PD-1/PD-L1通路在自身免疫性眼病中作用的研究進展

楊辰玲，周慧芳

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院眼科，上海市眼眶病眼腫瘤重點實驗室，上海 200011

自身免疫性眼病是一組機體對自身抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致眼表、眼內(nèi)及眼眶周圍組織受到損害的疾病，主要包括自身免疫性葡萄膜炎（autoimmune uveitis）、 甲狀腺相關(guān)眼?。╰hyroid-associated ophthalmopathy）、干燥綜合征（Sj?gren's syndrome）、視神經(jīng)脊髓炎譜系障礙（neuromyelitis optica spectrum disorder）、免疫性角膜炎等。它們的發(fā)病機制雖不盡相同，但均體現(xiàn)為機體免疫耐受的破壞和免疫穩(wěn)態(tài)的失衡。在自身免疫反應(yīng)中，T 細胞起到重要作用。雖然人體的中樞耐受機制消除了大多數(shù)自身反應(yīng)性T細胞，但仍有小部分針對自身抗原的特異性T細胞逃逸到外周環(huán)境中［1］。機體為了抑制自身免疫的發(fā)生，多種調(diào)節(jié)機制參與其中，包括克隆無能、克隆缺失以及調(diào)節(jié)性T細胞的抑制作用［2］。

在特異性細胞免疫中，T 細胞激活需要雙信號［3］。第一信號由抗原肽/主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC） 與T 細胞受體（T cell receptor，TCR）的相互作用形成，賦予T 細胞免疫應(yīng)答特異性，同時也進行抗原識別。第二信號是獨立于抗原的“共刺激信號”，通過抗原提呈細胞上表達的共刺激分子與T細胞上的相應(yīng)受體結(jié)合進行傳遞［4］。已知的共刺激分子包括CD28、細胞毒性T 淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyteassociated antigen-4，CTLA-4）、誘導(dǎo)性共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）、程序性死亡蛋白-1（programmed death 1，PD-1）等［5］。共刺激信號不僅可以提供促進T細胞活化的第二信號，還能夠提供抑制T 細胞應(yīng)答的信號，直接或間接地介導(dǎo)T 細胞耐受，從而防止自身免疫反應(yīng)的發(fā)生［6］。其中，PD-1及其配體程序性死亡蛋白配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）作為負調(diào)控共刺激分子，在參與免疫調(diào)節(jié)、調(diào)控T細胞免疫應(yīng)答和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。2002 年，中國陳列平教授指出大多數(shù)腫瘤細胞通過PD-1通路實現(xiàn)免疫逃逸［7］。自此，研究者開始重視該領(lǐng)域并研究相關(guān)腫瘤治療藥物［8］。近年來的研究［9］表明，PD-1/PD-L1 通路的失活導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、1 型糖尿病、多發(fā)性硬化等。2005 年，干燥綜合征的研究發(fā)現(xiàn)PD-1 與其具有相關(guān)性［10］；此后，在其他自身免疫性眼病中也有類似發(fā)現(xiàn)。本文將對PD-1/PD-L1 通路及其在自身免疫性眼病中的研究進展作一綜述。

1 PD-1/PD-L1/2信號的生物學(xué)效應(yīng)

1.1 PD-1及其配體PD-L1/2

PD-1即CD279，是一種由288個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，為CD28 家族成員，相對分子質(zhì)量為55 000；由胞內(nèi)胞外兩部分組成，胞外段為一個IgV樣結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)段存在免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM） 以及免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序（immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM）。PD-1 可以在T 細胞、B 細胞、自然殺傷性T 細胞、活化的單核細胞和樹突狀細胞（dendritic cell，DC）上表達。PD-1 在靜止的T 細胞上不表達，但在激活后可誘導(dǎo)表達［11］。

