不同干燥方式黃芪提取物理化性質(zhì)及HPLC-ELSD指紋圖譜的比較

李明月， 常麗靜， 韋花花， 陳 新

(長春中醫(yī)藥大學長白山道地藥材藥效物質(zhì)重點研究室，吉林 長春 130117)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，其化學成分包括黃酮類、皂苷類和多糖類化合物等。現(xiàn)代藥理學研究表明黃芪中皂苷類及黃酮類成分是其主要藥效成分，具有改善心腦血管、調(diào)節(jié)腎功能、抗氧化、神經(jīng)保護等多種藥理作用[1-3]，本實驗根據(jù)皂苷、黃酮類成分的溶解性，利用水提醇沉法制備黃芪提取液，經(jīng)濃縮、干燥制備黃芪固體提取物。

中藥固體原料藥是中藥制劑中間體常見形式，干燥是中間體粉末制備的必要步驟之一。因加熱方式、干燥條件的差異，不同干燥方式可能會對目標樣品的成分特性及理化性質(zhì)造成影響，進而影響制劑過程及制劑工藝，而中藥原料藥粉末的理化性質(zhì)可從溶解性、吸濕性、平衡溶解度、穩(wěn)定性等方面進行表征[4-5]，反應其制劑成型性以及成藥性性能。本研究擬從樣品粉末理化性質(zhì)、HPLC-ELSD指紋圖譜研究常壓干燥、減壓干燥、冷凍干燥三種常用干燥方式[6]對黃芪提取物的影響，以期為黃芪中藥制劑的輔料選擇、制劑優(yōu)化、以及黃芪二次開發(fā)[7-8]等提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 LXJ-IIB低速大容量多管離心機(上海安亭科學儀器廠)；Agilent 1260 ELSD高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Epsilon 2-4 LSCplus 真空冷凍干燥機(德國Martin Christ公司)；DDSJ-308A電導率儀(上海雷磁儀器廠)；實驗室PH計[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；GZX-9240 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；TS-100B恒溫搖床[匡貝實業(yè)(上海)有限公司]；全自動中藥煎藥機(青島達爾電子機械銷售有限公司)；NDJ-1型旋轉式粘度計(上海力辰邦西儀器科技有限公司)。

1.2 藥品與試劑 黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、次芒柄花苷對照品(上海弘揚科技信息有限公司，批號分別為190110-015、190216-016、190216-017、181118-018、181217-013、181108-012、180303-011、190114-044，純度均≥98%)。氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號20201017)；磷酸二氫鈉(北京北化精細化學品有限責任公司，批號20190218)；磷酸氫二鈉(上海麥克林生化科技有限公司，批號S818100)；磷酸二氫鉀(廣東光華科技股份有限公司，批號20201020)；磷酸氫二鉀(北京北化精細化學品有限責任公司，批號20170311)；硝酸鉀(上海西隴化工股份有限公司，批號20180717)。黃芪(河北仁心藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地內(nèi)蒙，批號201803-01、201803-02、201803-03、201810-01、201810-02、201811-01、201811-02、201911-01、201911-02、201911-03)，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學肖井雷教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao。

2 方法與結果

2.1 水煎液制備 取藥材1 kg，加10倍量水浸泡5 h后煎煮3 h，濾過，殘渣加8倍量水煎煮2 h，濾過，合并濾液，即得水煎液，濃縮至1.2 L，同法制備10批(編號H1～H10)，測定濃縮前后體積、TDS、電導率、鹽度、pH值、電位，結果見表1。

表1 水煎液物理指標測定結果

2.2 提取物制備 取“2.1”項下水煎液(H1～H10)，加入3.36 L乙醇至醇體積分數(shù)為70%，靜置24 h后3 000 r/min離心，取上清液，加70%乙醇定容至5.0 L，分成3份，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.20～1.30(25 ℃)的浸膏，其黏度[9]見表2。再分別進行常壓干燥(溫度80 ℃，干燥時間72 h)、減壓干燥(溫度80 ℃，壓力-80 kPa，干燥時間48 h)、冷凍干燥(溫度-80 ℃，壓力0.013 3 kPa，干燥時間35 h，預凍時間12 h)，分別編號S1～S10、S11～S20、S21～S30，干膏得率分別為22.53%～30.64%、21.35%～33.93%、19.88%～31.82%，平均含水量分別為3.82%、3.36%、3.16%，將其進行粉碎(3次，每次3 min)后過6號篩，即得，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 提取物黏度測定結果

