基于網(wǎng)絡藥理學及實驗驗證探討復方茴芹顆粒治療前列腺增生的作用機制

李慧峰， 孟 霜， 王鑫鑫， 王旭艷， 孔祥鵬， 裴妙榮*

(1.山西中醫(yī)藥大學，山西省現(xiàn)代中藥工程實驗室，山西 晉中 030619；2.山西省中西醫(yī)結合醫(yī)院中心實驗室，山西 太原 030013)

良性前列腺增生是一種常見于中老年男性，多伴有進行性尿頻、尿急、夜尿頻多、排尿困難、尿線中斷等癥狀的泌尿系統(tǒng)疾病，屬中醫(yī)學“精癃”“癃閉”范疇[1]。流行性病學調查發(fā)現(xiàn)[2]，隨著年齡的增長該病發(fā)病率呈遞增趨勢，其發(fā)病率50歲時約50%，80歲以后發(fā)病率接近90%。隨著我國老齡化逐漸加劇，前列腺增生發(fā)病人數(shù)逐年增多，嚴重影響人們的生活質量，給社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。目前針對前列腺增生的治療主要包括手術治療和化學藥物治療，手術治療后遺癥較多，如出血、尿失禁、電切綜合征、逆行射精甚至引起勃起功能障礙等，且容易復發(fā)，痛苦大，有創(chuàng)傷[3]；化學藥物治療效果并不是很理想，只能緩解局部癥狀，無法改善全身癥狀。

復方茴芹顆粒由山西省國醫(yī)大師王世民教授根據(jù)前列腺增生病因病機及臨床用藥經(jīng)驗研制而成，由羊紅膻、葛根、山楂等5味中藥組成，具有補腎氣、化血瘀作用，治療前列腺增生的療效顯著[4]，但其作用機制尚不明確。本文采用網(wǎng)絡藥理學對復方茴芹顆粒抑制前列腺增生的潛在靶點進行預測，分析其可能的作用機制，并用分子對接及動物實驗給予驗證。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠60只，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫24 ℃，12 h/12 h晝夜循環(huán)，空氣流通，自由飲食飲水，適應性喂養(yǎng)7 d。本研究動物實驗在山西中醫(yī)藥大學實驗管理中心進行，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理委員會批準(編號2021DW102)。

1.2 試劑與藥物 復方茴芹顆粒(批號20190506，每袋10 g，相當于23.3 g生藥)由山西中醫(yī)藥大學國醫(yī)大師工作室提供。非那雄胺片(批號N011372，每片5 mg)購自杭州默沙東制藥有限公司；丙酸睪丸素(批號T101368-25 g)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號15E13B46)、增強型RIPA裂解液(批號15G23C02)、蛋白酶抑制劑(PMSF)(批號AR1178)、5× SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(批號15I15B12)、洗膜緩沖液(TBST)(批號AR0031)、SDS-PAGE凝膠試劑盒(批號15G16B38)、山羊抗兔IgG二抗(批號BA1054)均購自武漢博士德生物工程有限公司；預染蛋白質彩虹marker(10～180 kDa)(批號SW117)購自賽文創(chuàng)新(北京)科技有限公司；蛋白激酶B(Akt)一抗(批號ab179463)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)一抗(批號ab59348)均購自英國Abcam公司；細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)一抗(批號137F5)、磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)一抗(批號19H8)、血管內皮生長因子A(VEGFA)一抗(批號65373S)、表皮生長因子(EGFR)一抗(批號4267T)均購自美國CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(批號AB0037)購自北京百奧創(chuàng)新科技有限公司。

2 方法

2.1 藥物化學活性成分的篩選及活性成分靶點的獲取 通過TCMSP、TCMID及相關文獻獲取枸杞子、葛根、西洋參、山楂、羊紅膻等5味中藥的活性成分，TCMSP篩選活性成分的條件為生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18。通過PubChem對篩選到的活性成分進行確認并下載活性成分對應的SMILES序列，將獲得的SMILES序列輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，得到活性成分的作用靶點，刪除每味藥物的重復靶點，整理得到復方茴芹顆粒的潛在靶點。

2.2 前列腺增生靶點的獲取 利用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，以前列腺增生為關鍵詞檢索相關的靶點，合并2個數(shù)據(jù)庫靶點，刪除重復得到前列腺增生靶點。

