臭氧療法治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用機制研究進展

孫 聞，徐龍河 綜述 劉永哲 審校

臭氧療法是一種無創(chuàng)、無不良反應、低成本治療方法，適當濃度和劑量的臭氧可與脂質(zhì)等相互作用，產(chǎn)生可控的氧化應激作用，從而增加內(nèi)源性抗氧化劑，增強局部血流灌注和氧供，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、營養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)特性[1-3]。近年來，臭氧療法已廣泛應用于許多疾病，如慢性皮膚潰瘍、口腔疾病、感染傷口、缺血性疾病和關(guān)節(jié)問題[4-6]。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，臭氧也表現(xiàn)出了良好的保護效應[7]。本文綜述了臭氧對神經(jīng)系統(tǒng)疾病作用機制的研究進展，旨在為臭氧療法的安全性和有效性提供借鑒和幫助。

1 對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的抗炎作用

1.1 神經(jīng)炎癥 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)在損傷、感染、毒素等各種影響內(nèi)穩(wěn)態(tài)因素的刺激下產(chǎn)生的復雜免疫反應，持續(xù)存在的神經(jīng)炎癥是神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)退行性和精神性疾病的病因和病程的共同特性[8]。以往的研究表明，臭氧可能通過免疫調(diào)節(jié)和激活細胞代謝起到長期持久的抗炎作用，減輕炎癥反應[9]。

有學者證實，臭氧可通過抑制神經(jīng)炎癥治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病[10]?；诖笫舐陨窠?jīng)根炎模型，Wang等[11]發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射臭氧可以緩解機械性異常痛、減弱性神經(jīng)根炎，下調(diào)脊髓腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和IL-6的過表達，增加環(huán)磷酸鳥苷和環(huán)磷酸腺苷的表達。此外，使用濃度為20 μg/ml的臭氧效果優(yōu)于10或30 μg/ml，鞘內(nèi)給予20 μg/ml臭氧可逆轉(zhuǎn)慢性神經(jīng)根炎大鼠脊髓磷酸二酯酶2A和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)/p65 mRNA蛋白表達水平升高的趨勢。因此，臭氧可能是抑制神經(jīng)炎癥有效的治療手段。

通過建立大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebralartery occlusion, MCAO)模型并用臭氧(2 mg/kg)干預發(fā)現(xiàn)，臭氧可顯著提高MCAO大鼠的存活率，降低大鼠腦含水量及神經(jīng)功能評分，控制缺血大鼠的腦梗死[12]。NF-κB在腦缺血時被激活，可導致MCAO大鼠神經(jīng)炎性損傷和神經(jīng)元凋亡，臭氧通過降低Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)、IκB激酶β(IKKβ)、IκB激酶α(IKKα)和NF-κB/P65的表達水平來抑制NF-κB信號通路，研究結(jié)果也提示，臭氧可通過抑制神經(jīng)炎癥來治療腦卒中。

1.2 卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD) 是腦卒中的主要并發(fā)癥之一。研究表明，PSD可能對30%腦卒中患者的恢復產(chǎn)生影響。趙冬鳳等[13]對120例PSD患者實施臭氧自體血治療2周后，試驗組血清超敏C反應蛋白(hypersensitiveC-reactiveprotein，hs-CRP)水平及漢密爾頓抑郁量表(Hamilton depression scale, HAMD)評分均低于對照組，且hs-CRP水平與HAMD評分呈正相關(guān)。隨訪1個月后顯示，試驗組臨床療效優(yōu)于對照組。表明臭氧治療可能通過降低患者hs-CRP水平，改善炎性反應對血管內(nèi)皮的損傷，穩(wěn)定機體的內(nèi)環(huán)境，緩解抑郁癥狀，提示臭氧治療對早期PSD的治療有效。

1.3 多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis,MS) 是一種導致脫髓鞘和軸索損傷的CNS慢性炎癥性自身免疫性疾病，確切的病因尚不清楚[14]。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells, Treg)頻率和功能障礙可導致炎癥和疾病進展，臭氧療法作為一種潛在的治療方法，可調(diào)節(jié)MS患者的免疫系統(tǒng)反應和炎癥反應。Tahmasebi等[15]通過臭氧自血療法治療20例復發(fā)緩解型MS患者，為期6個月。與治療前相比，臭氧治療后患者Treg細胞數(shù)量、叉狀頭/翅膀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)、miRNAs(miR-17和miR-27)、IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)表達水平均顯著升高，顯著降低了患者miR-146a的表達水平。并且臭氧治療提高了MS患者Treg細胞的頻率及其相關(guān)因素。因此，臭氧治療對MS患者有益。此外，Delgado-Roche等[16]通過臭氧直腸吹入治療28例復發(fā)緩解型MS患者，發(fā)現(xiàn)臭氧可減少促炎細胞因子TNF-α和IL-1β水平，增加MS患者單核細胞中蛋白激酶CK2的表達和核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor2, Nrf2)的磷酸化，提示臭氧的抗炎作用可能與Nrf2磷酸化和活化的誘導部分相關(guān)，臭氧療法是MS患者的潛在治療選擇。