2.3 黃芪甲苷含量測定

2.3.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈-水(32∶68)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量2、10 μL(對照品)及10 μL(供試品)；蒸發(fā)器溫度50 ℃；霧化器溫度50 ℃；載氣體積流量1 400 mL/min。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.484 8 mg/mL溶液，即得色譜圖見圖1。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取提取物粉末2.0 g，精密加入50 mL甲醇，超聲(400 W、40 kHz)處理20 min，過濾，10 mL甲醇沖洗濾渣，蒸干，加10 mL水溶解，水飽和的正丁醇萃取4次，每次50 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加適量甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得，色譜圖見圖2。

2.3.4 線性關系考察 取對照品適量，甲醇逐級稀釋至0.484 8、0.387 9、0.242 4、0.193 9、0.121 2、0.096 9 mg/mL，分別吸取10 μL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以黃芪甲苷峰面積對數(shù)為縱坐標(Y)，進樣量對數(shù)為橫坐標(X)進行回歸，得方程為Y=1.698 8X+6.927 5(r=0.999 8)，在0.97～4.85 μg范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗 取提取物(S11)粉末適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得黃芪甲苷峰面積RSD為0.46%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性試驗 取提取物(S11)粉末適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得黃芪甲苷含量RSD為0.64%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取提取物(S11)粉末適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h在“2.3.1”項色譜條件下各進樣10 μL測定，測得黃芪甲苷峰面積RSD為0.40%。表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取黃芪甲苷含量已知的提取物(S11)粉末6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，精密加入含黃芪甲苷0.484 8 mg/mL的對照品溶液1 mL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，黃芪甲苷加樣回收率為96.81%，RSD為0.94%。

2.3.9 黃芪甲苷含量測定 結果見表3。

表3 黃芪甲苷含量測定結果

2.4 理化性質(zhì)測定

2.4.1 溶解性 取10批提取物，每批3.0 g，平行3份，精密稱取質(zhì)量(M0)，加入50 mL水，恒溫(25 ℃)振蕩30 min，離心，分離上清液和沉淀，濕沉淀稱定質(zhì)量(M1)，上清液放到干燥至恒重的蒸發(fā)皿中蒸干，揮去水分，置于105 ℃烘箱中干燥至恒重(M2)，計算溶解性、吸水性指數(shù)，公式分別為溶解性指數(shù)=(M2/M0)×100%、吸水性指數(shù)=[M1/(M0-M2)]×100%，結果見表4、圖3。由此可知，提取物溶解性指數(shù)依次為冷凍干燥>減壓干燥>常壓干燥，均≥76.62%；吸水性指數(shù)依次為常壓干燥>減壓干燥>冷凍干燥，均≥101.38%。

表4 不同干燥方式提取物溶解性、吸水性指數(shù)測定結果

表5 提取物表觀溶解度測定結果

2.4.3 吸濕性 將干燥至恒重的扁形瓶置于裝有飽和氯化鈉溶液[相對濕度(75±1)%、溫度15.5～60 ℃]的干燥器中，室溫下預飽和24 h，精密稱取扁形瓶質(zhì)量(M4)。取不同干燥方式提取物粉末各4.0 g，平鋪于扁形瓶中(厚度小于5 mm)，精密稱取質(zhì)量(M5)，將扁形瓶敞口放置于裝有飽和氯化鈉溶液的干燥器中，于不同時間點取出，精密稱取質(zhì)量(M6)，計算吸濕率，繪制吸濕曲線，公式為吸濕率=[(M6-M5)/(M5-M4)]×100%，結果見圖5。

表6 提取物吸濕方程回歸分析及吸濕參數(shù)

2.4.4 粒徑分布特征 將預先稱定質(zhì)量的標準篩網(wǎng)按照六、七、八號篩的順序由上至下疊放[12]，精密稱取3批不同干燥方式提取物粉末，每批約30 g，稱定質(zhì)量(Ma)，置于上層篩網(wǎng)中，水平振搖3 min，不時在垂直方向輕扣篩以使粉末通過各號篩網(wǎng)，取截留粉末，稱定質(zhì)量(Mb)，計算通過率，公式為通過率=[(Ma-Mb)/Ma]×100%，繪制粒度分布直方圖，見圖6。由此可知，常壓干燥、減壓干燥、冷凍干燥提取物經(jīng)六、七號篩的通過率分別為(79.83±1.43)%、(84.01±1.66)%、(89.7 7±1.28)%，經(jīng)八號篩的通過率分別為(60.76±1.93)%、(61.90±0.59)%、(66.91±1.50)%。

