澤瀉三萜對小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用

黃小強(qiáng)， 李宣宣， 吳水生， 劉順和， 賈 安， 許 文*， 黃 濤*

(1.黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450063；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；3.鄭州市第二人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

急性肺損傷是由心肺功能衰竭、氧化應(yīng)激和急性炎癥性疾病引起的感染性低氧所致的危及生命的臨床綜合征[1-2]，其特征包括毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞受損和肺間質(zhì)、肺血管及肺泡內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量的增加、聚集。急性肺損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病率和死亡率一直居高不下[3]。近年來，急性肺損傷的治療以通氣或非通氣為主，但是這2種策略療效并不理想，因此，研制有效治療急性肺損傷的新藥具有重要意義。

澤瀉是一種常用的中藥材，為澤瀉科植物東方澤瀉Alismaorientale(Sam.)Juzep.或澤瀉Alismaplantago-aquaticaLinn.的干燥塊莖，其味甘、淡，性寒，具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂功效，澤瀉三萜是其主要活性成分[4-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，澤瀉三萜具有廣泛的藥理作用，如抗炎[6]、抗氧化[7]等。課題組前期通過體內(nèi)實驗證實澤瀉三萜對急性肺損傷具有一定的保護(hù)作用[8]，本研究在此基礎(chǔ)上，通過脂多糖(LPS)誘導(dǎo)建立小鼠急性肺損傷模型，探討澤瀉三萜對急性肺損傷的保護(hù)作用與其抗氧化、抗炎的相關(guān)性，并初步闡明其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器 多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；光學(xué)顯微鏡、石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；高速低溫離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；多用途中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；萬分之一電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試劑與藥物 澤瀉采收于福建省建甌縣，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳水生教授鑒定為澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉Alismaorientale(Sam.)Juzep.的干燥塊莖。脂多糖(LPS，批號S11060)購自上海源葉生物科技有限公司；醋酸地塞米松片(Dex，批號1904091)購自鄭州遂成藥業(yè)股份有限公司；小鼠腫瘤壞死因子-ɑ(TNF-α，批號2005016)、小鼠白介素-1β(IL-1β，批號2008012)酶聯(lián)免疫吸附劑檢測試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司；丙二醛(MDA，批號190716)、總超氧化物歧化酶(SOD，批號190419)、還原型谷胱甘肽(GSH，批號190814)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，批號190724)、髓過氧化物酶(MPO，批號20200915)測試盒均購自南京建成生物工程研究所；兔抗轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2，批號sc-722，1 000 μL/支)、兔抗血紅素氧合酶1(HO-1，批號sc-1796，1 000 μL/支)、兔抗過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ，批號sc-7273，1 000 μL/支)抗體均購自美國Santa Cruz公司；β-actin抗體(批號AA128，100 μL/支)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為分析純。

1.3 動物 SPF級昆明小鼠50只，體質(zhì)量18～20 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2018-0006，實驗動物使用許可證號SYXK(閩)2014-0005。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，溫度21～23 ℃，相對濕度55%～75%，12 h/12 h明暗交替。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，開始正式實驗。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 澤瀉三萜提取物溶液 參考文獻(xiàn)[9]報道，將澤瀉粉碎后過24目篩，80%乙醇煎煮2次，每次1 h，合并2次濾液并濃縮，采用HP20大孔樹脂柱純化，濃縮洗脫液得油狀浸膏，即為澤瀉三萜，得率為0.72%，共檢測出14種成分，其總含量為885.9 mg/g[10-11]，在-20 ℃下保存?zhèn)溆?。精密稱取適量至研缽中，加入適量0.5% CMC-Na溶液充分研磨，得到0.01、0.002 5 g/mL混懸液，灌胃前進(jìn)行充分混勻。

2.1.2 醋酸地塞米松溶液 取數(shù)片醋酸地塞米松片，研成粉末，加入生理鹽水制成質(zhì)量濃度為0.000 5 g/mL的溶液，即得。

2.1.3 脂多糖溶液 精密稱取2 mg LPS粉末，置于10 mL棕色量瓶中，加適量生理鹽水完全溶解后定容至10 mL，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的溶液，在4 ℃下密封(不宜長時間保存)。

