環(huán)曲病毒研究進展

郭 煒，崔志軍，于萌萌，魏麗麗★

（1. 內(nèi)蒙古通遼市動物檢疫技術服務中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2. 內(nèi)蒙古赤峰市紅山區(qū)農(nóng)牧水利局，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3. 中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150000）

環(huán)曲病毒（Torovirus）是有包膜的正鏈RNA 病毒，可引起動物和人類腸道、呼吸道甚至全身感染。人類認識環(huán)曲病毒的歷史較為簡短：第一株馬的環(huán)曲病毒（EToV）是于1972年在瑞士從一匹腹瀉的馬死亡前一周的直腸拭子中分離出來。在發(fā)現(xiàn)EToV7年后，研究者在愛荷華州的一個奶牛群中通過電子顯微鏡（EM）在患有嚴重腹瀉的小牛糞便樣本中發(fā)現(xiàn)了形態(tài)相似的顆粒，將其定義為牛環(huán)曲病毒（BToV）。除了已確定的馬和牛的環(huán)曲病毒外，研究者通過EM在不同動物物種中發(fā)現(xiàn)了類環(huán)曲病毒顆粒(TVLP)。環(huán)曲病毒同樣能感染人類和豬，是人畜共患病。本文主要從環(huán)曲病毒的分類、理化特性、地理分布、流行病學、發(fā)病機制及臨床特征進行多方面的闡述。

1 分類地位

環(huán)曲病毒（Toroviruses）是有包膜的正鏈RNA病毒。1992年以來，根據(jù)其基因組和復制方式將環(huán)曲病毒屬列入冠狀病毒科，因此冠狀病毒基因、mRNA 和結構蛋白的命名法也應用于環(huán)曲病毒。然而，由于結構基因缺乏序列同源性，與冠狀病毒缺乏抗原親緣關系，環(huán)曲病毒作為一個單獨屬分類。國際病毒分類委員會(ICTV)目前將環(huán)曲病毒屬分為四類：馬環(huán)曲病毒（Equine torovirus，EToV）、牛環(huán)曲病毒（bovine torovirus，BToV）、豬環(huán)曲病毒（porcine torovirus，PToV）和人類環(huán)曲病毒（human toroviruses，HToV）。

2 病毒粒子特點

環(huán)曲病毒粒子具有一個螺旋對稱的核衣殼，纏繞成一個空心管(直徑23nm，平均長度104nm，周期性4.5nm)。環(huán)曲病毒粒子直徑通常為12～40nm。它們可形成球形或橢圓形或棒狀病毒粒子，其形狀取決于病毒粒子相對電子束的不同方向。環(huán)曲病毒粒子被一個約11nm 厚的包膜包圍，具有突出的鼓形柱（17～24nm）和邊緣較短的尖（8～10nm）。在細胞內(nèi)，環(huán)曲病毒末端為圓形的細長小管，位于受感染的腸細胞的胞質中。

3 環(huán)曲病毒編碼的蛋白質

在EToV 病毒粒子中已鑒定出分子量分別為20、22、37 和80～100kDa 的蛋白。洗滌劑處理后的病毒粒子釋放出22、37 和80～100 kDa 蛋白，這表明它們與包膜蛋白相關。通過表面放射性碘化技術，在純化的BToV 中也鑒定出了20、37、85 和105 kDa 的類似多肽。N 蛋白（167aa）是在病毒粒子中發(fā)現(xiàn)的最豐富的多肽（80%～84%），預測分子量為18.3～19.2 kDa。M糖蛋白（233aa，26.5kDa）是第二豐富的蛋白質（13%），可能與包膜有關。應用計算機分析揭示了一個III 類膜蛋白的特征，它缺乏一個被切割的信號序列，但在N 端包含3個連續(xù)的跨膜α螺旋。M蛋白在細胞膜內(nèi)積累，在出芽過程中的組裝、成熟和核衣殼識別中發(fā)揮作用。異質N- 糖基化S 蛋白（80～100 kDa），編碼一個分子量的載脂蛋白（1581aa），包含典型的I 型膜糖蛋白的典型結構域：一個N 端信號序列，一個假定的C 端跨膜錨點和一個細胞質尾巴。環(huán)曲病毒HE 蛋白（65kDa）是一種具N- 糖基化的蛋白，位于環(huán)曲病毒的包膜中，它有一個N 端信號序列，一個C 端跨膜結構域，幾個N-糖基化位點和一個假定的“FGDS”基序。BToV 和PToV 的HE 蛋白以N- 乙酰-9- 乙酰神經(jīng)氨酸作為第二受體。EToV 病毒粒子缺乏HE 蛋白，僅在ORF4 中擁有部分序列。