2.3 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網(wǎng)絡的構建 利用R軟件，將得到的藥物靶點與疾病靶點映射，取交集得到復方茴芹顆粒治療前列腺增生的潛在靶點，并繪制藥物-疾病Venn圖。將得到的藥物-疾病潛在靶點導入STRING平臺，設置物種為“Homosapiens”，構建PPI網(wǎng)絡。由于復方茴芹顆粒疾病靶點較多，利用R軟件，將PPI網(wǎng)絡進行柱狀圖可視化。將PPI網(wǎng)絡結果導入Cytoscape3.8.2軟件，利用MCODE插件對該結果進一步分析，得到潛在蛋白質功能模塊并對其功能進行描述。同時通過CytoHubba3.8.2插件的MCC算法篩選Hub基因。

2.4 GO富集和KEGG通路分析 利用R軟件對復方茴芹顆粒治療前列腺增生的潛在靶點進行GO生物過程富集和KEGG通路富集分析，以P<0.05為篩選標準。

2.5 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡通路的的構建 利用Cytoscape 3.8.2軟件，設定藥物-疾病靶點的degree值大于中位數(shù)的靶點來構建疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡通路圖。得中位數(shù)為48，最大degree值為167，因此取degree值為48～167的靶點構建疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡通路圖。

2.6 活性成分-靶蛋白分子對接 根據(jù)復方茴芹顆粒PPI網(wǎng)絡藥理學，選擇degree值較大的靶蛋白Akt、EGFR，從UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)下載，保存其PDB格式文件。選擇異鼠李素、槲皮素、芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷等潛在活性成分，通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載潛在活性成分的2D結構，通過 ChemOffice 2014軟件將其能量最小化，并導出其3D結構。利用分子對接Autodock vina模擬軟件，將經(jīng)過脫水分子和加氫等預處理的靶蛋白存為pdbqt格式，將化合物設置成可旋轉鍵后存為pdbqt格式，最終進行對接模擬計算。如果結合能<0 kcal/mol表明靶蛋白和化合物可自發(fā)結合，結合能≤-5.0 kcal/mol表明靶蛋白和化合物結合活性較好。

2.7 動物實驗驗證

2.7.1 造模及給藥方法 參考文獻[5]報道建立大鼠前列腺增生模型，大鼠按照3.5 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液進行麻醉，隨機選取58只大鼠，無菌條件下切除雙側睪丸；剩余10 只大鼠作為空白組，切開外陰皮膚但不摘除睪丸。所有大鼠恢復1周，造模后第8天，從切除雙側睪丸大鼠中挑選50只恢復狀態(tài)較好的去勢大鼠，隨機分為5組，即模型組、非那雄胺組及復方茴芹顆粒低、中、高劑量組，每組10 只。除空白組外，其余組大鼠皮下注射丙酸睪酮注射液5 mg/kg(以橄欖油為溶媒)；空白組大鼠皮下注射等量橄欖油，每天1次，連續(xù)30 d。自造模開始，復方茴芹顆粒低、中、高劑量組分別灌胃給予2.70、5.40、10.80 g/kg復方茴芹顆粒藥液，非那雄胺組灌胃給予1 mg/kg非那雄胺片，正常組和模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)30 d。

2.7.2 樣本采集 末次給藥結束后，禁食不禁水12 h后稱定體質量并記錄，用10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)腹腔注射進行麻醉，腹主動脈取血，采用ELISA法檢測大鼠血清中睪酮(T)、雙氫睪酮(DHT)水平。摘取完整前列腺組織，生理鹽水清洗后，稱定腺體質量，計算前列腺指數(shù)；取部分前列腹葉組織用10%甲醛固定，HE染色后光鏡下觀察前列腺結構；剩余前列腺組織經(jīng)液氮速凍后移至-80 ℃冰箱保存，備用。

2.7.3 Western blot檢測目的蛋白表達 取大鼠前列腺組織，加裂解液研磨到無肉眼可見組織塊，冰上裂解30 min，BCA法檢測蛋白濃度后加蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸20 min，10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，濕法轉膜，5%牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST清洗3 次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3 次，每次10 min，使用凝膠成像系統(tǒng)顯影并拍照，通過Image J軟件對所得條帶進行灰度分析。