PD-L1（又稱B7-H1 或CD274）和PD-L2（又稱B7-DC 或CD273）作為PD-1 的2 種配體，同為B7 家族成員，均為典型的由免疫球蛋白恒定區(qū)和可變區(qū)組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白結(jié)構(gòu)［12］。PD-L1 在多種細胞中廣泛表達。在免疫細胞中，B 細胞、DC、巨噬細胞、骨髓衍生的肥大細胞和T 細胞上均普遍存在PD-L1的表達，并可在細胞被激活后進一步上調(diào)。同時，PDL1 也可以在多種非免疫細胞中表達，包括血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞等，這些細胞均可成為自身免疫性眼病的靶細胞。與PD-L1 相比，PD-L2 僅在較少的細胞類型中表達，如活化的DC、巨噬細胞、骨髓來源的肥大細胞和記憶性B 細胞，且表達水平較低［6］。

PD-L1和PD-L2對PD-1的親和力不同，PD-L2對PD-1 的親和力為PD-L1 的3 倍。由于結(jié)合位點重疊，已有研究［13］為B7/CD28 家族的免疫調(diào)節(jié)功能增加了新的調(diào)節(jié)途徑，即B7-1 和PD-L1 之間可以結(jié)合產(chǎn)生雙向抑制作用，能夠抑制T細胞的活化和細胞因子的產(chǎn)生。

1.2 PD-1信號通路的生物學(xué)效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)機制

PD-1/PD-L1通路可以調(diào)節(jié)免疫能力，有效維持T細胞活化，實現(xiàn)免疫耐受和組織損傷之間的平衡，預(yù)防自身免疫反應(yīng)和慢性感染的發(fā)生［6］。但是，該通路也可以被腫瘤細胞利用，腫瘤細胞上的PD-L1 與T細胞表面的PD-1 結(jié)合后，可以抑制T 細胞激活和增殖，誘導(dǎo)T細胞的凋亡，使腫瘤可以逃避機體的免疫攻擊，在機體內(nèi)存活、增殖［14］。

T 細胞功能的發(fā)揮依賴于細胞因子的產(chǎn)生，PD-1表達水平的改變可以通過共刺激途徑調(diào)控T 細胞功能。PD-1 低表達會抑制γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的產(chǎn)生，同時降低細胞毒性；PD-1極低表達則會抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素2（interleukin 2，IL-2） 的產(chǎn)生，同時抑制T 細胞增殖。此外，PD-L1 也可影響T 細胞功能。FRANCISCO 等［15］提出PD-L1可以誘導(dǎo)初始CD4+T 細胞轉(zhuǎn)化為誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T細胞（induced regulatory T cell，iTreg），iTreg 的免疫調(diào)節(jié)功能是抑制效應(yīng)T 細胞產(chǎn)生外周耐受的關(guān)鍵。

探究PD-1 通路抑制自身免疫性疾病的機制是近年來的研究熱點。PD-1 通過招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2［9］，抑制TCR 近端酶的激活及下游事件啟動，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB 或PI3K/AKT）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是其中最經(jīng)典的2 條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。蛋白磷酸酶和張力蛋白同系物（protein phosphatase and tensin homolog，PTEN）是一種細胞磷酸酶，PD-1活化可使PTEN 的活性增強，進一步抑制PI3K/AKT信號通路的激活［16］。此外，PD-1 阻斷PI3K/AKT 通路會抑制細胞抗凋亡基因BCL-XL（B-cell lymphoma/leukemia-x long），引起IL-2 的生成減少，進一步誘導(dǎo)CD8+T 細胞和CD4+T 細胞無能。MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是PD-1/PD-L1 通路介導(dǎo)抑制作用的另一個關(guān)鍵信號靶點，參與細胞外信號向細胞內(nèi)應(yīng)答的轉(zhuǎn)換，并通過磷酸化激活來調(diào)控細胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移和死亡。c-Jun 氨基端激酶（c-Jun amino-terminal kinase，c-Jun）、p38 MAPK 和胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）是參與MAPK 通路的3 條平行通路分子［17］。PD-1 與PD-L1的相互作用可以通過促進ERK 磷酸化，激活酪氨酸激酶，以自分泌或旁分泌形式持續(xù)產(chǎn)生活化配體，引起Ras 突變和B-Raf 突變，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生以及腫瘤耐藥性的產(chǎn)生［18-19］。STUTVOET 等［20］也發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1 軸與MAPK 通路存在關(guān)聯(lián)，抑制MAPK通路可抑制肺腺癌細胞中表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和IFN-γ 誘導(dǎo)的PD-L1mRNA和蛋白的上調(diào)。