4 環(huán)曲病毒的物理特性

EToV 在環(huán)境中非常穩(wěn)定，對磷脂酶C、胰蛋白酶、糜蛋白酶甚至脫氧膽酸鹽具有相對抗性，然而，TritonX100 和有機溶劑可破壞其傳染性。EToV 在廣泛的pH 范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，僅在pH2.5 以下或pH10.3 以上失活。BToV1 似乎不如EToV 和BToV2穩(wěn)定，在-70℃環(huán)境下長時間儲存后，可以觀察到其沉積和密度的變化。據(jù)報道，含有BToV1 的糞便制劑傳染性在3～4 周后完全喪失，而EToV 在無細胞上清液中能夠穩(wěn)定保持92d。純化后BToV2 病毒經(jīng)反復冷凍和解凍循環(huán)后會導致病毒粒子解體。

5 地理分布

研究者利用ELISA、RT-PCR 和免疫電鏡（IEM）方法在奧地利、比利時、巴西、加拿大、哥斯達黎加、法國、德國、英國、匈牙利、日本、韓國、荷蘭、新西蘭、南非、美國等地牛的糞便樣本中檢測到BToV，表明BToV 可能會在世界范圍內(nèi)發(fā)生。序列分析表明，巴西、歐洲和亞洲的BToV 與北美毒株的同源性較高，但與北美毒株的同源性較低。在瑞士進行測試的大多數(shù)成年馬都具有對EToV 的中和抗體。HToV 似乎發(fā)生在巴西、加拿大、法國、英國、印度、荷蘭和美國。研究者在奧地利、比利時、加拿大、中國、匈牙利、意大利、韓國、南非、西班牙、荷蘭和美國等農(nóng)場的豬糞便標本中檢測到PToV。到目前為止，TToV 僅在美國有報道。

6 宿主范圍

研究者在馬、牛、山羊、綿羊、豬、兔子和野生小鼠的血清中發(fā)現(xiàn)了對EToV 的中和抗體，但在人類或食肉動物中沒有發(fā)現(xiàn)。BToV 的宿主范圍似乎僅限于牛。在腹瀉兒童和成人的糞便中觀察到TVL 顆粒，但在添加抗BToV 小牛血清后，它們可以聚集，同時可以使用BToV 抗原捕獲ELISA 進行檢測，并且BToV 抗血清可以抑制大鼠紅細胞的血凝集。這些觀察結果表明，HToV 和BToV 之間存在抗原交叉反應性，表明兩者之間可能存在人畜共患聯(lián)系。

7 抗原特性

除了典型的環(huán)曲病毒形態(tài)外，BToV、EToV、HToV、PToV 具有共同的抗原。目前，只分離出一株EToV。但研究者報道了兩株BToV。其中一株毒株在俄亥俄州一只5月齡腹瀉小牛的糞便中檢測到的，第二株（愛荷華毒株）是從一只2日齡的實驗動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)。基于它們在ELISA、IEM和大鼠/小鼠紅細胞中血凝/血凝抑制（HA/HI）試驗中的交叉反應性，這兩個分離株具有兩種血清型：BToV1，BToV2。ELISA、IEM、HI 和免疫印跡法證實BToV 和HToV之間存在抗原交叉反應，表明兩者關系密切。一些研究者報道，在持續(xù)性腹瀉患者中檢測到的HToV顆粒，其形態(tài)與BToV 相似，可被BToV 抗血清凝集，當使用BToV2 抗血清時，可觀察到更強的反應。因此利用BToV 的高免疫血清特性，可利用ELISA和IEM檢測人類的環(huán)曲病毒。

8 流行病學

幾項流行病學研究表明，BTo 抗體在幾個不同的牛群中具有很高的血清流行率，這表明該病毒可能在這些牛群中頻繁傳播。利用ELISA/RT-PCR 方法，研究者在牛的胃腸炎病例中也檢測到了BToV。這些病例中高達44%的BToV 陽性樣本不含其他主要腸道病原體。4月齡以下的犢牛極易發(fā)生由BToV引起的腹瀉，尤其是3 周齡以下的犢牛。BToV 間歇性釋放可發(fā)生在犢牛出生后的前10個月。在犢牛體內(nèi)循環(huán)的母體BToV 特異性抗體的水平會影響感染的臨床結果。

在荷蘭和西班牙進行的流行病學研究也顯示，成年母豬中PToV 抗體的血清陽性率很高（81%和100%）。新生兒通過初乳的方式從母體獲得抗體使得其血清呈陽性。之后，隨著斷奶年齡增加，其抗體滴度下降到接近或低于ELISA 臨界值。此時，斷奶仔豬感染PToV 后，其抗體效價增加。

據(jù)報道，在一項調查病毒性胃腸炎的研究中，HToV 是主要病原體。特別是在醫(yī)院內(nèi)病毒性胃腸炎調查中，HToV 是最常見的病原體（67%），其次是輪狀病毒占19%，腺病毒為9%，諾如病毒為4.2%，星狀病毒占1.4%。醫(yī)院內(nèi)HToV 感染的兒童（年齡3 歲）明顯高于醫(yī)院內(nèi)輪狀病毒感染的兒童（年齡6個月）。兒童醫(yī)院內(nèi)HToV 感染不受季節(jié)性影響，而輪狀病毒感染在冬季流行。