2.2 分組、造模與給藥 將小鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，醋酸地塞米松組(5 mg/kg)，澤瀉三萜低、高劑量組(25、100 mg/kg)，每組10只。各給藥組小鼠灌胃給予相應(yīng)劑量藥物(10 mL/kg)，正常組和模型組小鼠灌胃給予等量0.5% CMC-Na溶液，每天1次，連續(xù)14 d。末次給藥后2 h，造模組小鼠采用鼻腔滴注法，緩慢滴注50 μL含10 μg LPS的生理鹽水，正常組小鼠同法給予相同體積生理鹽水[12]，造模12 h后，小鼠眼眶取血，脫臼處死，迅速取出肺組織，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 肺組織濕/干質(zhì)量比計算 切取小鼠右肺上葉，剔除結(jié)締組織，濾紙吸干表面水分和血液，稱定質(zhì)量，作為肺組織濕質(zhì)量，隨后置于恒溫箱中，在80 ℃下連續(xù)干燥48 h以上后取出，稱定質(zhì)量，作為肺組織干質(zhì)量，計算肺組織濕/干質(zhì)量比[13]。

2.4 試劑盒檢測小鼠肺組織MPO、GSH-Px、SOD活性及MDA、GSH水平 剪取適量小鼠肺組織，置于預(yù)冷的玻璃研磨器中，加入預(yù)冷生理鹽水，并在冰水浴中研磨，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，吸取上清液，分別制成5%、10%肺組織勻漿液，按照試劑盒說明書檢測肺組織MPO、GSH-Px、SOD活性及MDA、GSH水平。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法小鼠血清 TNF-α、IL-1β水平 小鼠血液于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，分離取血清，按照試劑盒說明書檢測血清TNF-α、IL-1β水平。

2.6 小鼠肺組織病理學(xué)檢查 切取小鼠右肺組織下葉，4%多聚甲醛溶液固定24 h，蒸餾水沖洗至無多聚甲醛味，常規(guī)梯度乙醇脫水，包埋成蠟塊，切片(5 μm)，在65 ℃下烘干2 h，梯度乙醇洗脫，二甲苯脫蠟，蘇木素-伊紅染色，封片，晾干，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，根據(jù)肺泡壁厚度、肺組織破壞、炎癥細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行評分[14]，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 急性肺損傷評分標(biāo)準(zhǔn)

2.7 Western blot法檢測小鼠肺組織Nrf2、HO-1、PPARγ蛋白表達(dá) 取超低溫保存的剩余小鼠肺組織，采用液氮研磨法，按照1∶10比例加入RIPA裂解液和PMSF混合溶液(100∶1)，冰上勻漿后靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，分離取上清，采用BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度，通過加熱變性制備蛋白樣品，配制SDS-PAGE凝膠，蛋白樣品上樣，電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST緩沖液洗膜3次，加一抗(1∶1 000)于4 ℃下孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，加入二抗(1∶5 000)室溫孵育，TBST緩沖液洗膜3次，ECL發(fā)光液顯影、曝光，通過Image Lab軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析。

3 結(jié)果

3.1 澤瀉三萜對小鼠肺組織濕/干質(zhì)量比的影響 與正常組比較，模型組小鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值升高(P<0.01)；與模型組比較，醋酸地塞米松組和澤瀉三萜高劑量組小鼠肺組織濕/干質(zhì)量比值降低(P<0.01)，見圖1。

3.2 澤瀉三萜對小鼠肺組織MPO、GSH-Px、SOD活性及MDA、GSH水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠肺組織MPO活性、MDA水平升高(P<0.01)，GSH水平及GSH-Px、SOD活性降低(P<0.01)；與模型組比較，醋酸地塞米松組和澤瀉三萜高劑量組小鼠肺組織MPO活性、MDA水平降低(P<0.01)，GSH水平及GSH-Px、SOD活性升高(P<0.05，P<0.01)，澤瀉三萜低劑量組小鼠肺組織MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，見圖2。

3.3 澤瀉三萜對小鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，醋酸地塞米松組和澤瀉三萜高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平均降低(P<0.01)，澤瀉三萜低劑量組小鼠血清IL-1β水平降低(P<0.05)，見圖3。

3.4 澤瀉三萜對小鼠肺組織病理形態(tài)變化及肺損傷評分的影響 正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清楚、無滲出液，沒有出現(xiàn)水腫及炎細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象；與正常組比較，模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔增厚，出現(xiàn)明顯的炎性浸潤和間質(zhì)水腫等病理現(xiàn)象，肺損傷評分升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組小鼠肺組織損傷均有不同程度的緩解，以醋酸地塞米松組、澤瀉三萜高劑量組更明顯，表現(xiàn)為肺組織充血水腫減輕，出血減少，肺泡壁增厚程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤有一定程度減輕，肺損傷評分降低(P<0.01)，見圖4～5。