2 對神經(jīng)系統(tǒng)的抗氧化應激作用

神經(jīng)系統(tǒng)疾病的致病因素大都涉及到氧化應激，如自由基增多和脂質(zhì)過氧化物的聚集等?；钚匝?reactive oxygen species,ROS)與神經(jīng)元損傷和神經(jīng)傳遞異常有一定關(guān)系[17]。研究表明，臭氧可促進氧化預處理，可通過增強內(nèi)源性抗氧化劑的產(chǎn)生、改善局部血液循環(huán)和調(diào)節(jié)免疫反應來逆轉(zhuǎn)慢性氧化應激[18]。

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是發(fā)生于老年人的CNS變性性疾病，其特征性運動功能障礙是由黑質(zhì)中多巴胺(DA)神經(jīng)元的喪失和紋狀體DA的消耗引起的[19]。在6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)誘導的小鼠PD模型中，鄧兵梅等[20]發(fā)現(xiàn)，連續(xù)直腸吹入5 ml臭氧 15 d，對6-OHDA誘導的大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)腦組織氧化損傷具有保護效應，使黑質(zhì)部位谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性升高，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量降低。提示臭氧可能是一種有效的治療PD的方式。

基于快速眼球運動睡眠剝奪模型，稅云華等[21]使用濃度為30 μg/ml的臭氧與2 ml大鼠尾靜脈血按1∶1混合3～5 min后從尾靜脈輸回體內(nèi)(1次/12 h，共3 d)，干預72 h時發(fā)現(xiàn)，臭氧組大鼠覺醒期減少，慢波睡眠、快波睡眠及血清褪黑素水平增加，且大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平、MDA水平降低，GSH-px水平增高，表明臭氧對于調(diào)節(jié)睡眠剝奪大鼠睡眠時相、降低體內(nèi)氧化應激水平具有積極意義。

Karademir等[22]探討了腹腔注射臭氧聯(lián)合胰島素對糖尿病大鼠顱脊髓神經(jīng)病變的治療作用。大鼠誘導糖尿病后，測定總氧化狀態(tài)(total oxidation state,TOS)和總抗氧化狀態(tài)(total antioxidant state,TAS)，計算氧化應激指數(shù)(oxidative stress index,OSI)，取腦組織和脊髓組織進行組織病理學檢查。結(jié)果顯示，臭氧組、胰島素組及臭氧聯(lián)合胰島素組與對照組相比，TAS較高、TOS和OSI較低、軸突退變和血管充血的病理改變較小。這表明臭氧結(jié)合胰島素可刺激糖尿病神經(jīng)病變的內(nèi)源性抗氧化防御機制，從而預防ROS誘導的損傷，對顱脊髓神經(jīng)病變有保護作用。

3 對神經(jīng)系統(tǒng)的抗細胞凋亡作用

大量研究表明，退行性變疾病與細胞過度凋亡密切相關(guān)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)在細胞凋亡中起關(guān)鍵作用[23-25]。

Cai等[23]通過構(gòu)建神經(jīng)元SH-SY5Y細胞缺血-再灌注損傷(ischemiareperfusion injury,IRI)模型并進行臭氧預處理發(fā)現(xiàn)，臭氧通過增加GSH-Px、SOD、過氧化氫酶(catalase,CAT)和減少MDA來減輕氧化損傷。臭氧降低了SH-SY5Y細胞IRI引起的線粒體損傷，抑制了細胞色素C從線粒體向細胞質(zhì)的釋放，并且通過增加SH-SY5Y細胞中凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax比值和抑制caspase信號通路來減少細胞凋亡。表明臭氧具有維持氧化還原穩(wěn)態(tài)、減輕線粒體損傷、抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用。Wu等[24]建立了化學神經(jīng)根神經(jīng)炎大鼠模型并給予1 mg/(kg·d)臭氧治療。發(fā)現(xiàn)臭氧顯著減少了模型大鼠中自噬體的形成，抑制了神經(jīng)根細胞的自噬。與模型組相比，臭氧顯著降低了自噬標志因子LC3B的水平和裂解的caspase3的表達，緩解了神經(jīng)根細胞的凋亡，抑制了LC3B和自噬相關(guān)基因Beclin1的表達。