2.4.5 穩(wěn)定性

2.4.5.1 高溫試驗 取不同干燥方式提取物粉末S1、S11、S21各5 g，平鋪于扁形瓶底部，置于60 ℃恒溫干燥箱中10 d，于第0、5、10天取樣，檢查外觀性狀，按“2.3”項下方法測定黃芪甲苷含量，結果見表7。

2.4.5.2 強光照射試驗 取不同干燥方式提取物粉末S1、S11、S21各5 g，平鋪于扁形瓶底部，置于裝有日光燈的光照箱[(4 500±500)lx]中10 d，于第0、5、10天取樣，檢查外觀性狀，按“2.3”項下方法測定黃芪甲苷含量，結果見表7。

表7 高溫、強光照射試驗結果

2.4.5.3 高濕試驗 取不同干燥方式提取物粉末S1、S11、S21各4 g，平鋪于扁形瓶底部(厚度≤3 mm)，精密稱取質(zhì)量，置于裝有飽和硝酸鉀溶液(相對濕度92.5%，25 ℃)的干燥器中10 d，于第0、5、10天取樣，檢查外觀性狀，測定增重率，結果見表8。

我國近代的著名教育家、藝術家們都極其注重學習中文和西文，有著深厚的國學和西學根底。他們尊崇優(yōu)秀傳統(tǒng)文化，重視國際文化交流，具有強烈的文化自覺精神和歷史使命感，在中西文化互補方面起表率作用。

表8 高濕試驗結果

2.4.5.4 結果分析 不同干燥方式提取物在高溫、強光照射條件下，黃芪甲苷含量減少率均≤4.0%，外觀性狀無明顯變化，表明在高溫、強光照射下穩(wěn)定性良好；在高濕下，不同干燥方式提取物均由粉末狀變?yōu)槌砀酄?，增重率均?8%，即均易吸濕液化，其中常壓干燥時最大增重率達59%。

2.5 HPLC指紋圖譜建立

2.5.1 色譜條件 參考文獻[13]報道。Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～18 min，90%～80%A；18～30 min，80%～72%A；30～40 min，72%～65%A；40～75 min，65%～49%A；75～100 min，49%～90%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量20 μL；蒸發(fā)器溫度50 ℃，霧化器溫度50 ℃；載氣體積流量1 400 mL/min。

2.5.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、刺芒柄花苷、芒柄花黃素對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.490 8、0.490 8、0.491 2、0.484 8、0.492 4、0.491 2、0.502 9、0.492 4 mg/mL的貯備液，精密稱取對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.108 8、0.101 9、0.221 5、0.223 3、0.098 9、0.098 0、0.114 7、0.115 6 mg/mL的溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液制備 精密稱取提取物粉末4.0 g，精密加入50 mL甲醇，超聲(400 W、40 kHz)處理20 min，濾過，20 mL甲醇沖洗濾渣，蒸干，加10 mL水溶解，水飽和的正丁醇萃取4次，每次50 mL，合并正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.5.4 專屬性試驗 取“2.5.2”“2.5.3”項下對照品、供試品溶液適量，在“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，結果見圖7。由此可知，各成分分離度良好，表明該方法專屬性良好。

2.5.5 精密度試驗 取提取物(S11)粉末適量，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項下色譜條件進樣測定6次，以13號峰(黃芪甲苷)為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別小于0.28%、2.03%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 取提取物(S11)適量，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，于0、1.5、3.0、4.5、9、12、18、24 h在“2.5.1”項色譜條件下進樣測定，以13號峰(黃芪甲苷)為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別小于0.14%、1.29%，表明溶液在常溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 重復性試驗 取提取物(S11)適量，按“2.5.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.5.1”項色譜條件下進樣測定，以13號峰(黃芪甲苷)為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別小于0.17%、1.43%，表明該方法重復性良好。

