基因修飾豬作為異種器官移植供體在克服免疫排斥反應(yīng)中的研究進(jìn)展

王 飛，王 寧

（雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 雅安 625000）

近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的成熟，免疫生物學(xué)的發(fā)展，器官移植成功率的大幅提高，器官移植已成為許多終末期疾病首選的治療方法。但是，接受移植手術(shù)的人數(shù)日益增加，而能夠提供的供體器官數(shù)量卻非常有限，大部分患者得不到及時(shí)治療在等待器官的過程中死亡。由此產(chǎn)生的器官短缺問題日漸凸顯，已成為制約臨床器官移植發(fā)展的重要因素，動(dòng)物器官來源豐富，數(shù)量龐大，用動(dòng)物器官作異種供體是一種有效解決來源的途徑，致使關(guān)于異種器官移植（Xenotransplantation）的研究迅速蓬勃發(fā)展。

靈長(zhǎng)類動(dòng)物，如黑猩猩、狒狒、猴子等，進(jìn)化程度與人相近，且這些靈長(zhǎng)類動(dòng)物中有著與人類相似的A、B血型和主要組織相容性復(fù)合物，從理論上講，這些高級(jí)的非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物是用于異種移植的最理想的供者動(dòng)物，但它們繁殖周期長(zhǎng)、飼養(yǎng)困難，瀕臨滅絕、價(jià)格昂貴，從倫理和物種保護(hù)出發(fā)不適合作為異種器官供體。豬憑借解剖學(xué)和生理學(xué)特征與人的高度相似性，且易于基因改造和修飾、安全性好，逐漸取代了其他模式動(dòng)物的地位，成為異種器官移植研究的最佳供體動(dòng)物。然而，由于豬和人類之間在進(jìn)化上的巨大差異，直接用豬作為異種器官移植的供體會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)力的免疫排斥反應(yīng)，主要表現(xiàn)為超急性排斥反應(yīng)、急性血管排斥反應(yīng)等。要解決這些免疫排斥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)異種器官移植，Starzl T E等預(yù)測(cè)，通過基因工程進(jìn)行遺傳修飾或其他調(diào)節(jié)技術(shù)改造的動(dòng)物器官，將成為器官移植的最終發(fā)展趨勢(shì)。

目前，通過敲除異種抗原基因，轉(zhuǎn)入表達(dá)人體補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白和凝血調(diào)節(jié)蛋白等特點(diǎn)的基因獲得的基因修飾豬，能夠克服異種移植免疫排斥反應(yīng)，可延長(zhǎng)豬來源供體器官在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物受體中的存活時(shí)間。本文就基因修飾豬作為異種器官移植供體在克服各階段免疫排斥反應(yīng)的研究進(jìn)展作一綜述。

1 超急性排斥反應(yīng)

超急性排斥反應(yīng)（Hyperacute Rejection，HAR）是指當(dāng)異種細(xì)胞、組織或器官作為供體移植到宿主體內(nèi)，發(fā)生的快速而又強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，表現(xiàn)為異種供體剛與受體血管吻合，在器官尚未發(fā)揮功能時(shí)就與體內(nèi)存在的天然抗體結(jié)合，通過激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)攻擊供體器官。目前普遍認(rèn)為，HAR是由人體內(nèi)天然存在的抗體IgG和IgM與非靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞表面的α1，3-半乳糖基（α1，3-galactosyl，α1，3Gal）抗原決定簇結(jié)合引起，它是異種器官移植過程中面臨的主要障礙。α1，3Gal抗原表位的形成受α1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶（α1，3-galactosyltransferase，GGTA1）基因調(diào)控，人類在進(jìn)化過程中GGTA1基因失活，細(xì)胞表面不表達(dá)α1，3Gal但卻形成了天然α1，3Gal抗體，而非靈長(zhǎng)類動(dòng)物自身表達(dá)α1，3Gal，當(dāng)把動(dòng)物器官移植到人類受體時(shí)，人體血液中的天然抗體就會(huì)與異種抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物激活補(bǔ)體調(diào)控系統(tǒng)，引發(fā)補(bǔ)體系統(tǒng)的鏈?zhǔn)郊せ钭罱K形成攻膜復(fù)合物，使器官在數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生炎癥、血栓、壞死等癥狀。

為解決異種器官移植中的HAR，在Lai LX等（2002）制備了首例GGAT1單等位基因敲除（GGTA1+/-）的基礎(chǔ)上，Phelps CJ等（2003），Kolber-Simonds等（2004）成功獲得了GGAT1基因失活（GGTA1-/-）的基因修飾豬。GGAT1敲除豬（GTKO）的成功為異種器官移植的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，之后關(guān)于GGAT1基因敲除豬的報(bào)道越來越多，關(guān)于GTKO的豬用于器官移植后的結(jié)果也越來越好。如Yamada K等用腎移植到狒狒后，在體內(nèi)存活了32d，Kuwaki K等用心臟移植到狒狒后存活了78d。

2 急性血管排斥反應(yīng)