臭氧治療對新生大鼠缺氧缺血腦損傷(hypoxia-ischemia brain injury,HIBI)有一定影響。文獻[25]對7日齡雄性Wistar大鼠，隨機分為假手術(shù)組、對照組、臭氧處理組(分為低劑量組1 mg/kg和高劑量組2 mg/kg)。除假手術(shù)組外，其余大鼠均置于缺氧室中，結(jié)果表明臭氧治療組大鼠右半球凋亡神經(jīng)元數(shù)明顯少于對照組，且臭氧高劑量組凋亡神經(jīng)元數(shù)更少。臭氧高劑量組Morris水迷宮試驗結(jié)果與假手術(shù)組相似。研究結(jié)果提示，臭氧治療可以降低HIBI新生兒大鼠的神經(jīng)元凋亡，改善了認知功能，表明臭氧可以通過抑制細胞凋亡來延緩神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進展。

4 保護神經(jīng)及促進神經(jīng)再生作用

4.1 肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS) 是一種無法治愈的致命神經(jīng)退行性疾病，其中進行性運動神經(jīng)元丟失和炎癥反應是主要的病理學標志[26]。目前用于研究ALS的動物模型，技術(shù)最成熟、應用最廣泛的是銅鋅超氧化物歧化酶-甘氨酸93丙氨酸(copper zinc superoxide dismutase 1-glycine to alanine mutation at position 93，SOD1-G93A)轉(zhuǎn)基因小鼠模型。Bette等[27]建立SOD1-G93A小鼠模型，研究了為期5d的臭氧腹腔注射治療方案的治療潛力。對SOD1-G93A小鼠的臨床評估顯示，在終末期SOD1-G93A小鼠的腦干中，臭氧治療可減慢神經(jīng)退行性變，使三叉神經(jīng)運動核中與SOD1相關(guān)的空泡化減少。此外，腦干中的小膠質(zhì)細胞增殖不明顯，而星形膠質(zhì)細胞的肥大基本上沒有受到影響。在SOD1-G93A小鼠出生后第60天，血液、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中的單核細胞數(shù)量減少。并且臭氧還可以減少疾病晚期SOD1-G93A小鼠的腸系膜淋巴結(jié)中的單核細胞數(shù)量?？偟膩碚f，該研究揭示了臭氧作為治療劑應用于ALS小鼠時，具有選擇性的神經(jīng)保護和可能的抗炎能力以及潛在的治療能力。

4.2 神經(jīng)干細胞(neural stem cells, NSCs) 臭氧在體外對NSCs也可產(chǎn)生影響。Costanzo等[28]研究了輕度臭氧化對人脂肪源成體干細胞(human adipose tissue derived adult stem cells,hADAS)的影響，通過組織化學、形態(tài)計量學和超微結(jié)構(gòu)分析，表明低濃度臭氧可誘導hADAS細胞中的脂質(zhì)生成，且不會產(chǎn)生有害影響，為未來闡明輕度臭氧化對脂肪組織的影響以實現(xiàn)組織再生和組織工程的研究鋪平了道路。Tricarico等[29]為深入了解臭氧對NSCs的作用機制，測試了臭氧對神經(jīng)外胚層細胞(神經(jīng)元前體和分化神經(jīng)元)的影響，量化它們的增殖、遷移、細胞因子釋放和細胞存活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臭氧會顯著影響細胞因子的釋放、細胞遷移的距離并導致細胞增殖的輕微變化，且低濃度臭氧增加細胞遷移的距離，為進一步研究臭氧在神經(jīng)系統(tǒng)再生中的應用奠定了堅實的基礎(chǔ)。

總之，由于臭氧具有安全有效、價格低廉、操作簡便、感染等并發(fā)癥少和適用范圍廣等優(yōu)點，近年來臭氧在國內(nèi)外的研究和應用越來越廣，大量的實驗室研究提供了臭氧抗炎、抗氧化能力，以及血管、血液和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的證據(jù)[30, 31]。已有研究發(fā)現(xiàn)，臭氧對神經(jīng)系統(tǒng)疾病起到治療作用，但其機制尚未明確，仍需進行更深入地研究，擴大臨床應用范圍。