2.5.8 圖譜生成及相似度評價 取30批樣品及干燥前浸膏適量，按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項色譜條件下進樣測定，將數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”軟件中，以浸膏樣品的色譜圖為參照圖譜R，確定22個共有峰，指紋圖譜見圖7。與對照品溶液比對后，標定4號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，8號峰為刺芒柄花苷，11號峰為毛蕊異黃酮，13號峰為黃芪甲苷，14號峰為黃芪皂苷Ⅲ，16號峰為芒柄花黃素，17號峰為黃芪皂苷Ⅱ，20號峰為黃芪皂苷Ⅰ，其中13號峰響應值較高，分離度較好，保留時間穩(wěn)定，故以其為參照。保留時間窗口設定為0.5 min，采用多點校正后進行自動匹配，生成疊加圖譜(圖8)，測得不同干燥方式提取物圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.990，表明各批樣品質(zhì)量穩(wěn)定；共有峰相對保留時間的RSD為0～0.48%，相對峰面積的RSD為16.11%～76.47%，表明各成分含量存在明顯差異。

2.5.9 多元統(tǒng)計分析

2.5.9.1 聚類分析 以不同干燥方式提取物及浸膏指紋圖譜共有模式篩選出的22個共有峰峰面積為變量，SPSS 20.0軟件中的系統(tǒng)聚類法結合歐氏距離為樣品測度，進行聚類分析[14]，結果見圖9。由此可知，當d=10時，30批樣品聚為2類，S1～S10聚為1類，S11～S31聚為另1類，表明常壓干燥提取物與減壓干燥、冷凍干燥提取物存在明顯差異。

2.5.9.2 偏最小二乘判別分析(PLS-DA) 對22個共有峰峰面積進行PLS-DA分析，繪制PLS-DA模型得分圖，見圖10，可知3種提取方式的10批樣品各自聚為1類，浸膏樣品另聚為1類；模型Q2=0.853，R2Y=0.929，均>0.5，表示模型成功建立。以變量重要性投影VIP>1為標準，得到10個分類標志物，分別為色譜峰12(VIP=1.300)、13(VIP=1.276)、2(VIP=1.245)、4(VIP=1.215)、8(VIP=1.204)、14(VIP=1.188)、1(VIP=1.177)、15(VIP=1.145)、6(VIP=1.111)、3(VIP=1.099)，是區(qū)分知3種提取方式提取物的重要指標，見圖11。

3 討論

中成藥研究對象多為中藥提取物，即制劑中間體，對其化學成分進行研究的同時應結合理化性質(zhì)、指紋圖譜等進行綜合分析，為中間體有效性研究、制劑輔料選擇與優(yōu)化提供參考依據(jù)[15]。

本研究以黃芪提取物為研究對象，以電導率等物理指標對黃芪水煎液進行一致性評價，在提取液制備過程中，使用粘度計對濃縮過程進行監(jiān)控。綜合實驗結果表明，三種不同干燥方式樣品均具有良好的溶解性、吸水性及高溫強光穩(wěn)定性，粒徑分布基本一致，表觀溶解度趨勢一致且均在堿性條件下溶解度高。HPLC-ELSD指紋圖譜相似度均在0.990以上，共有峰數(shù)目一致，說明不同干燥方式的黃芪提取物化學成分組成一致，但其理化性質(zhì)及化學成分含量比例存在明顯差異。常壓干燥、減壓干燥樣品具有較強的吸濕性，冷凍干燥樣品則具有較好的溶解性。觀察常壓干燥、減壓干燥過程并分析其原因可能是二者干燥溫度較高，使其外表的水分迅速揮散，形成一層干燥而光滑的膜，導致內(nèi)部水分揮散受阻，一方面內(nèi)部存有空氣，繼續(xù)受熱膨脹，樣品質(zhì)地多孔疏松呈蜂窩狀且吸濕性強，形成包裹導致溶解性降低，另一方面干燥時間長，熱不穩(wěn)定性成分可能會發(fā)生改變。多元統(tǒng)計分析結果顯示，三種干燥方式樣品的特征成分比例組成存在差異，其中毛蕊異黃酮、刺芒柄花苷、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、以及三個未指認色譜峰為主要差異因素。

本研究從宏觀理化性質(zhì)及微觀分子組成對黃芪提取物不同干燥方式樣品進行深入研究，為黃芪中藥的制劑優(yōu)化、二次開發(fā)提供參考。