犢牛源雷氏普羅威登斯菌的分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)

王 娜，戴伶俐，烏云塔娜，畢力格，趙世華，達(dá)來寶力格

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2呼倫貝爾市新巴爾虎右旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 新巴爾虎右旗 021300；3.呼倫貝爾市新巴爾虎右旗農(nóng)牧業(yè)事業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古 新巴爾虎右旗 021300）

1904年美國細(xì)菌學(xué)家RETTGE初次分離到雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri），為腸桿菌科，普羅威登斯菌屬［1］。該菌為人畜共患條件病原菌，通過菌毛黏附于生殖道上皮引起尿路感染，也可引起傷口感染、菌血癥、腹瀉等多種疾?。?-2］。此外，雷氏普羅威登斯菌也能污染食品，造成人食物中毒，并能引發(fā)感染性腹瀉［3-4］。

雷氏普羅威登斯菌可感染多種動(dòng)物，如蝦、鼠、羊、豬、龜、揚(yáng)子鱷等。1997年我國學(xué)者戰(zhàn)文斌等［5］首次從患病蝦中分離到3株雷氏普羅威登斯菌，該菌致病性強(qiáng)，可引發(fā)敗血??；2012年王建峰等［6］從外來船舶壓艙水中分離到該菌；2015年王建昌等［7］從美國種豬新鮮糞便中分離到該菌，且該菌未攜帶blaNDM-1耐藥基因；2015年李林俐等［8］從揚(yáng)子鱷分離到該菌，揚(yáng)子鱷感染該菌會(huì)出現(xiàn)精神萎靡、便血，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)敗血癥；2016年Benedict等［9］從發(fā)病的鱷魚中也分離到了2株雷氏普羅威登斯菌，這2株菌均能引發(fā)敗血癥，且具有較強(qiáng)的耐藥性；2016年劉琨［10］從病死竹鼠內(nèi)臟中分離該菌，竹鼠感染該菌后肺部出現(xiàn)腫脹，腸道有出血點(diǎn)，脾和肝存在結(jié)節(jié)；2016年芮萍等［11］從哺乳腹瀉仔豬腸拭子中分離到該菌，該菌對(duì)13種藥物表現(xiàn)為耐藥，僅對(duì)美羅培南、乙酰甲喹敏感。2018年曹瑞勇等［12］從發(fā)病黑山羊鼻拭子中分離到該菌；2018年Newton等［13］從15歲短毛家貓中首次分離到該菌，該菌致病性強(qiáng)，可引發(fā)腹瀉、發(fā)燒、膽囊炎、肝炎等病癥，口服普拉多沙星治療28 d，之后4個(gè)月無并發(fā)癥狀；2020年Ye等［14］從中國患病海龜中分離到致病性雷氏普羅威登斯菌，該菌含有多種致病因子、毒力因子及多重耐藥基因。

該研究從腹瀉犢牛肛拭子中分離到1株雷氏普羅威登斯菌，并進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)，為犢牛腹瀉疾病的診斷提供理論依據(jù)，為后期的群體治療提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢病料

從內(nèi)蒙古呼倫貝爾市新巴爾虎右旗某家庭牧場1頭腹瀉犢牛中無菌采集肛拭子1份，裝入采樣袋，將其編號(hào)為HM-C-1。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TSA和TSB培養(yǎng)基，美國BD有限責(zé)任公司；EMB培養(yǎng)基和血平板，廣東環(huán)凱有限責(zé)任公司；革蘭染色液，北京索萊寶科技有限公司；17種藥敏片，杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱SPX-16B，吉林省安可科技有限責(zé)任公司；高速離心機(jī)pico17，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；恒溫水浴鍋SH-WB-6GDN3，韓國三興有限責(zé)任公司；恒溫?fù)u床TS-2112B，上海比朗儀器制造有限公司；旋渦振蕩器VM-10，大韓科學(xué)有限公司；PCR儀ABI9902，電泳儀HE99X，全自動(dòng)凝膠成像儀Type T2A，美國伯樂有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng)

無菌條件將肛拭子接種于血平板、TSA平板、EMB平板，37℃培養(yǎng)16～24 h，挑取菌落鏡檢純化，純培養(yǎng)物接種TSB中，取1 mL提取基因組DNA，剩余菌液用60%的甘油1∶1保存。

1.2.2 菌株生理生化鑒定

參照文獻(xiàn)［10］［12］［15］對(duì)分離菌株進(jìn)行生化指標(biāo)的測定。將對(duì)數(shù)期的細(xì)菌濃度調(diào)整為108CFU/mL，取60μL菌液懸空加入各微量生化反應(yīng)管，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.2.3 菌株16Sr DNA鑒定

