非洲豬瘟疫苗研究進(jìn)展

李運(yùn)娜，王 冠，賈 皓，戴曉光，蘇勝杰，王旭紅

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的急性傳染病。ASFV是非洲豬瘟病毒科的唯一成員，可使不同年齡的家豬和野豬感染。世界動物衛(wèi)生組織將ASF規(guī)定為法定報告的疫病，該病不是人畜共患病，對公共衛(wèi)生安全的影響較小，但給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

ASFV是一種DNA蟲媒病毒，可以通過直接接觸或者軟蜱傳播。ASFV基因組長達(dá)190 kb，病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，5個病毒結(jié)構(gòu)層分布200多種蛋白，包括50多種結(jié)構(gòu)蛋白，150多種非結(jié)構(gòu)蛋白。由于其病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，變異度高，具有免疫逃避機(jī)制，給疫苗的研發(fā)帶來一定困難［1-3］。ASFV可在豬群中快速流行和傳播。此外，該病毒在環(huán)境中的穩(wěn)定性較高，可存活數(shù)月甚至數(shù)年。這都給疫病的控制帶來了重大的挑戰(zhàn)。有效控制ASF疫情擴(kuò)散、研制安全有效的疫苗是當(dāng)前面臨的最大挑戰(zhàn)，該文對ASF疫苗的研究情況進(jìn)行論述。

1 滅活疫苗

滅活疫苗是經(jīng)物理或者化學(xué)方法處理，消除ASFV致病性保留其抗原性的安全疫苗。由于滅活疫苗的技術(shù)路線相對成熟，最早應(yīng)用在ASF疫苗的研制上，但該疫苗并不能提供有效的保護(hù)性［4-5］。Blome等［6］將免疫佐劑PolygenTM或EmulsigenR-D（這些佐劑不僅能刺激體液免疫反應(yīng)，還能刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)［7-8］）加入ASF滅活疫苗，再次評估其保護(hù)性。利用添加佐劑的ASF滅活疫苗免疫豬，6周后用同源強(qiáng)毒ASFV攻擊免疫豬，雖然所有的免疫豬都產(chǎn)生了特異性抗體（可能該抗體并不具備中和活性），但均表現(xiàn)急性經(jīng)過，疫苗并不具備保護(hù)作用。該研究表明即使加入免疫佐劑，滅活疫苗對ASFV的感染仍然無有效的保護(hù)作用。

2 減毒活疫苗

研究認(rèn)為減毒活疫苗是最有希望用于預(yù)防ASF的疫苗，目前主要研究的有天然弱毒株疫苗、基因缺失弱毒株疫苗以及傳代培養(yǎng)弱毒株疫苗。減毒活疫苗能誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答，對免疫動物能夠提供較高水平的保護(hù)。

2.1 天然弱毒株疫苗

有研究表明，接種OURT88/3［9］、NH/P68［10］或者Lv17/WB/Rie1［11］后，免疫豬對同型強(qiáng)毒的攻擊有較強(qiáng)的保護(hù)作用，其中OURT88/3致弱毒株經(jīng)鼻內(nèi)免疫保護(hù)率高達(dá)100%，免疫豬僅表現(xiàn)輕微短暫的臨床癥狀；NH/P68致弱毒株，對于同源毒株（Lisbon60）或者異源毒株（Armenia07）的攻擊，提供了100%的保護(hù)，但在免疫豬中有著明顯的副作用；Lv17/WB/Rie1減毒株口服免疫野豬，對于強(qiáng)毒株的攻擊保護(hù)率可達(dá)到92%，免疫野豬沒有表現(xiàn)出任何臨床癥狀。雖然該疫苗對同型強(qiáng)毒株有高水平的保護(hù)作用，但該疫苗生產(chǎn)困難，且安全性令人擔(dān)憂，可產(chǎn)生高熱、肺炎、運(yùn)動障礙、母豬流產(chǎn)等副作用。

2.2 基因缺失弱毒株疫苗

通過基因敲除技術(shù)獲得的基因缺失毒株，不但毒力減弱而且能夠抵抗同源毒株的攻擊［12］。目前，研究主要集中在刪除免疫逃避基因或與病毒復(fù)制有關(guān)的基因。