此外，PD-1 介導(dǎo)的抑制信號取決于TCR 信號的強度，低水平的TCR 刺激下會產(chǎn)生更大的抑制作用，CD28 或IL-2 的共同刺激則可以減弱PD-1 的抑制作用［21-22］。CD28 和IL-2 都通過影響細胞抗凋亡作用、細胞周期和細胞因子基因來促進T 細胞擴增。

2 PD-1與自身免疫性眼病

2.1 自身免疫性葡萄膜炎

葡萄膜炎可按病因?qū)W分為感染性葡萄膜炎和非感染性葡萄膜炎，其中后者主要與自身免疫反應(yīng)有關(guān)，包括自身免疫性葡萄膜炎、特發(fā)性葡萄膜炎、風(fēng)濕性疾病伴發(fā)的葡萄膜炎、創(chuàng)傷繼發(fā)性葡萄膜炎和偽裝綜合征等［23］。自身免疫性葡萄膜炎的病變部位廣泛，嚴重時可致盲，主要發(fā)病機制是由于包括Th1 和Th17 在內(nèi)的T 細胞亞群失調(diào)和功能障礙［24-25］。致病性Th17 細胞為CD4+T 細胞中一個亞型［26］，研究［27］發(fā)現(xiàn)其與自身免疫性葡萄膜炎發(fā)病相關(guān)：致病性Th17 細胞分泌的IL-17 可能引起視網(wǎng)膜色素上皮細胞功能障礙，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。

在自身免疫性葡萄膜炎患者中，外周血淋巴細胞中PD-1、PD-L1及PD-L2的mRNA 表達降低，活動期患者降低幅度更大［28］。對實驗性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）小鼠模型的研究［29］發(fā)現(xiàn)，PD-1 在正常和EAU 小鼠的視網(wǎng)膜中均表達，而在炎癥活動期，PD-L1 和PD-L2 在眼部浸潤的炎癥細胞、血管和視網(wǎng)膜中表達明顯降低。LEE等［30］發(fā)現(xiàn)抑制自身免疫反應(yīng)可以使EAU炎癥好轉(zhuǎn)，PD-1 及其配體在眼部的高表達與EAU 由活動期向靜止期轉(zhuǎn)變有關(guān)：Treg被共刺激分子和細胞因子刺激分化為iTreg，iTreg 通過上調(diào)PD-1 和PD-L1 的表達抑制T 細胞的自身免疫反應(yīng)，隨后導(dǎo)致效應(yīng)T 細胞的IFN-γ 產(chǎn)量減少，轉(zhuǎn)化生長因子-β 分泌增多，最終使EAU疾病進程中止。

除基礎(chǔ)研究外，在近幾年臨床癌癥免疫療法的相關(guān)報道中，PD-1 抑制劑針對癌細胞的T 細胞反應(yīng)導(dǎo)致的自身免疫性并發(fā)癥時有發(fā)生，進一步表明PD-1通路的失效可能與自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。自2014年9月美國食品藥品監(jiān)督管理局批準使用PD-1 抑制劑帕博利珠單抗（pembrolizumab）以來，有多個研究［31-33］表明葡萄膜炎是PD-1 抑制劑的不良反應(yīng)之一。

2.2 甲狀腺相關(guān)眼病

甲狀腺相關(guān)眼病是一種自身免疫性眼眶病，涉及多系統(tǒng)損害，與甲狀腺疾病密切相關(guān)，發(fā)病率在成年人眼眶疾病中居第一位［34］。此前研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病包括以下機制：機體對自身促甲狀腺激素受體（thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR）的耐受遭到破壞，抗原提呈細胞及B 細胞對TSHR 表位進行識別，初始Th 細胞被TSHR 肽段激活，分化為不同的亞群，即產(chǎn)生IFN-γ 的Th1 細胞、產(chǎn)生IL-4 的Th2 細胞和產(chǎn)生IL-17A 的Th17 細胞。外周血CD34+纖維細胞浸潤眼眶結(jié)締組織，轉(zhuǎn)化為CD34+成纖維細胞，產(chǎn)生趨化因子募集Th1和Th17細胞。Th 細胞產(chǎn)生的細胞因子與漿細胞產(chǎn)生的自身抗體共同作用于眼眶成纖維細胞，從而加劇眼眶炎癥［35］。