3 結果

3.1 復方茴芹顆粒治療前列腺增生潛在靶點的獲取 通過篩選得到前列腺增生作用靶點3 733 個，復方茴芹顆粒所含羊紅膻、葛根、枸杞子等5味中藥的作用靶點548個，通過R軟件將得到的靶點映射，得到該復方治療前列腺增生的潛在靶點346個，繪制Venn圖，見圖1。

3.2 PPI網(wǎng)絡的構建與分析 將藥物-疾病346個靶點導入STRING平臺得到的PPI 網(wǎng)絡信息，利用R軟件將PPI網(wǎng)絡信息可視化，得到頻次排名前30的靶點見圖2。導入Cytoscape 3.8.2軟件中，運用MCODE插件分析得到Module，并保留其中3個評分最佳的生物學進程，見圖3。同時利用CytoHubba插件中的MCC算法分析藥物-疾病PPI網(wǎng)絡中的每個節(jié)點，篩選排名前10的靶點，見圖4，顏色從紅到黃代表該靶點的重要程度遞減，依次為STAT3、VEGFA、SRC、MAPK3、MAPK1、CASP3、HRAS、MTOR、BCL2L1、EGFR。

3.3 GO富集、KEGG通路分析及疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡通路的構建 通過R軟件進行復方茴芹顆粒-前列腺增生潛在靶點的GO富集和KEGG通路分析。GO富集分析得到346個潛在靶點在208條GO條目上富集。前20條GO富集條目如圖5所示，涉及蛋白激酶反應、類固醇反應、核受體反應等生物學過程。KEGG通路分析得到156條條目，其中包括PI3K-Akt、HIF-1、MAPK、癌癥等信號通路，與前列腺增生相關性最高的前20 條通路如圖6所示。疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡通路如圖7所示。

3.4 復方茴芹顆粒核心成分與前列腺增生關鍵蛋白分子對接驗證 將網(wǎng)絡篩選的degree值較大的2個靶蛋白與藥物活性成分進行分子對接驗證，從PDB數(shù)據(jù)庫獲得所需格式文件，靶點Akt(PDBID：1UNQ)、EGFR(PDBID：5UG9)，所有受體文件脫去水分子和加氫等預處理后，利用Autodock vina模擬軟件進行分子對接，得到分子對接驗證結果，見表1。通過分子對接得到結合能≤-6 kcal/mol的“靶點蛋白-活性分子”12個。部分“靶點蛋白-活性分子”對接模式圖，見圖8。結果表明復方茴芹顆粒中的異鼠李素、山柰酚、槲皮素等潛在成分與關鍵靶點之間有很好的親和力，可通過作用于相關核心靶點治療改善前列腺增生。

表1 分子對接結合能結果

3.5 實驗驗證

3.5.1 復方茴芹顆粒對大鼠前列腺濕質量和前列腺指數(shù)的影響 與空白組比較，模型組大鼠前列腺濕質量及前列腺指數(shù)均升高(P<0.01)，說明前列腺增生模型造模成功；與模型組比較，非那雄胺組及復方茴芹顆粒各劑量組大鼠前列腺濕質量、前列腺指數(shù)均降低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 復方茴芹顆粒對大鼠前列腺濕質量和前列腺指數(shù)的影響

3.5.2 復方茴芹顆粒對大鼠血清性激素T、DHT水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清T、DHT水平均升高(P<0.01)，說明在去勢條件下，通過皮下注射丙酸睪酮注射液，使大鼠前列腺組織在外源性雄激素的作用下出現(xiàn)增生，表明大鼠前列腺增生模型成功；與模型組比較，非那雄胺組及復方茴芹顆粒各劑量組大鼠血清T、DHT水平均降低(P<0.05，P<0.01)，表明復方茴芹顆粒能抑制前列腺增生的發(fā)生，見表3。

表3 復方茴芹顆粒對大鼠血清性激素水平的影響

3.5.3 復方茴芹顆粒對大鼠前列腺組織形態(tài)的影響 空白組大鼠前列腺上皮、腺腔及間質均正常；模型組大鼠前列腺上皮明顯增生，呈乳頭狀突向腔內，腺體增多，腺腔明顯變形，結締組織明顯增生；復方茴芹顆粒低劑量組腺體較模型組少，乳頭狀結構減少；復方茴芹顆粒中劑量組腺腔變大，腺體數(shù)少，小部分呈乳頭狀突向腔內；復方茴芹顆粒高劑量組前列腺上皮、腺腔、間質基本恢復正常，極少部分呈乳頭狀突入腔內，形態(tài)學表現(xiàn)與非那雄胺組接近；非那雄胺組腺腔明顯減少，偶有上皮細胞增生所致的乳頭狀皺褶突入腺腔，見圖9。