9 傳播

有研究者認為，BToV 的傳播是通過口/ 鼻途徑，通過直接接觸受污染的糞便或鼻咽部分泌物來完成感染。在實驗條件下，口服接種BToV 可引起腹瀉，病毒在糞便中釋放。鼻途徑是另一種可能的進入途徑，在飼養(yǎng)場犢牛的鼻分泌物中檢測到BToV抗原和病毒RNA。牛冠狀病毒（BCoV）的呼吸道感染發(fā)生在腸道感染之前，表明這一傳播途徑可能在腸道病毒的傳播和發(fā)病機制中具有重要意義。BToV有可能像BCoV 一樣，最初可以在鼻上皮細胞中復制，而在被吞下并感染腸道之前進行擴增。BToV 雙向性假說及其在病毒發(fā)病機制中的作用有待進一步研究。

10 發(fā)病機制及臨床特征

所有BToV 毒株都具有致病性，導致實驗和自然感染的犢牛輕度大量腹瀉。BToV 暴露24～72h后，觀察到初始臨床癥狀（輕度發(fā)熱、抑郁、虛弱和厭食），隨后是黃綠色至亮黃色的水樣腹瀉，持續(xù)3～5d。小?？赡軙霈F(xiàn)嚴重的脫水并死亡。感染24～72h 后，糞便病毒開始釋放，與腹瀉的發(fā)作相一致，并持續(xù)2～6d。在感染后3～4d 達到病毒釋放高峰。與其他腸道病毒的混合感染，如輪狀病毒或星形病毒，會導致比單獨由任何一種病毒引起的更嚴重的水樣腹瀉。腸道菌群正常的乳糜犢牛的腹瀉通常比轉基因犢牛更嚴重。散發(fā)性和復發(fā)性BToV 釋放可持續(xù)4個月。在鼻部樣本中也檢測到了BToV。BToV 在呼吸道中的復制和釋放及其在呼吸病理中的作用有待進一步研究。

EToV 血清轉化發(fā)生在10～12個月大的馬身上，沒有出現(xiàn)癥狀。迄今為止，對馬進行的口腔感染實驗尚未見報道。EToV 在病毒產(chǎn)生高峰后誘導受感染細胞凋亡。這由參與細胞凋亡過程的死亡受體和線粒體途徑介導。EToV 誘導的細胞凋亡可促進病毒在體內(nèi)的傳播，并促進病毒的復制。

多項研究表明，HToV 感染與兒童腹瀉有關。在一項研究中，35%的腸炎兒童在糞便中排出了HToV，但只有14.5%的無癥狀對照組排出了病毒。受感染的兒童出現(xiàn)水樣腹瀉，每天嘔吐3～4次，最后導致出現(xiàn)脫水，既沒有發(fā)燒，也沒有發(fā)現(xiàn)其他腸道病原體。免疫功能低下的兒童似乎更容易感染HToV 而引發(fā)疾病。

11 病理和組織病理學

犢牛BToV 的靶器官是小腸的下半部分和整個大腸，特別是螺旋結腸。通過肉眼幾乎觀察不到感染癥狀。組織學檢查顯示從空腸中部到小腸下部隨機分散的區(qū)域以及大腸壞死的區(qū)域有絨毛萎縮和上皮脫屑。免疫熒光檢測顯示，隱窩細胞和絨毛上皮細胞均含有抗原。結腸黏膜的再吸收能力喪失導致水樣腹瀉與小腸吸收不良。穹頂上皮細胞（M細胞），顯示出與絨毛吸收細胞相同的細胞病變變化。病毒粒子存在于小腸和大腸以及基底和側質膜的腸細胞之間。在固有層的巨噬細胞中，研究者發(fā)現(xiàn)了處于不同降解階段的病毒粒子。在感染后48h，受感染區(qū)域下部絨毛和隱窩的上皮細胞以及穹頂上皮中可檢測到相應抗原。研究者通過熒光檢測發(fā)現(xiàn)細胞質中具有熒光強度（雖然少數(shù)細胞核可能有微弱的染色），通常在腸道中最為明顯，組織損傷最小?？漳c中部首先被感染，感染最終到達大腸，IF 診斷應優(yōu)先對腹瀉發(fā)病后死亡的犢牛的大腸切片進行檢測。

12 預防和控制

目前沒有針對這種病毒的具體的預防措施，然而，一般的衛(wèi)生、生物安全措施和攝入足夠的、保護性的初乳可用于預防BToV 感染。目前尚無消毒或熱滅菌對環(huán)曲病毒影響的報道。