對于ASF弱毒株，之前的研究已經(jīng)表明，從不同的毒株里刪除同一基因會有不同的結(jié)果，例如：從BA71病毒株中刪除編碼CD2v蛋白的EP402R基因，則病毒致病性減弱的同時會引起保護(hù)性反應(yīng)；而從Georgia/2010株刪除同一基因，病毒的毒力并未減弱［13-14］。從Georgia07株同時刪除9GL和UK基因，對于同毒株的攻擊提供100%的保護(hù)，而且疫苗的安全性比單獨(dú)刪除9GL基因更高。這可能是因?yàn)樘囟ɑ虮粍h除后功能得到了平衡［15］，因此，在研發(fā)ASF基因缺失弱毒株疫苗時，為了減弱毒力，減少副作用，提高保護(hù)性，要考慮不同的毒株刪除的基因不同或者對同一毒株同時刪除幾個基因。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所構(gòu)建的ASF基因缺失弱毒株HLJ/18-7GD，缺失7個基因，在SPF豬、商品豬和懷孕母豬體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)后毒力被減弱，不能轉(zhuǎn)為強(qiáng)毒株。當(dāng)豬只被致命的ASFV攻擊時，該弱毒株（HLJ/18-7GD）為豬提供了完全保護(hù)。該疫苗具有較好的保護(hù)性和安全性，有望在控制ASFV傳播方面發(fā)揮重要作用［16］。

2.3 傳代培養(yǎng)弱毒株疫苗

ASFV在細(xì)胞內(nèi)傳代培養(yǎng)后，致病性大大減弱，這為ASF疫苗的成功研制帶來了新的希望。ASFV經(jīng)Vero細(xì)胞傳代培養(yǎng)后致病性逐漸減弱，但抗原性和穩(wěn)定性也發(fā)生了改變，經(jīng)多次傳代培養(yǎng)的毒株免疫豬后，并沒有產(chǎn)生有效的抗體。但實(shí)驗(yàn)室研制的ASFV弱毒株（血清Ⅰ型：LK-111株、Katanga-350株；血清Ⅱ型：KK-202株；血清Ⅲ型：MK-200株；血清Ⅳ型：FK-32/135株；血清Ⅴ型：TSP-80/300株；血清Ⅵ型：TS-7/230株；血清Ⅶ型：UK-50株；血清Ⅷ型：RK-30株）經(jīng)豬骨髓細(xì)胞傳代培養(yǎng)后接種豬，對強(qiáng)毒株的攻擊可以提供有效的保護(hù)［17］。

ASFV傳代培養(yǎng)弱毒株是未來有望推向市場的候選方向之一，俄羅斯研制的傳代細(xì)胞適應(yīng)株（Arriah CV-1株）被歐盟作為未來重點(diǎn)研究的候選株［18］。

3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是最安全的特異性抗原疫苗。研究表明，ASFV結(jié)構(gòu)蛋白基因p30、p54、p72、pp62和膜蛋白基因CD2v具有良好的抗原性，能夠參與病毒感染的多個階段，構(gòu)建的亞單位疫苗能夠促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但對于強(qiáng)毒株的攻擊保護(hù)作用較弱。

p54和p30結(jié)構(gòu)蛋白分別參與病毒的吸附和內(nèi)吞作用，兩者能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體。用p54或p30抗原免疫豬并不能產(chǎn)生保護(hù)作用；用p54和p30抗原同時免疫豬可以延遲臨床癥狀的出現(xiàn)，6頭免疫豬中的3頭免受E75毒株的攻擊；桿狀病毒表達(dá)的p54、p30融合蛋白免疫豬，對于E75毒株的攻擊可產(chǎn)生保護(hù)性作用［19］；該病毒表達(dá)的p54、p30、p72蛋白免疫豬雖然可以使機(jī)體產(chǎn)生抗體，但對于Pr4株不能提供保護(hù)作用［20］。

ASFV粒子的復(fù)雜性和細(xì)胞內(nèi)外兩種感染形式導(dǎo)致難以產(chǎn)生有效的病毒中和抗體。也許識別抗原的中和表位與非中和表位有利于設(shè)計(jì)更有針對性的免疫反應(yīng)提高疫苗的保護(hù)性。