3.5.4 復方茴芹顆粒對大鼠前列腺組織關鍵蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠前列腺組織PI3K、Akt、Bcl-2、VEGFA、EGFR、ERK1/2蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，非那雄胺組及復方茴芹顆粒各劑量組PI3K、Akt、Bcl-2、VEGFA、EGFR、ERK1/2蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)，見表4、圖10。

表4 復方茴芹顆粒對大鼠前列腺組織關鍵蛋白表達的影響

4 討論

前列腺增生是中老年男性常見病、多發(fā)病，隨著老年化進程的加快，其發(fā)病率逐年升高[6]，但其發(fā)病機制尚不明確。中藥復方是我國中醫(yī)整體觀、辨證論治在用藥上的體現(xiàn)，具有多成分、多靶點、多途徑、作用機制復雜的特點[7]。網(wǎng)絡藥理學利用節(jié)點和連接，從整體角度揭示了中藥復方“藥物-基因-靶點-疾病”之間復雜的生物網(wǎng)絡關系，以此預測藥物可能的作用機制，科學地解釋中藥復方的藥理機制及配伍關系[8]。本研究通過對復方茴芹顆粒5味藥材分析得到槲皮素、異鼠李素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷等藥物活性成分。槲皮素、異鼠李素均為黃酮類化合物，可延緩或抑制前列腺增生發(fā)展進程。施建豐等[9]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素通過調節(jié)p-STAT改變BMDM的極性從而調節(jié)炎癥介質的表達。

經(jīng)篩選得到與復方茴芹顆粒活性成分有較高結合活性的核心基因，在抑制前列腺增生中發(fā)揮主要作用，包括Akt、VEGFA、MAPK3、SRC、EGFR等。VEGFA是具有高度血管內皮細胞特異性的有絲分裂原，可促進內皮細胞增殖，增強血管通透性，促使新生血管的生成[10-11]。有研究表明，前列腺增生患者體內VEGF水平升高，但機制尚不明確[12]。MAPK是一種重要的蛋白激酶，在細胞生長、分化、凋亡過程中具有重要的調節(jié)作用[13]，ERK是其亞型之一，主要參與促進有絲分裂。EGFR與表皮生長因子和轉化生長因子等配體結合后，形成二聚體與ATP結合而自身磷酸化，激活下游信號通路，調節(jié)前列腺細胞的增殖、凋亡以及血管生成[14]。

分析發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt、HIF-1、MAPK等信號通路可能是復方茴芹顆粒治療前列腺增生的主要途徑。Bcl-2能夠抑制細胞的凋亡，在前列腺增生患者中高表達[15-16]。有研究表明，阻斷PI3K-Akt信號通路可以抑制前列腺增生[17]，PTEN抑癌基因可使PIP3去磷酸化而減弱來自PI3K的激活信號，間接抑制Akt的功能[18]，Akt蛋白表達降低，使其底物Bad蛋白磷酸化水平降低，Bad與Bcl-2形成復合體，使Bcl-2蛋白表達降低而表現(xiàn)促前列腺細胞凋亡的活性，抑制前列腺增生。研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導因子-1α(HIF-1α)在前列腺增生患者中高表達，可抑制前列腺增生[19-20]，未活化的Akt能降低HIF-1α及其轉錄靶基因VEGF的表達。VEGF介導的血管生成作用可能是SRC依賴[21]，抑制EGFR酪氨酸磷酸化，從而抑制MAPK級聯(lián)反應[22]，使前列腺增生基質細胞ERK表達降低，抑制前列腺上皮細胞增長。

研究還將復方茴芹顆粒有效核心成分與關鍵靶基因進行了分子對接驗證，證明了配體與受體均具有良好的親和力。對PI3K-Akt、MAPK等信號通路的關鍵靶點進行Western blot驗證，結果顯示復方茴芹顆粒通過下調PI3K-Akt、MAPK等信號通路，抑制前列腺增生的發(fā)生發(fā)展。本研究為復方茴芹顆粒的臨床應用提供了理論基礎，但其具體的作用機制還需進一步實驗研究。