王棗子葉總黃酮的降糖活性研究

曹穩(wěn)根， 史曄瑤， 王 晴， 張 穎， 段 紅， 翟科峰

(宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000)

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝紊亂疾病，現(xiàn)已成為繼心腦血管疾病、癌癥之后嚴(yán)重危害人類健康的第三大疾病，其中2型糖尿病約占糖尿病總數(shù)的90%。糖尿病危害極大，目前仍缺乏安全性和依從性高且長效的治療方法。研究表明，從中草藥中提取的有效成分對調(diào)節(jié)血糖和防治糖尿病及其并發(fā)癥都有特殊的療效，日益受到國內(nèi)外學(xué)者高度關(guān)注[1-3]。黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物次生代謝產(chǎn)物中的生物活性小分子化合物，在自然界中存在形式多樣，大量研究證實(shí)，黃酮類化合物具有降糖等多種藥理作用[4-14]。

王棗子Isodonamethystoides(Benth) Cy Wu et Hsuan為唇形科香茶菜屬多年生草本植物，全草皆可入藥，為皖北地區(qū)的道地藥材，2014年9月“宿州王棗子” 獲國家工商總局商標(biāo)局核準(zhǔn)注冊中藥材地理標(biāo)志商標(biāo)[15]。研究表明，王棗子葉含有豐富的黃酮類物質(zhì)[16-18]，但有關(guān)王棗子葉總黃酮的降糖活性研究未見報道。在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，本研究通過α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)探討王棗子葉總黃酮體外降糖活性。采用四氧嘧啶糖尿病小鼠模型，經(jīng)王棗子葉總黃酮不同劑量組連續(xù)灌胃4 周，檢測不同時間段小鼠空腹血糖、口服糖耐量以及血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平的變化，探討其體內(nèi)降糖活性，以期為道地藥材王棗子總黃酮有效成分的開發(fā)與利用提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 王棗子葉(宿州綠源中醫(yī)藥科技有限公司)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周建理教授鑒定為正品。蘆丁對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號Y01D8S49613)；α-葡萄糖苷酶、對硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(美國Sigma公司，批號L25 M9Y62118、E1828029)；四氧嘧啶[阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號H1808033]；阿卡波糖(杭州中美華東制藥有限公司，批號1809224)；鹽酸二甲雙胍片(上海上藥信誼藥廠有限公司，批號48181223)；DS-3樂生邦德血糖試紙(上海盛邦生物科技有限公司，批號KSB1726A2)；TC、TG、HDL-C試劑盒(南京建成生物工程研究所)。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 DS-3型樂生邦德血糖測試儀(上海盛邦生物科技有限公司)；Multiskan GO型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；ST3100型實(shí)驗(yàn)室PH計[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；723型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；JY96-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；HK-04A200 g型手提式粉碎機(jī)(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)；R-1001LN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

2 方法

2.1 王棗子葉總黃酮制備與純化 將新鮮王棗子葉去雜質(zhì)后置于55 ℃烘箱中干燥2 h，粉碎過80目篩備用，通過纖維素酶-超聲提取方法得到王棗子葉總黃酮粗提液，得率為13.92%[18]，再經(jīng)過AB-8大孔樹脂純化[19]得王棗子葉總黃酮純化液，備用。

2.2 王棗子葉總黃酮體外抑制α-葡萄糖苷酶活性的檢測 參考文獻(xiàn)[10]報道方法進(jìn)行檢測，以阿卡波糖為陽性對照，王棗子葉總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制率計算公式為抑制率=[1-(A-B)/(C-D)]×100%，A為樣品組(酶液+樣品)測得的吸光度值；B為樣品空白組(磷酸鹽緩沖液+樣品)測得的吸光度值；C為陰性對照組(酶液+溶劑)測得的吸光度值；D為空白組(磷酸鹽緩沖液+溶劑)測得的吸光度值。

2.3 王棗子葉總黃酮對四氧嘧啶型糖尿病小鼠降糖活性的檢測

2.3.1 糖尿病小鼠模型的建立 選取健康雄性ICR小鼠90只，體質(zhì)量 (25±2) g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，取10只小鼠作為正常組，其余80只小鼠禁食24 h(自由飲水)后，腹腔一次性注射2%四氧嘧啶生理鹽水(150 mg/kg)進(jìn)行造模。5 d后，小鼠禁食4 h，尾靜脈取血測量空腹血糖，血糖值>11 mmol/L判定為造模成功。