3.5 澤瀉三萜對小鼠肺組織Nrf2、HO-1、PPARγ蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠肺組織Nrf2、HO-1、PPARγ蛋白表達(dá)均降低(P<0.05,P<0.01)；與模型組比較，醋酸地塞米松組和澤瀉三萜高劑量組小鼠肺組織Nrf2、HO-1、PPARγ蛋白表達(dá)均升高(P<0.05，P<0.01)，澤瀉三萜低劑量組小鼠肺組織Nrf2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見圖6。

4 討論

脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外壁的主要化學(xué)成分之一[15]，進(jìn)入體內(nèi)后能夠引起肺泡上皮細(xì)胞受損、肺部結(jié)構(gòu)和生理功能的改變，感染小鼠后能夠建立急性肺損傷動物模型[16]。急性肺損傷的主要病理學(xué)特征為肺泡水腫、通透性增加、肺組織微循環(huán)發(fā)生障礙，其中肺泡水腫程度的大小也能夠反映肺損傷的嚴(yán)重程度[17]。肺組織濕/干質(zhì)量比值能客觀反映毛細(xì)血管通透性的相對程度，同時也是反映肺水腫的重要指標(biāo)[17-18]。當(dāng)LPS刺激機(jī)體后，能夠激活體內(nèi)巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量炎癥因子，例如TNF-α、IL-1β等[19]，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)聚集，從而導(dǎo)致一系列肺組織損傷，如血管充血、肺水腫、肺泡萎縮等。本研究結(jié)果顯示，澤瀉三萜對肺組織濕/干質(zhì)量比值、MPO活性及TNF-α、IL-1β水平均有調(diào)節(jié)作用，提示，澤瀉三萜可通過抑制肺組織水腫，TNF-α、IL-1β分泌及MPO活性緩解LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷作用。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是肺損傷的另一個重要原因，它不僅能直接誘導(dǎo)組織損傷，還能調(diào)節(jié)參與肺炎癥反應(yīng)的通路，肺損傷患者和動物模型均出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，MDA水平升高[20]。機(jī)體在氧化應(yīng)激過程中會產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，能夠?qū)Ψ螌嵸|(zhì)細(xì)胞造成一定程度的氧化損傷[21]。研究報道，在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展全過程均有氧化應(yīng)激反應(yīng)伴隨[22]。ROS產(chǎn)生過多，可抑制氧自由基清除劑SOD活性及GSH水平，使脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA水平升高，損傷肺組織造成急性肺損傷的發(fā)生[23]。

文獻(xiàn)研究報道，澤瀉三萜具有抗氧化作用[24]，但其是否對LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生急性肺損傷引起的肺組織局部氧化應(yīng)激反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用，目前尚未報道。本研究結(jié)果顯示，澤瀉三萜能夠降低小鼠肺組織MDA水平，同時升高SOD、GSH-Px活性及GSH水平，提示，澤瀉三萜對急性肺損傷小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)具有一定調(diào)節(jié)作用。

Nrf2在調(diào)節(jié)MDA、SOD、GSH、GSH-Px過程中起著非常重要的作用[25-26]。正常情況下，Nrf2與Keap1相結(jié)合，處于非活性、易降解的狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受相關(guān)信號刺激時Keap1構(gòu)象會發(fā)生改變或Nrf2直接被磷酸化，從而導(dǎo)致兩者解離，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，并與ARE結(jié)合，激活A(yù)RE下游的抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)，從而發(fā)揮抵抗體內(nèi)外界的刺激[25,27]。HO-1是機(jī)體調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要因子，通過上調(diào)HO-1的表達(dá)，可以調(diào)節(jié)MDA、SOD、GSH和GSH-Px等表達(dá)，從調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激引起的損傷[28]。增加Nrf2表達(dá)可降低機(jī)體抗氧化應(yīng)激表達(dá)，從而對細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[29]。本實驗結(jié)果顯示，澤瀉三萜能夠上調(diào)小鼠肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)，提示，澤瀉三萜對急性肺損傷的保護(hù)作用與Nrf2/HO-1信號通路激活有關(guān)。

PPARγ具有促進(jìn)自噬的作用[30]，激活PPARγ通路能夠抑制炎癥因子的分泌[31-32]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，澤瀉三萜能夠上調(diào)急性肺損傷小鼠肺組織PPARγ蛋白表達(dá)，提示，澤瀉三萜能夠通過激活PPARγ表達(dá)抑制炎癥因子的分泌，從而起到保護(hù)急性肺損傷的作用。

綜述所述，澤瀉三萜對急性肺損傷小鼠有保護(hù)作用，一方面通過激活Nrf2/HO-1信號通路及調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激，從而減輕肺組織氧化損傷；另一方面，通過上調(diào)PPARγ蛋白表達(dá)抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β產(chǎn)生，抑制炎癥反應(yīng)。