1例PED 的實(shí)驗(yàn)室診斷與思考

宋修文 賈杏林

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128

在生豬養(yǎng)殖過程中仔豬腹瀉十分常見，導(dǎo)致仔豬腹瀉的病原有很多種，其中豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是導(dǎo)致仔豬腹瀉的重要病原。PEDV 屬于冠狀病毒科成員，該病毒感染可導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐和極度消瘦等臨床癥狀，若不加干預(yù)，其死亡率可達(dá)100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。自2010 年以來，豬腹瀉（PED）再次在國內(nèi)豬群中暴發(fā)，且基于CV777 疫苗無法提供有效的保護(hù)，該病的流行曾給我國部分豬場造成毀滅性的打擊。當(dāng)前我國豬群流行的PEDV 毒株基因型較多，包括變異株、傳統(tǒng)株及重組毒株，且不同毒株毒力等存在很大的差異，這也不利于豬場PED 的防控。

目前對(duì)于疾病的診斷主要依賴于傳統(tǒng)的臨床診斷結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，由于可引起仔豬腹瀉的病因較多，如豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、輪狀病毒（PORV）和豬德塔冠狀病毒（PDCoV）。豬被這些病原感染后導(dǎo)致的臨床癥狀類似，使得臨床診斷不能對(duì)病原進(jìn)行確診，這無疑會(huì)延誤病情的治療，導(dǎo)致更加嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)當(dāng)前豬疾病的診斷極為重要，本文將通過對(duì)1 例PEDV感染導(dǎo)致仔豬腹瀉的案例診斷過程進(jìn)行闡述，以強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)疫病防控的重要性。

1 豬場發(fā)病情況

湖南省婁底市某規(guī)?；i場飼養(yǎng)繁殖母豬500余頭，其養(yǎng)殖模式為自繁自養(yǎng)。2021 年初，該場產(chǎn)房部分欄舍仔豬出現(xiàn)腹瀉疫情，主要是仔豬嚴(yán)重水樣腹瀉、嘔吐等，嚴(yán)重的仔豬瘦骨嶙峋，最終因脫水而死。由于該場豬群已免疫接種過流行性腹瀉/傳染性胃腸炎二聯(lián)弱毒疫苗，但未免疫接種偽狂犬病相關(guān)疫苗，駐場獸醫(yī)猜測(cè)可能是由偽狂犬病野毒感染所致，于是緊急對(duì)豬群免疫接種偽狂犬病毒滅活疫苗，但防治效果不佳。從發(fā)病開始到該場送檢樣品，該場已有300 余頭仔豬發(fā)病，其中超過120 頭仔豬死亡，其病死率近40%。

2 剖檢臨床變化及樣品送檢

觀察豬群臨床癥狀可見發(fā)病仔豬全身沾滿糞便，部分仔豬脫水嚴(yán)重，盡管豬舍內(nèi)氣溫很高，但豬群也存在扎堆現(xiàn)象；在確定為非洲豬瘟陰性的前提下對(duì)死亡仔豬進(jìn)行剖檢，可見仔豬小腸內(nèi)基本無內(nèi)容物、小腸脹氣嚴(yán)重，腸系膜淋巴結(jié)腫大；胃內(nèi)容物均為未消化的凝乳塊，其他組織器官病變不明顯。為確定發(fā)病原因，筆者采集小腸病料低溫運(yùn)輸送至相關(guān)動(dòng)物疫病診斷中心進(jìn)行病原診斷。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 細(xì)菌分離鑒定

無菌對(duì)腸道組織剪碎后，加入適量PBS 溶液研磨，取上清用無菌紗布過濾后用滅菌接種環(huán)蘸取少量過濾液在鮮血瓊脂固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線，其后將平板放置在37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h 后觀察培養(yǎng)基表面是否有疑似菌落出現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病料處理的培養(yǎng)基表面沒有出現(xiàn)任何菌落，故判定該場仔豬腹瀉不是由細(xì)菌性病原感染所引起。