4 DNA疫苗

研究表明，ASFDNA疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的CTL免疫反應(yīng)，具有良好的開發(fā)潛力。

ASFDNA疫苗在大動物體內(nèi)具有較差的免疫原性，將編碼ASFV的2個基因（pCMV-PQ）的DNA疫苗免疫豬，實(shí)驗(yàn)豬并未產(chǎn)生免疫反應(yīng)，該DNA疫苗卻能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)。將該DNA疫苗融合編碼ASF白細(xì)胞抗原2的基因片段，可以增強(qiáng)豬的免疫反應(yīng)，但對于強(qiáng)毒株的攻擊仍不能提供保護(hù)作用［21］。

將重組蛋白pCD2-E、重組質(zhì)粒pcDNA312R共同免疫豬后，在體內(nèi)可刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ，但對于強(qiáng)毒株Arm07的攻擊并無保護(hù)作用［22-23］。將編碼ASFV胞外區(qū)HA與p54、p30的基因片段構(gòu)建DNA疫苗，雖然增強(qiáng)了豬的體液和細(xì)胞應(yīng)答，但沒有保護(hù)能力［24］。將泛素基因和p54、p30基因共同免疫豬后，可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，即使沒有特異性抗體存在也能提供部分保護(hù)，說明DNA疫苗可通過修飾攜帶的抗原增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答［25-26］。也有研究表明，NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在ASFV攻擊時起到了重要的保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究可以考慮在抗體介導(dǎo)的保護(hù)反應(yīng)和細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)反應(yīng)中建立一種關(guān)聯(lián)。

5 病毒活載體疫苗

用腺病毒、偽狂犬病病毒、牛痘病毒或者新城疫病毒作為載體構(gòu)建的疫苗，可以更好地刺激細(xì)胞免疫和CTL效應(yīng)［27-29］，但其免疫保護(hù)效力需要進(jìn)一步評價。

Chen等［30］通過反向遺傳學(xué)構(gòu)建并表達(dá)了ASFV p72蛋白的重組新城疫病毒，并在小鼠模型中評估其體液和細(xì)胞免疫原性。用rNDV p72免疫小鼠時產(chǎn)生了高滴度的特異性的IgG抗體，并誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分泌干擾素-γ、白細(xì)胞介素-4，該疫苗對豬的保護(hù)作用有待進(jìn)一步研究。以腺病毒為載體表達(dá)的多種抗原（p32、p54、p72、pp62）免疫野豬后，誘導(dǎo)強(qiáng)烈的IgGs、IFN-γ、CTL反應(yīng)，但對于ASFV-Georgia2007/1株的鼻內(nèi)攻擊，并不提供保護(hù)作用［31］。

6 小結(jié)與展望

研究人員雖然在ASF疫苗的研發(fā)上付出了很大的努力，但在上市之前仍然有很多問題需要解決。ASF滅活疫苗已被證明是無效的［4-5］。開發(fā)有效的亞單位疫苗需要尋找特定的保護(hù)性病毒抗原，以及合適的抗原傳遞系統(tǒng)免疫動物。減毒活疫苗雖然可以引起強(qiáng)而持久的免疫反應(yīng)，但該疫苗的安全性亟待解決，包括它的副作用（皮膚損傷、關(guān)節(jié)腫脹等）和在農(nóng)場傳播的可能性；減毒活疫苗的另一個問題是缺乏穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系，因?yàn)锳SFV優(yōu)先在原代單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中復(fù)制。與亞單位疫苗、減毒活疫苗相比，DNA疫苗具有副作用少安全性高的優(yōu)點(diǎn)，但具有較差的免疫原性，雖然能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)但不能提供免疫保護(hù)作用。

目前，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所構(gòu)建的ASF弱毒疫苗（HLJ/18-7GD株）遺傳穩(wěn)定，接種后對育肥豬無不良影響，對田間商品豬保護(hù)率在80%以上；由于繁殖母豬生產(chǎn)周期為3～5年，對繁殖母豬的影響有待進(jìn)一步觀察。該疫苗限于全進(jìn)全出商品育肥豬，暫不用于繁殖用的母豬及種公豬［32］。該疫苗有望成為商品疫苗預(yù)防ASF。