(duì)SAH 后的長(zhǎng)期作用及對(duì)SAH 的不同嚴(yán)重程度收益的研究。NLRP3 炎癥小體可能成為SAH 后的治療靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究其在SAH 后EBI 中的病理機(jī)制、研究開發(fā)其靶向藥物至關(guān)重要，可為改善SAH 后患者預(yù)后開辟新的治療途徑。