3.2 病毒性病原檢測(cè)

采用DNA/RNA 基因組提取試劑盒對(duì)組織病料上清進(jìn)行基因組提取，其后利用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)基因組中RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用相應(yīng)的熒光定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣品中是否存在PEDV、TGEV、PORV、PDCoV、豬圓環(huán)病毒二型（PCV2）和豬偽狂犬病病毒（PRV）核酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品中僅檢測(cè)出PEDV 核酸，未檢測(cè)到其他病原核酸，結(jié)果提示該場發(fā)生疫情可能是由PEDV 感染所引起。

3.3 PEDV S1 基因序列擴(kuò)增及分析

為進(jìn)一步確定該場暴發(fā)PEDV 毒株的基因型，我們對(duì)該毒株的S1 基因部分序列進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增的序列產(chǎn)物大小約2 000 bp（圖1）。其后將PCR 產(chǎn)物送至專業(yè)的生物公司進(jìn)行測(cè)序，并委托其分析，將該毒株的S1 基因序列與GenBank 收錄的PEDV 毒株相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)該毒株與目前國內(nèi)流行的PEDV 變異株相應(yīng)序列同源性高達(dá)99.7%，但與目前國內(nèi)外常用的PEDV 疫苗株（CV777 毒株）相應(yīng)序列同源性相對(duì)較低，故可判定該場發(fā)生的PED 是由PEDV 變異株感染所引起。

4 治療措施

考慮到該場目前流行的PEDV 毒株屬于變異株，而目前國內(nèi)廣泛使用的PEDV 弱毒或滅活疫苗是基于PEDV 傳統(tǒng)株（CV777 株）研制的，已有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)前PEDV CV777 弱毒或滅活疫苗對(duì)國內(nèi)外流行的PEDV 變異株防控能力有限[2]，因此我們對(duì)瀕臨死亡或已死亡仔豬腸道組織樣品進(jìn)行處理制備自家苗，其后將自家苗與飼料拌喂后對(duì)母豬進(jìn)行飼喂，以促使母豬產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，最終仔豬通過吸乳獲得相應(yīng)的母源抗體。

為盡快對(duì)該病進(jìn)行有效防控，也采取了以下緊急措施：1）將發(fā)病豬群和假定健康豬群隔離飼養(yǎng)，并將無治療意義的仔豬處死后無害化處理；2）適當(dāng)提高豬舍內(nèi)溫度，保持通風(fēng)環(huán)境，對(duì)豬舍內(nèi)的糞污等及時(shí)清除；3）提高豬舍環(huán)境消毒頻率，采用帶豬消毒模式；4）在仔豬水源中添加適量食鹽、電解多維等，防止腹瀉仔豬因脫水而死亡。采取以上防控措施2 周后，該場仔豬腹瀉病情基本得到有效控制，其生產(chǎn)水平基本恢復(fù)。