如果HAR能得以克服，在移植后2～3d內(nèi)會(huì)發(fā)生急性血管性排斥反應(yīng)（Acute Vascular Rejection，AVR），其癥狀主要表現(xiàn)為移植處巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（帶有少量的T細(xì)胞）的炎性浸潤和活化，細(xì)胞因子的釋放和血管內(nèi)皮活化，血管內(nèi)血栓形成，血管壁纖維素樣壞死等。有研究表明AVR的形成需要內(nèi)源蛋白的合成和受移植器官內(nèi)皮細(xì)胞和宿主抗體、巨噬細(xì)胞和血小板相互作用的驅(qū)動(dòng)。新內(nèi)源蛋白的合成使Ⅱ型內(nèi)皮細(xì)胞活化，活化的內(nèi)皮細(xì)胞一方面刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附因子，如細(xì)胞粘附分子-1（Vascular cell melhesion molecule-1）和細(xì)胞因子IL-1，IL-6，IL-8等，這些細(xì)胞因子與T細(xì)胞的活化及增殖都密切相關(guān)。另一方面打破血栓調(diào)節(jié)素平衡，使血小板活化產(chǎn)生促凝血的（Platelet-Activating Factor，PAF）和組織因子導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成。此外，α1，3Gal抗原表位在起始誘導(dǎo)AVR的過程中也發(fā)揮著作用，在敲除GGAT1基因的動(dòng)物器官中，α1，3Gal抗原表位不表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)非α1，3Gal抗體的急劇上升，從而引發(fā)AVR。

目前認(rèn)為AVR的發(fā)生主要與補(bǔ)體活化有關(guān)，Nagaharna M等（2002）用腺病毒介導(dǎo)的方法將DAF、MCP、CD59基因轉(zhuǎn)入豬細(xì)胞，獲得了同時(shí)表達(dá)三個(gè)基因的克隆豬，在肝的灌注實(shí)驗(yàn)中有效抑制了補(bǔ)體系統(tǒng)的激活。Loveland BE等（2004）構(gòu)建hCD46表達(dá)載體，并通過體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得了高表達(dá)hCD46的豬，成功分離豬外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）用于血清裂解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)hCD46的PBMC有效抵抗人類補(bǔ)體的損傷，將腎移植到狒狒后其存活時(shí)間也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過普通豬。Mohiuddin等 利用CD40抗體，將敲除GGTA1基因和過表達(dá)兩種人體蛋白基因的豬心臟移植到狒狒體內(nèi)，結(jié)果顯示平均存活時(shí)間為

298 d，最長(zhǎng)的1只已經(jīng)存活了945d。

3 細(xì)胞性排斥反應(yīng)

超急性排斥反應(yīng)和急性血管排斥反應(yīng)都是體液免疫的結(jié)果，而細(xì)胞性排斥反應(yīng)（Cellularre Rejection，CR）是由細(xì)胞免疫導(dǎo)致。CR主要受自然殺傷細(xì)胞（Natural Killer Cell，NK cell）和主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）激活T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)。CR的形成主要決定于多肽的類型，不同的MHC會(huì)激活不同的T細(xì)胞，Ⅰ類MHC主要激活CD4+T細(xì)胞而Ⅱ型MHC主要激活CD8+T細(xì)胞。

Wu等研究發(fā)現(xiàn)豬-動(dòng)物移植模型后，發(fā)現(xiàn)Treg數(shù)量降低與排斥反應(yīng)的發(fā)生緊密相關(guān)，耐受組淋巴細(xì)胞分類中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）比例顯著升高，清除Treg會(huì)顯著提高異種排斥反應(yīng)的發(fā)生率。

4 慢排斥反應(yīng)

慢排斥反應(yīng)（Chronic rejection）即移植物血管病變，是一種緩慢和漸進(jìn)性的排斥反應(yīng)，由于異種器官移植后很難生存到此階段，所以對(duì)慢排斥的研究甚少，但確定此階段抗體反應(yīng)和補(bǔ)體系統(tǒng)的激活已不存在。Mohiuddin等的研究顯示表達(dá)人血栓調(diào)節(jié)蛋白（humanthrombomodulin，hTM）的GTKO基因修飾豬，進(jìn)行心臟移植后沒有出現(xiàn)移植物血管病變。IWASE H等的研究表明，表達(dá)hTM的GTKO基因修飾豬，hTM的表達(dá)會(huì)阻止血小板減少，延緩血栓形成和消耗性凝血病的發(fā)生，更有利于異種器官移植。

5 豬的基因修飾對(duì)異種器官移植的促進(jìn)

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的基因修飾技術(shù)已逐漸被鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（Transcription Activator Like Effectors Nuclease，TALEN）技術(shù)、CRISPR／Cas9技術(shù)等取代。基因修飾技術(shù)的快速發(fā)展，促進(jìn)了豬人源基因的改造，實(shí)現(xiàn)了免疫排斥反應(yīng)的降低，縮短了異種移植進(jìn)入臨床的時(shí)間。

6 小結(jié)

異種移植是解決人類器官短缺問題的重要手段，也是近年來學(xué)者不懈研究的領(lǐng)域。雖然臨床異種移植尚無成功的經(jīng)驗(yàn)，但是靈長(zhǎng)類動(dòng)物的前期研究將為異種器官移植提供重要的試驗(yàn)和數(shù)據(jù)理論支撐。近年來，異種移植基礎(chǔ)研究進(jìn)展迅速，豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染問題也得到了解決，基因修飾豬作為異種器官移植供體在受體內(nèi)的存活時(shí)間也顯著延長(zhǎng)。相信隨著各種基因修飾豬的產(chǎn)生，免疫抑制藥物的發(fā)展，異種器官移植面臨的免疫排斥反應(yīng)將有效得到解決。