2.3.2 分組及給藥 選取造模成功的ICR小鼠50只，隨機(jī)分成5組，即模型組，陽性對照組(100 mg/kg二甲雙胍)，王棗子葉總黃酮低、中、高劑量組(100、150、200 mg/kg)，給藥組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，模型組和正常組灌胃給予等量生理鹽水，每天定時給藥3次，每次0.2 mL，連續(xù)4周。

2.3.3 血糖檢測 分別在0、7、14、21、28 d，空腹尾靜脈采血，用血糖儀測量每組小鼠血糖值。

2.3.4 口服糖耐量檢測 參考文獻(xiàn)[2]報道方法進(jìn)行檢測。于第28天將小鼠禁食12 h，檢測其血糖(0 min)，然后灌胃2.0 g/kg葡萄糖溶液，分別在30、60、90、120 min檢測小鼠血糖。

2.3.5 血清TC、TG、HDL-C水平檢測 28 d后，小鼠摘眼球采血，分離取血清備用，按試劑盒說明書檢測TC、TG、HDL-C水平。

3 結(jié)果

3.1 王棗子葉總黃酮體外對α-葡萄糖苷酶活性的影響 如圖1所示，在質(zhì)量濃度0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，王棗子葉總黃酮對α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制活性，且呈量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時，王棗子葉總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到73.3%，略低于阿卡波糖，是良好的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

3.2 王棗子葉總黃酮對小鼠血糖的影響 如圖2所示，給藥0 d，與正常組比較，模型組及各給藥組血糖值升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組以及王棗子葉總黃酮各劑量組小鼠14、21、28 d血糖均降低(P<0.05，P<0.01)，其中王棗子葉總黃酮低劑量組降糖效果較好。

3.3 王棗子葉總黃酮對小鼠糖耐量的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組及各給藥組小鼠血糖值在灌胃葡萄糖30 min后達(dá)到高峰，之后開始下降，但在120 min內(nèi)仍處于較高水平(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組以及王棗子葉總黃酮各劑量組不同時間段的血糖值均降低(P<0.05)，表明王棗子葉總黃酮能控制小鼠血糖水平的升高，改善糖耐量異常，其中低劑量組效果較好。

3.4 王棗子葉總黃酮對小鼠脂代謝的影響 如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠血清TC、TG水平升高(P<0.01)，HDL-C水平降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組以及王棗子葉總黃酮各劑量組小鼠血清TC、TG水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)，表明王棗子葉總黃酮能有效地改善糖尿病小鼠脂代謝紊亂，其中低劑量組效果較好。

4 討論

α-葡萄糖苷酶抑制劑(阿卡波糖、伏格列波糖等)是一類新型的口服降血糖藥物，可有效抑制小腸體內(nèi)的α-葡萄糖苷酶活性，目前已廣泛應(yīng)用于2型糖尿病及并發(fā)癥的防治。α-葡萄糖苷酶能夠水解低聚糖α-1,4糖苷鍵，生成可以直接被人體吸收的葡萄糖。通過抑制α-葡萄糖苷酶活性可使單糖消化吸收過程受阻，緩解餐后血糖升高的癥狀[10,20]。2型糖尿病的顯著特征之一是血糖水平升高，控制血糖升高是減少和減輕糖尿病及其并發(fā)癥的重要方法。研究證實(shí)，糖耐量異常是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中常見的現(xiàn)象，糖耐量實(shí)驗(yàn)是機(jī)體血糖調(diào)節(jié)機(jī)能的一種檢查方法。脂代謝異常是2型糖尿病及其并發(fā)癥的原發(fā)性病理、生理過程，患者通常伴有脂代謝異常，且能進(jìn)一步演變成嚴(yán)重的心血管疾病[2]。

本研究通過α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)及四氧嘧啶糖尿病小鼠模型，探討王棗子葉總黃酮體內(nèi)外降糖活性。研究表明，王棗子葉總黃酮對α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制活性，且呈量效關(guān)系；王棗子葉總黃酮各劑量組均能降低糖尿病小鼠血糖和血清TC、TG水平，升高HDL-C水平，改善葡萄糖糖耐量的異常及糖尿病引起脂代謝紊亂情況，其中低劑量組效果最好，接近二甲雙胍陽性對照組。但有關(guān)王棗子葉總黃酮的降糖機(jī)理還需進(jìn)一步探討。