5 討 論

近年來，我國生豬養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，其養(yǎng)殖模式逐漸從散養(yǎng)向規(guī)?；⒓s化方向過渡，這主要是由于散養(yǎng)戶養(yǎng)殖水平較低，且抗風(fēng)險(xiǎn)能力較差。誠然，規(guī)?；i場養(yǎng)殖的健康發(fā)展直接影響著我國消費(fèi)者餐桌上的豬肉來源。在規(guī)?；i場中，豬群發(fā)生腹瀉的情況還是較為常見的，但導(dǎo)致豬群腹瀉的因素十分復(fù)雜，這些因素中包括細(xì)菌性病原（如大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌及巴氏桿菌等）感染、病毒性病原（如PEDV、PRV、豬藍(lán)耳病毒及豬瘟病毒等）感染、寄生蟲（如豬球蟲、小袋纖毛蟲、豬蛔蟲等）感染、飼料毒素（如嘔吐毒素、T2 毒素等）污染及外界環(huán)境改變等，其中細(xì)菌及寄生蟲性疾病可以通過相應(yīng)的藥物進(jìn)行治療；飼料毒素污染和外界環(huán)境改變可以通過調(diào)整飼料或外界環(huán)境（如溫度和濕度等）來解決。但是對(duì)于病毒性疾病的防控相對(duì)困難，由于沒有相應(yīng)的抗病毒藥物，故對(duì)于病毒性疾病的防控主要依賴于疫苗免疫接種和生物安全防控，誠然豬群發(fā)病后及時(shí)確診也是十分重要的。但是對(duì)于豬群腹瀉而言，不同病毒感染可導(dǎo)致該病，但部分病原感染豬群后還可導(dǎo)致其出現(xiàn)除腹瀉以外其他癥狀，如PRV 可導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，繁殖母豬出現(xiàn)流產(chǎn)等；藍(lán)耳病毒感染可導(dǎo)致豬群高熱和繁殖母豬流產(chǎn)等；但（仔豬）豬群感染腸道病毒后所表現(xiàn)的臨床癥狀及病理變化差異不大，且部分病例中存在多種腸道病毒的混合感染，這使得此類疾病的診斷不能單單依靠臨床及病理診斷，必要的分子生物學(xué)診斷是需要的。

本文涉及到的病例診斷過程即是如此，雖然該豬場之前已經(jīng)免疫接種過PED 相關(guān)疫苗，但沒有考慮該疫苗對(duì)目前國內(nèi)外流行的PEDV 變異株的防控效果，同時(shí)也沒有去監(jiān)測(cè)相應(yīng)的血清抗體水平，這使得當(dāng)豬場發(fā)生仔豬腹瀉病情時(shí)很自然排除了PEDV 感染的可能性，采取針對(duì)其他傳染病的防治方法治療該病，導(dǎo)致最終治療效果較差。為準(zhǔn)確給致病原進(jìn)行診斷，我們將仔豬小腸病變組織送至專業(yè)的病原診斷中心進(jìn)行確診，結(jié)果沒有在病變組織中分離到細(xì)菌性病原，這說明仔豬腹瀉可能不是由于細(xì)菌性病原感染引起；對(duì)于豬常見病毒性病原僅檢測(cè)到PEDV 核酸，沒有檢測(cè)到其他病原核酸，這說明該豬場發(fā)病是由于PEDV 感染引起。

為有效防控PED，我國政府及企業(yè)從國外引進(jìn)基于PEDV CV777 毒株研發(fā)的弱毒苗和滅活苗用于PED 的防控。誠然，此類疫苗的應(yīng)用在一定程度上抑制了PED 的流行。直至2010 年冬季以后（目前也是如此），我國部分地區(qū)免疫接種過PEDV CV777 疫苗的豬場仍然暴發(fā)了PED。進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn)，與PEDV CV777 毒株相比，從發(fā)病豬場分離的PEDV 毒株抗原基因（如S 基因）部分氨基酸序列出現(xiàn)明顯的變異，且進(jìn)一步遺傳進(jìn)化分析可發(fā)現(xiàn)以PEDV CV777 毒株為代表的毒株與新發(fā)PEDV 毒株所屬分支可進(jìn)行有效區(qū)分，故可將前者命名為PEDV 傳統(tǒng)株，后者則為PEDV 變異株。

由于當(dāng)前PEDV 毒株可分為2 種基因型，且傳統(tǒng)的CV777 疫苗可能對(duì)目前流行的PEDV 變異株防控效果有限，因此確定該場流行的何種基因型對(duì)相應(yīng)的防控措施制定十分重要。我們?cè)趯?duì)該病進(jìn)行確診時(shí)，通過RT-PCR 技術(shù)擴(kuò)增該毒株的S1 基因部分序列，并通過DNAStar 軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株與PEDV 變異株對(duì)應(yīng)序列的同源性最高，說明該毒株屬于PEDV 變異株，其后采取系列的防控措施使得該病得到了有效的控制，減少了豬場相應(yīng)的經(jīng)濟(jì)損失。