研究證實甲狀腺相關(guān)眼病患者外周血CD4+、CD8+T細胞表面PD-1表達率較對照組下降，活動期及中重度患者經(jīng)糖皮質(zhì)激素沖擊治療后外周血CD4+、CD8+T細胞表面PD-1表達上調(diào)，可能是通過抑制該疾病的自身免疫反應(yīng)發(fā)揮作用［36］。Treg即CD4+CD25+T細胞［37］，占外周血CD4+T 細胞的5%～10%，Treg 功能障礙已被證明是多種自身免疫性疾病發(fā)病的重要危險因素［38］。作為T 細胞激活負調(diào)控的免疫檢查點，CTLA-4 在Treg 上表達［39］。而且，重度甲狀腺相關(guān)眼病患者眼眶組織及外周血CTLA-4 表達低于輕度患者，推測CTLA-4 參與甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)生發(fā)展［40］。SAGIV 等［41］描述了3 例接受免疫檢查點抑制劑治療的癌癥患者，均在接受CTLA-4 抑制劑和PD-1 抑制劑的組合治療后出現(xiàn)甲狀腺相關(guān)眼病樣眼眶病變。CTLA-4 與PD-1 同為T 細胞負調(diào)控共刺激分子，因結(jié)合位點重疊，兩者間存在相互抑制作用，該抑制作用可能導(dǎo)致Treg 無法活化，具體機制尚不明確［13］。上述研究均提示阻斷PD-1/PD-L1 通路可能導(dǎo)致甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)生及發(fā)展。

2.3 干燥綜合征相關(guān)型干眼癥

干燥綜合征作為一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以免疫細胞浸潤并破壞各外分泌腺體為主要特征。當該疾病累及眼部時，表現(xiàn)為干眼癥，患者以畏光、眼干等不適為主，為干燥綜合征相關(guān)型干眼癥［42］。其發(fā)病機制尚不明確，且無統(tǒng)一診斷及治療標準。

KOBAYASHI 等［10］研究表明干燥綜合征的發(fā)生可能與PD-1/PD-L1 通路功能障礙有關(guān)。其研究發(fā)現(xiàn)干燥綜合征患者唾液中淋巴細胞數(shù)量明顯高于健康對照組，淋巴細胞中PD-1 的表達水平明顯高于健康對照組；同時，PD-L1在患者的唾液腺導(dǎo)管和腺泡上皮細胞中高表達，但在正常唾液腺中不表達；相較于無淋巴細胞浸潤的唾液腺，PD-L1在有淋巴細胞浸潤的唾液腺中表達更高。另有研究［43］表明，PD-1/PD-L1作為抑制性共刺激分子，在干燥綜合征患者中作為保護性分子繼發(fā)性增多，并與疾病損害程度及預(yù)后相關(guān)；PD-L1 的表達水平與炎癥嚴重程度呈負相關(guān)，PD-L2 則與炎癥嚴重程度無明顯相關(guān)性。提示PD-1/PD-L1通路可能在干燥綜合征的免疫病理損害中起保護作用：淋巴細胞持續(xù)大量的局部浸潤，過度活化的T 細胞導(dǎo)致PD-1 及其配體繼發(fā)性上升，PD-1/PD-L1發(fā)揮免疫負調(diào)控，限制自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。

2.4 視神經(jīng)脊髓炎譜系障礙

視神經(jīng)脊髓炎譜系障礙是由自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病。該疾病以視神經(jīng)與脊髓同時或相繼受累為臨床特征，是急性或亞急性起病的致盲性疾病。特異性水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4）抗體（AQP4-IgG）為該病的免疫標志物，研究發(fā)現(xiàn)其由CD19+CD27hiCD38hiCD180-表型的B 細胞亞群產(chǎn)生；IL-6在視神經(jīng)脊髓炎譜系障礙患者中表達升高，可提高該B 細胞亞群的存活率以及其AQP4-IgG 的分泌［44］。在動物模型中進一步發(fā)現(xiàn)：通過共刺激分子（例如CD80 和CD40）和細胞因子（例如IL-6 和IL-17）的協(xié)同作用，T 細胞分化為AQP4 特異性T 細胞，其可導(dǎo)致血-腦脊液屏障的破壞，使AQP4-IgG 和其他的免疫因子進入AQP4 高表達的區(qū)域，從而引起炎癥反應(yīng)［45］。