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株DNA，引物27 F和1492 R根據(jù)文獻(xiàn)［8］由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為50μL：mix酶25μL，上下游引物各1μL，模板2μL，無酶水21μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，30次循環(huán)；72℃7 min。PCR產(chǎn)物低溫寄送到生工生物工程（上海）股份有限公司。

利用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，利用軟件MegAlign構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 藥敏試驗(yàn)

使用17種藥敏片進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，每種藥敏片設(shè)置3個(gè)重復(fù)，參考CLSIM100（2020）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定，見表1。

表1 17種藥敏片體外評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株培養(yǎng)特性

該菌株在血瓊脂平板、TSA平板、EMB平板上生長良好，在血瓊脂平板為灰白色透明菌落，且無明顯的溶血環(huán)，表面光滑，圓形凸起，邊緣整齊（見圖1A）；在TSA平板為白色透明菌落，表面圓形，濕潤凸起，邊緣整齊（見圖1B）；在伊紅美藍(lán)瓊脂平板為半透明淡棕菌落，表面圓形凸起，濕潤光滑（見圖1C）；挑取純化菌落進(jìn)行革蘭染色，用1 000倍油鏡觀察為革蘭陰性桿菌，并將該菌株命名為HMC-1。

圖1 分離菌株HM-C-1的菌落形態(tài)

2.2 菌株生化鑒定結(jié)果

嚴(yán)格按照細(xì)菌新型生化鑒定管使用說明書進(jìn)行操作。由表2可知，分離菌株氧化酶、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶為陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)、苯丙氨酸脫羧酶為陽性，符合雷氏普羅威登斯菌的理化特性，初步判斷為雷氏普羅威登斯菌。

表2 菌株HM-C-1生化鑒定結(jié)果

2.3 菌株16Sr DNA鑒定

以菌株HM-C-1基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1 500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（見圖2），經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序，通過NCBI比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖3）及進(jìn)行同源性分 析 （見 圖 4）， 分 離 株 HM-C-1與MT793534.1Providencia rettgeri相似度達(dá)到99.9%，因此，鑒定菌株HM-C-1為雷氏普羅威登斯菌。

圖2 菌株HM-C-1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖

圖3 菌株HM-C-1的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 菌株HM-C-1序列同源性分析

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

體外藥敏試驗(yàn)顯示，分離菌株HM-C-1對(duì)氨曲南、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢曲松、四環(huán)素、氯霉素、呋喃妥因8種藥物表現(xiàn)為耐藥；對(duì)氨芐西林、慶大霉素2種藥物表現(xiàn)為中度敏感；對(duì)頭孢西丁、鏈霉素、哌拉西林、阿米卡星、氧氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星7種藥物表現(xiàn)為敏感（見表3）。

表3 菌株HM-C-1體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

試驗(yàn)通過菌株分離培養(yǎng)、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)確定該菌為雷氏普羅威登斯菌，曹瑞勇等［12］也是采用上述3種方法相結(jié)合進(jìn)行菌株鑒定。目前，國內(nèi)未報(bào)道犢牛源雷氏普羅威登斯菌，但該試驗(yàn)從發(fā)病犢牛肛拭子中分離到該菌，是引起犢牛腹瀉的主要病原菌，且該病原可能是由于牛馬混群飼喂導(dǎo)致交叉感染。盡管該菌為條件致病菌，但養(yǎng)殖過程中隨著產(chǎn)業(yè)的集約化，養(yǎng)殖密度增大，外加各種冷熱應(yīng)激及營養(yǎng)供給不足，致使?fàn)倥Ｗ陨砻庖吡ο陆?，極可能會(huì)使該菌乘虛而入，導(dǎo)致大批犢牛發(fā)病甚至死亡，給養(yǎng)殖場帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失，

考慮牧戶養(yǎng)殖過程中濫用抗生素，細(xì)菌極可能產(chǎn)生耐藥性，所以筆者設(shè)計(jì)體外藥敏試驗(yàn)。該分離株對(duì)頭孢西丁、鏈霉素、哌拉西林、阿米卡星、氧氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星7種藥物敏感；李林俐等［8］分離的揚(yáng)子鱷源雷氏普羅威登斯菌對(duì)阿米卡星、氧氟沙星、諾氟沙星、氯霉素等14種藥物敏感；劉琨［10］分離的竹鼠源雷氏普羅威登斯菌對(duì)頭孢曲松、頭孢他啶、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考和阿米卡星6種藥物敏感；芮萍等［11］分離的仔豬源雷氏普羅威登斯菌僅對(duì)美羅培南、乙酰甲喹敏感。綜合分析，每株菌的耐藥程度不同，養(yǎng)殖過程中如發(fā)生該病，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果科學(xué)用藥，方能獲得較好的治療效果。