研究［46］發(fā)現(xiàn)，PD-1 和PD-L1 的可溶性形式（sPD-1 和sPD-L1）可能對PD-1/PD-L1 通路有抑制作用：視神經(jīng)脊髓炎譜系障礙患者早期外周血中，CD4+T細胞表面PD-1，CD19+B淋巴細胞和CD14+單核細胞表面配體PD-L1的表達水平較正常對照組明顯升高，且患者外周血中sPD-1 和sPD-L1 水平明顯高于對照組。另一研究［47］也證實，sPD-1 和sPD-L1 可通過抑制PD-1/PD-L1 通路增強T 細胞活性。故該抑制作用可能在一定程度上干擾了細胞膜上的PD-1/PD-L1負信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，破壞免疫調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)［48］。

3 PD-1/PD-L1 在自身免疫性眼病治療中的臨床應(yīng)用展望

PD-1/PD-L1 通路在自身免疫調(diào)節(jié)、腫瘤免疫及慢性病毒感染中均起著重要的作用，是自身免疫性疾病和腫瘤的潛在藥物治療靶點。在自身免疫性眼病領(lǐng)域，未來或可能進一步通過對PD-1 這一靶點的深入研究，實現(xiàn)精準診斷與靶向治療。

在評估疾病活動性方面，有研究［49］發(fā)現(xiàn)，在1型糖尿病的緩解期患者中，外周血CD4+和CD8+T 細胞中的PD-1 和PD-L1 表達較活動期有所上調(diào)。盡管具體機制尚不清楚，但這些結(jié)果提示：PD-1+和PDL1+在各亞型的T 細胞中表達的變化可能與緩解期患者自身免疫反應(yīng)的減弱有關(guān)。該現(xiàn)象在自身免疫性葡萄膜炎患者和甲狀腺相關(guān)眼病患者的外周血中也同樣存在［28-29，36］。因此，有望將PD-1 或PD-L1 作為一種生物標志物，聯(lián)合其他在緩解期階段表達發(fā)生變化的潛在靶標，通過免疫學(xué)指標定量對患者疾病分期做出精準判斷，為自身免疫性疾病提供新的有效診療策略。

靶向治療方面，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中已證實：PD-1與PD-L1在合適濃度下可抑制滑膜及滑膜液中的T細胞增殖，而PD-1在模型小鼠滑膜T淋巴細胞中的表達異常增強，使得自身免疫反應(yīng)進展；通過腹膜內(nèi)注射PD-L1融合蛋白結(jié)合異常升高的PD-1，可使小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎的嚴重程度降低。PD-L1融合蛋白通過結(jié)合PD-1 傳遞抑制信號，能夠抑制T 細胞的增殖，降低炎癥細胞因子IFN-γ和IL-17A水平，最終通過調(diào)節(jié)Th1/Th17 途徑有效控制疾病的發(fā)展。因此，有望將注射PD-L1 融合蛋白作為一種新的治療手段，降低炎癥細胞因子，抑制自身免疫反應(yīng)，從而緩解疾?。?0］。

4 結(jié)語

自身免疫性眼病的病程較長，嚴重時可致盲，嚴重影響患者的生存質(zhì)量，且現(xiàn)有治療手段效果不理想，因此對單抗及免疫抑制劑的研究具有重要價值。PD-1/PD-L1 信號通路作為T 細胞激活、誘導(dǎo)及維持免疫耐受的關(guān)鍵調(diào)控因子，已被證明其在自身免疫反應(yīng)、腫瘤免疫、移植免疫、感染免疫等多個方面均發(fā)揮著重要作用。PD-1/PD-L1通路的免疫調(diào)節(jié)機制及其在自身免疫性眼病中的作用表明，未來靶向治療自身免疫性眼病具有巨大的潛力，有待進一步探索研究。